竺利紅， 李孝輝， 施躍峰

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatus)俗稱田雞、青蛙，屬蛙科側(cè)褶蛙屬的兩棲動(dòng)物，因其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，是有名的美味佳肴，人類對(duì)其需求量十分巨大。黑斑蛙人工養(yǎng)殖試驗(yàn)開始于2011年，2014年可攝食靜態(tài)餌料黑斑蛙新品種育成，其養(yǎng)殖可實(shí)現(xiàn)全程投喂人工飼料，使產(chǎn)量迅速提高，養(yǎng)殖周期為5個(gè)月，每667 m2產(chǎn)量1 500～2 500 kg，每667 m2凈利潤可達(dá)1.5萬～5.4萬元，市場(chǎng)前景十分廣闊。短短幾年，養(yǎng)殖區(qū)域從最初的湖南省擴(kuò)張至湖北、四川、江西、安徽、浙江、廣東、江蘇、重慶等地區(qū)。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，黑斑蛙病害頻繁發(fā)生[1-3]。2018年全國養(yǎng)殖黑斑蛙發(fā)病率達(dá)80%以上，死亡率達(dá)50%以上，一些嚴(yán)重的養(yǎng)殖池全軍覆沒，不少養(yǎng)殖戶選擇退出。病害問題已成為制約黑斑蛙產(chǎn)業(yè)化進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸，而對(duì)其相關(guān)疾病的研究少見報(bào)道[1]。寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)是1993年分離出來的一個(gè)新屬，屬于黃單胞菌綱(Xanthomonadaceae)黃單胞菌目(Xanthomonadales)，目前該屬有16個(gè)不同的種[4]。本研究從人工養(yǎng)殖患病黑斑蛙中進(jìn)行了病原菌的分離鑒定、生物學(xué)特性研究和防治藥劑篩選，旨在為從病原學(xué)角度證實(shí)蛙源寡養(yǎng)單胞菌的臨床感染，并為其防治提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

患病黑斑蛙于2020年6月15日從浙江某黑斑蛙養(yǎng)殖場(chǎng)采集，每只體重100～150 g。主要癥狀為行動(dòng)遲緩、身體發(fā)軟、歪頭，解剖發(fā)現(xiàn)部分病蛙有腹水。取10只具有典型癥狀的病蛙或?yàn)l死蛙進(jìn)行病原菌分離實(shí)驗(yàn)。

諾氟沙星、多黏菌素B、萬古霉素等38種抗菌藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；dNTPs(2.5 mmol·L-1)、EasyTaq酶(5 U·μL-1)、10×Easy Taq Buffer(1.2 mL)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；5%脫纖綿羊血培養(yǎng)基購自成都萬科生物技術(shù)有限公司。聚維酮碘購自山西華坤生物科技有限公司，有效成分10%；硫酸銅、高錳酸鉀購自湖北康盛醫(yī)藥科技有限公司，分析純，有效成分99%；次氯酸購自日本株式會(huì)社；超氧水由杭州藍(lán)海科技有限公司提供。按5種滅菌劑使用說明上的有效濃度用雙蒸水配制母液，試驗(yàn)時(shí)由母液稀釋成工作液。

1.2 病原菌的分離

在無菌條件下取病蛙腦組織、心臟、眼、腎臟、脾臟、肝臟、肺、腹水，劃線接種在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。從腦組織、肝臟、肺、眼、腹水中挑取到形態(tài)一致的黃色菌落，重復(fù)劃線分離純化數(shù)次，獲得12株細(xì)菌。鑒于這12株分離菌菌落、菌體形態(tài)均相似，且16S rRNA分子鑒定為同一菌種，后續(xù)研究取1號(hào)黑斑蛙腹水中的分離株Y-13進(jìn)行。

1.3 人工感染試驗(yàn)

用接種環(huán)從菌株Y-13斜面蘸取少量菌苔到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h，離心收集菌體并重懸于生理鹽水中，采用梯度稀釋法測(cè)定菌液濃度并逐級(jí)稀釋制備菌懸液。實(shí)驗(yàn)組分別以5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105和5.0×104mL-1菌懸液濃度按照每只0.1 mL背部注射，每組各30只。對(duì)照組注射等量無菌生理鹽水。每天觀察其癥狀并記錄死亡數(shù)，連續(xù)觀察10 d。對(duì)瀕死黑斑蛙解剖，進(jìn)行病原菌再分離。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 16S rRNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

蘸取一環(huán)被檢菌斜面，接種于20 mL LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，200 r·min-137 ℃培養(yǎng)過夜。收集培養(yǎng)后的菌液，采用上海生工的Ezup柱式基因組DNA提取試劑盒提取Y-13基因組DNA，以16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其上、下游引物的序列分別為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′。擴(kuò)增體系采用25 μL的反應(yīng)體系，其擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后交由上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與GenBank中相關(guān)核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。選取同源性較高的序列，用MEGA 6.0軟件的Neighbor-Jioning方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4.2 培養(yǎng)與形態(tài)特性檢測(cè)

進(jìn)行菌株的生長溫度、氧和二氧化碳需要等培養(yǎng)特性的測(cè)定。接種LB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌的生長狀況和菌落的大小、形態(tài)等，并革蘭氏和磷鎢酸染色后分別在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。接種于5%脫纖綿羊血培養(yǎng)基中，觀察其溶血形態(tài)。

1.4.3 生理生化特性檢測(cè)

各項(xiàng)生化指標(biāo)的測(cè)定參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

1.5 病原菌藥敏性研究

按K-B紙片擴(kuò)散法將Y-13菌液涂布于LB瓊脂平板上，間隔一定距離貼上藥敏試紙，于37 ℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果判斷依據(jù)《紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)》(第4版)進(jìn)行。

1.6 滅菌劑MIC的測(cè)定

采用二倍稀釋法測(cè)定滅菌劑對(duì)菌株Y-13的最小抑菌濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，將各種滅菌劑依次稀釋到合適濃度，即高錳酸鉀：2 000、1 000、500、250、125、62.5 mg·L-1；硫酸銅：2 000、1 000、500、250 mg·L-1；聚維酮碘：1 000、500、250、125、62.5 mg·L-1；次氯酸：100、50、25、12.5、6.25、3.13 mg·L-1；超氧化水：100、50、25、12.5、6.25、3.13 mg·L-1。分別取濃度為107mL-1的Y-13菌液0.5 mL加入到裝有4.5 mL滅菌劑的試管中，充分混勻靜置10 min后，吸取200 μL涂布LB瓊脂平板，37 ℃下培養(yǎng)48 h后觀察有無菌落生長，無菌落生長的最小滅菌劑濃度即為MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果表明，菌株Y-13的16S rRNA基因長1 410 bp，將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的DNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，與其相似度高的菌株均屬于寡養(yǎng)單胞菌屬。選取相應(yīng)的模式菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖1)顯示，Y-13與Stenotrophomonasterraestrain DSM 18941、Stenotrophomonashumistrain DSM 18929、Stenotrophomonasnitritireducensstrain DSM 12575聚在一起。因此,將菌株Y-13鑒定為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)。

2.2 菌株的表型及生理生化鑒定

該菌株在LB平板上菌落呈圓形、光滑、濕潤、黃色。菌體呈桿狀，直徑約為0.7 mm，極生鞭毛(圖2)。該菌株與寡養(yǎng)單胞菌屬同一分支下的其他菌株(Stenotrophomonasterraestrain、Stenotrophomonashumi、Stenotrophomonasnitritireducens)相同，均表現(xiàn)為革蘭氏陰性，無芽孢，5-酮-葡萄糖苷陰性，但是又有一定的區(qū)別[5]。Y-13可在40 ℃生長，溶血性，檸檬酸鹽、明膠液化、脂酶等陰性，D-葡萄糖同化陽性(表1)。根據(jù)細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化分析及其典型的形態(tài)和生理生化特征，菌株Y-13屬于寡養(yǎng)單胞菌屬，鑒于其獨(dú)特的生理生化特征，推斷菌株Y-13可能是寡養(yǎng)單胞菌屬的一個(gè)新種。

圖1 菌株Y-13 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 菌株Y-13電鏡觀察

表1 菌株Y-13與相近寡養(yǎng)單胞菌屬菌株的不同表型、生理生化特征

2.3 人工感染

將不同濃度的Y-13菌液背部注射到健康黑斑蛙體內(nèi)，3 d后注射菌液濃度為5×108mL-1的黑斑蛙開始出現(xiàn)死亡，10 d后死亡率達(dá)到100%(表2)。被感染黑斑蛙起初表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、食欲減退，后期出現(xiàn)四肢紅腫現(xiàn)象。有的病蛙肛門外翻出一段紅色腸管，即有脫肛現(xiàn)象。剖檢可見腸管及腸黏膜充血，嚴(yán)重者有出血現(xiàn)象(圖3)，而對(duì)照組未表現(xiàn)出任何不良癥狀。采用改良的寇氏法計(jì)算菌株的LD50，菌株Y-13對(duì)黑斑蛙的LD50為7.3×106mL-1。從人工感染瀕死黑斑蛙的腦脊液、眼、肝臟中均分離到大量形態(tài)、生理生化及分子特征與菌株Y-13一致的菌落，因此，認(rèn)為菌株Y-13是黑斑蛙的一種病原菌。

表2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

圖3 人工感染發(fā)病黑斑蛙的臨床病癥

2.4 藥物敏感性

從表3可以看出，在供試的38種抗生素中，菌株Y-13僅對(duì)阿莫西林、美洛西林、亞胺培南、妥布霉素、恩諾沙星、吉他霉素等11種抗生素敏感，對(duì)β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)脂類、硝基呋喃類和多肽類抗生素均有極強(qiáng)的耐藥性，耐藥率達(dá)70%以上。

表3 菌株Y-13藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 滅菌劑MIC的測(cè)定

幾種滅菌劑對(duì)菌株Y-13的抑菌效果見表4，可以看出超氧水和次氯酸的MIC最低，為12.5 mg·L-1，其次為高錳酸鉀和聚維酮碘(MIC=250 mg·L-1)，效果較差的是硫酸銅(MIC=1 000 mg·L-1)。

表4 幾種滅菌劑對(duì)菌株Y-13的殺滅效果

3 討論

自2014年可攝食靜態(tài)餌料的黑斑蛙新品種育成以來，短短幾年時(shí)間，黑斑蛙養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，2019年全國養(yǎng)殖面積達(dá)9 000 hm2，產(chǎn)量約10.5萬t，產(chǎn)值超23.1億元。為規(guī)范管理，2020年國家正式出臺(tái)文件將黑斑蛙的人工養(yǎng)殖由漁業(yè)主管部門進(jìn)行管理。預(yù)計(jì)未來5年內(nèi)，其市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到30萬t級(jí)別。而制約黑斑蛙產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的最大瓶頸是病害問題，目前已明確的黑斑蛙病原細(xì)菌主要有米爾伊麗莎白菌(Elizabethkingiamiricola)[6]、腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)[7]、氣單胞菌(Aeromonassp.)[3]、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[1]等。本研究從人工養(yǎng)殖患病黑斑蛙中分離到1株編號(hào)為Y-13的病原菌，經(jīng)鑒定歸類于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)，結(jié)合菌株的表型及生理生化鑒定結(jié)果，Y-13可能是寡養(yǎng)單胞菌屬的一個(gè)新種。

目前報(bào)道的寡養(yǎng)單胞菌屬中，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)是唯一一類被報(bào)道的人畜共患致病菌，感染后能引起膿腫、腸炎和敗血癥等[8-13]。菌株Y-13在血瓊脂平板上出現(xiàn)溶血環(huán)。溶血素是細(xì)菌重要的致病因子，可引起細(xì)胞內(nèi)容物外泄從而造成細(xì)胞死亡，說明本分離株毒力強(qiáng)。經(jīng)過人工回歸試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株Y-13確有較強(qiáng)的致病性，能引起黑斑蛙腸炎、紅腿、敗血癥，其半致死濃度為7.3×106mL-1。說明除了嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌以外，寡養(yǎng)單胞菌屬還存在其他種類的致病菌，這是首次發(fā)現(xiàn)。至于本分離株的致病因子、傳染性及對(duì)人類的潛在影響等仍有待進(jìn)一步研究。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥規(guī)定，本研究篩選出2種治療藥物，分別是恩諾沙星和復(fù)方磺胺甲噁唑。但是在生產(chǎn)上，我們分別使用了這2種藥物來治療，效果均不理想，推測(cè)主要原因是患病黑斑蛙食欲降低甚至斷食，通過飼料中添加藥物的方式很難起效。因此，預(yù)防是關(guān)鍵，應(yīng)加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)境滅菌、降低養(yǎng)殖密度、提高黑斑蛙自身免疫力。本研究篩選出幾種滅菌劑的最低抑菌濃度，還需進(jìn)一步考察滅菌劑不同濃度對(duì)黑斑蛙的毒性，并進(jìn)一步開展大范圍的流行病學(xué)調(diào)查，深入研究蛙源病原菌的感染規(guī)律，以便指導(dǎo)科學(xué)用藥。