葉友菊， 胡青荻， 鄭堅(jiān)， 馬曉華， 張旭樂， 錢仁卷

(浙江省亞熱帶作物研究所 溫州市資源植物創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325005)

毛茛科鐵線蓮屬(Clematis)植物，因花朵艷麗被譽(yù)為園林中的“藤本皇后”[1-2]，廣泛應(yīng)用于盆栽花卉等[3]。我國鐵線蓮屬植物種類繁多，其中天臺(tái)鐵線蓮為浙江特有瀕危種，是浙江省重點(diǎn)保護(hù)野生植物[4]。天臺(tái)鐵線蓮為平展型大花，花期一般在5—6月，花萼通常為白色[5]，花量大、花色變異豐富，極具觀賞價(jià)值，且兼?zhèn)渌幱脙r(jià)值，是不可多得的鐵線蓮育種親本[6]。

花色素的存在及其變化是植物花色表現(xiàn)的化學(xué)機(jī)制，絕大多數(shù)植物累積特定的花色素種類，從而呈現(xiàn)出一定的花色表型，與花色的深淺程度密切相關(guān)[7]。近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，植物育種研究也有了新的思路和手段，基于組學(xué)分析植物花色素苷的合成與調(diào)控已成為植物花色素苷新的研究方向[8-9]。鄧嬌等[10]基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示雙色花蓮大灑錦花色形成機(jī)理；潘新怡[11]基于組學(xué)對(duì)紫花苜?；ㄉ嚓P(guān)基因進(jìn)行了挖掘與鑒定；趙君等[12]通過代謝組學(xué)對(duì)向日葵不同花色物質(zhì)組成進(jìn)行分析。不難發(fā)現(xiàn)，組學(xué)已經(jīng)成為目前植物花色研究的熱門方向。

本課題組在天臺(tái)鐵線蓮引種馴化過程中發(fā)現(xiàn)了花萼呈現(xiàn)白色和紫色相間以及花萼全部為藍(lán)紫色的多個(gè)變異植株，且在連續(xù)3個(gè)開花周期的觀察下都呈現(xiàn)穩(wěn)定的花色性狀，該發(fā)現(xiàn)不僅為鐵線蓮增加了重要的花色種質(zhì)資源，也為研究鐵線蓮花色變異形成機(jī)制提供了理想的材料。為了進(jìn)一步探究影響花色素形成的機(jī)制，我們利用天臺(tái)鐵線蓮的白色原種和花色變異材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過GO和KEGG富集及功能注釋，挖掘可能參與花色變異的差異表達(dá)基因，為闡明天臺(tái)鐵線蓮的花色變異機(jī)制提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)對(duì)于了解其余種類鐵線蓮花色的形成以及培育也具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用試驗(yàn)材料為浙江省溫州市的浙江省亞熱帶作物研究所國家鐵線蓮種質(zhì)資源庫保存的天臺(tái)鐵線蓮，選取花色為白色(TTCB)的原種、花萼呈現(xiàn)淡紫色相間(TTJD)、紫色相間(TTJ)、藍(lán)紫色相間(TTJZ)以及花萼全部為藍(lán)紫色(TTSZ)的變異植株為試驗(yàn)材料(圖1)。所選植株為同一生長(zhǎng)環(huán)境下同一物種的不同變異，無病蟲害。采樣時(shí)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，新鮮采集的花朵立即用液氮速凍處理，然后儲(chǔ)存在-80 ℃用作RNA提取。

圖1 不同花色的天臺(tái)鐵線蓮材料

1.2 方法

1.2.1 文庫構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

天臺(tái)鐵線蓮花萼研磨在液氮條件下完成，選用植物RNA提取試劑盒(Tiangen，Beijing)進(jìn)行RNA提取。RNA濃度和純度(D260/D280≈2.1，D260/D230>1.8)的檢測(cè)通過NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo，USA)完成，之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析RNA的完整性。樣品檢測(cè)合格后，利用RNA文庫試劑盒進(jìn)行mRNA純化及文庫構(gòu)建(NEB，USA)，樣品的測(cè)序由美吉生物科技有限公司Illumina HiseqTM4000完成。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理及分析

Raw reads進(jìn)行過濾處理后得到Clean reads。由于天臺(tái)鐵線蓮沒有相應(yīng)的參考基因組序列，本研究采用de novo組裝方法，使用Trinity軟件對(duì)Clean reads進(jìn)行組裝，之后利用Tgicl對(duì)轉(zhuǎn)錄本聚類去冗余，得到unigene作為后續(xù)分析的參考序列。采用fold change≥2.00、adjustedP≤0.05的方式篩選差異基因，差異基因的表達(dá)豐度用FPKM值表示。采用Blast2GO軟件對(duì)篩選到的DEGs進(jìn)行GO富集分析并進(jìn)行GO功能統(tǒng)計(jì)[13]?；贙EGG注釋結(jié)果，利用KOBAS 3.0對(duì)檢測(cè)到的差異基因進(jìn)行pathway富集分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

天臺(tái)鐵線蓮白花和深紫花各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共構(gòu)建15個(gè)cDNA文庫，基于Illumina HiseqTM4000測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)詳見表1。經(jīng)過濾篩選后共獲得了136.03 Gb的clean data，每個(gè)樣品獲得6 Gb左右的clean data，其中Q30的占比超過92%，GC含量均在45%以上(表1)。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)

2.2 樣品主成分分析

為了進(jìn)一步了解多個(gè)花色變異品種的關(guān)系，我們對(duì)樣品進(jìn)行了主成分分析。結(jié)果表明，淡紫色相間(TTJD)以及紫色相間(TTJ)的花與原種白色(TTCB)的花差異較小，而在花色呈現(xiàn)藍(lán)紫色之后，與白色(TTCB)的花差異則明顯增大(圖2)。這一現(xiàn)象也與天臺(tái)鐵線蓮花色性狀一致。

圖2 樣品主成分分析

2.3 差異表達(dá)基因分析

為進(jìn)一步探究天臺(tái)鐵線蓮花色變異機(jī)制，我們構(gòu)建了韋恩圖，結(jié)果表明，17 550個(gè)基因在所有花色中都表達(dá)(圖3)。對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)白色花(TTCB)和藍(lán)紫色花(TTSZ)之間存在最多的差異基因，數(shù)量高達(dá)24 016個(gè)，其中11 543個(gè)基因發(fā)生上調(diào)，12 473個(gè)基因發(fā)生下調(diào)，其次是淡紫色相間的花(TTJD)和藍(lán)紫色花(TTSZ)、紫色相間的花(TTJ)和藍(lán)紫色花(TTSZ)以及藍(lán)紫色相間的花(TTSZ)和藍(lán)紫色花(TTSZ)之間的差異基因。

2.4 差異表達(dá)基因GO分類

差異表達(dá)基因GO分類統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，天臺(tái)鐵線蓮花色變異的DEGs主要富集在生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)(圖4)，這些結(jié)果對(duì)于花色的形成和變異具有重要的指導(dǎo)意義。在TTCB 與 TTJ的富集結(jié)果中，DEGs主要富集在生物合成和代謝過程方面，而在TTCB與TTJD、TTCB與TTJZ和TTCB與TTSZ的富集結(jié)果中，DEGs主要富集在代謝過程方面。在TTCB 與 TTSZ的富集結(jié)果中，BP中的不飽和脂肪酸代謝過程(GO:0033559和GO:0006636)、一元羧酸代謝過程(GO:0072330)顯著富集，MF中的萜烯合成途徑(GO:0016835)和檸檬烯合成途徑(GO:0010333)顯著富集，說明這些都參與到花色變異的機(jī)制中。

圖3 不同花色的差異表達(dá)基因分析

圖4 差異表達(dá)基因的GO富集

2.5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

進(jìn)一步通過KEGG富集分析表明，在TTCB與TTJ的富集結(jié)果中，DEGs主要富集在生物合成和代謝過程方面，而在TTCB與TTJD、TTCB與TTJZ和TTCB與TTSZ的富集結(jié)果中，DEGs主要富集在代謝過程方面。不難發(fā)現(xiàn)大多數(shù)DEGs顯著富集在萜類生物合成、氮代謝、吲哚生物堿生物合成、生物素代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等代謝途徑(圖5)。此外，對(duì)天臺(tái)鐵線蓮花色影響最為重要的花青素合成途徑，在TTCB與TTSZ中達(dá)到最多的差異基因數(shù)量(17個(gè))，而在TTCB與TTJD、TTCB與TTJ和TTJ與TTSZ中分別是6、10和16個(gè)，表明隨著花色差異增大參與花青素合成的差異基因越多。

圖5 差異表達(dá)基因的KEGG富集

3 討論

花色是觀賞植物重要的性狀指標(biāo)，鐵線蓮作為我國重要的觀賞類植物，如何培育花色豐富的鐵線蓮新品種是鐵線蓮育種者一直以來追求的目標(biāo)，因而了解鐵線蓮花色形成及變異的分子機(jī)理顯得尤為重要[15-17]。影響植物花色的因素有很多，包括光照、水分和溫度等外部環(huán)境因素，但是最主要的還是由基因決定其呈色[18-19]。從分子層面對(duì)不同性狀之間基因差異進(jìn)行分析成為主要研究方向之一[20-21]。隨著近年來高通量測(cè)序技術(shù)高速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在植物分子研究中得到廣泛的應(yīng)用。

本研究以天臺(tái)鐵線蓮的白花為對(duì)照組，多個(gè)花色變異品種為試驗(yàn)組，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并獲得136.03 Gb的clean data。差異基因統(tǒng)計(jì)分析表明，天臺(tái)鐵線蓮的白色花和藍(lán)紫色花存在最多的差異基因，高達(dá)24 016個(gè)，且這些差異基因主要富集到代謝過程中。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因KEGG通路富集結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TTCB與TTSZ在花青素合成途徑中富集到最多的差異基因(17個(gè))，TTCB與TTJZ存在16個(gè)差異基因，而TTCB與TTJD和TTCB與TTJ中分別僅有6和10個(gè)。結(jié)合PCA分析，可以發(fā)現(xiàn)隨著藍(lán)紫色物質(zhì)的積累，與白色花的差異越來越大，而這些差異基因可能也是造成天臺(tái)鐵線蓮花色存在差異的重要原因(圖2)。徐建等[22]通過對(duì)矮牽牛基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析及F3′5′H基因的功能鑒定，發(fā)現(xiàn)F3′5′H基因促使轉(zhuǎn)基因后代的矮牽牛花瓣呈現(xiàn)紫色；洪燕紅等[23]發(fā)現(xiàn)，在紅花草莓中FaMYB82、FaMYB6、FaMYB90可能通過調(diào)節(jié)FaPAL、Fa4CL、FaDFR和Fa3GT的表達(dá)來調(diào)控花瓣色澤的形成。在本研究中，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)白色和藍(lán)紫色花之間存在著較多的差異基因，其花青素合成途徑中也存在著較大的差異，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究[24]。