徐玥瑋， 王麗， 高曉明， 謝若男， 王雷， 楊滿琴**

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 藥學(xué)部， 安徽 合肥 230061； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 安徽 合肥 230061)

缺血性卒中是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)血管疾病，是全球致殘和死亡的主要原因。血管再通可以補(bǔ)充血管中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并去除有毒代謝物，是缺血性卒中的主要的治療方法[1]。然而，缺血再灌注損傷能激活壞死、凋亡、自噬等一系列細(xì)胞死亡程序，常導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[2]。因此，尋找有效的緩解缺血再灌注損傷的方法是臨床上急需解決的問(wèn)題。缺血后適應(yīng)即在長(zhǎng)期嚴(yán)重的腦缺血后，在再灌注開(kāi)始前應(yīng)用反復(fù)短暫性灌注的方法被證明可緩解腦缺血再灌注后造成的損傷[3]。Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)是高度保守的信號(hào)通路，廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中，并與細(xì)胞多種生理和病理過(guò)程密切相關(guān)[4]。有研究表明，Wnt/β-catenin在腦、腎、肝臟等器官的缺血再灌注損傷中起保護(hù)作用[5]。同時(shí)Wnt蛋白廣泛存在于腦血管和血腦屏障中，參與腦血管的形成和血腦屏障分化，在血腦屏障的形成和維持、腦血管的再生和重塑中也起到重要的作用[6]。有研究表明，腦損傷時(shí)，多種藥物通過(guò)介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，進(jìn)而減輕腦血腦再灌注損傷[5，7-8]。但目前Wnt/β-catenin對(duì)腦缺血后適應(yīng)的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。黃芪甲苷是從中藥黃芪中提取的最有生物活性的單體，研究表明黃芪甲苷具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用[9]，黃芪甲苷可通過(guò)減弱氧化應(yīng)激損傷、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管重構(gòu)和再生等途徑對(duì)多器官的缺血再灌注損傷起保護(hù)作用[10]。 研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)卒中小鼠的神經(jīng)發(fā)生并減輕認(rèn)知障礙[11]，本研究旨在探討黃芪甲苷通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin對(duì)腦缺血后適應(yīng)的影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪甲苷購(gòu)自阿拉丁公司，尼莫地平購(gòu)自美侖生物，大鼠源高敏c反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-Reactive Protein，hs-CRP)ELISA試劑盒購(gòu)買自Elabscience公司，大鼠源S100鈣結(jié)合蛋白B(S100 calcium binding protein B，S100-B)ELISA試劑盒購(gòu)自優(yōu)爾生公司，PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自BioTeke公司，Wnt家族成員3A(Wnt3a)、β-catenin、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和磷酸化β-catenin(p-β-catenin)抗體購(gòu)自萬(wàn)類生物，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)SD雄性大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量260～320 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為7組：假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注組(I/R組)、缺血后適應(yīng)組(IPC組)、中藥單體黃芪甲苷(低，10 mg/kg)+缺血后適應(yīng)組(IPC+AS-IV10組)、中藥單體黃芪甲苷(中，20 mg/kg)+缺血后適應(yīng)組(IPC+AS-IV20組)、中藥單體黃芪甲苷(高，50 mg/kg )+缺血后適應(yīng)組(IPC+AS-IV50組)、尼莫地平+缺血后適應(yīng)組(IPC+Nim組)，每組12只大鼠。Sham組僅暴露頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行線栓阻斷及缺血-再灌注處理。I/R組建模方式參照文獻(xiàn)[12]的方法，具體步驟如下：大鼠予10%水合氯醛腹(4 mL/kg)腔注射，麻醉后仰臥固定，頸部正中切口約4 cm，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈；動(dòng)脈夾夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈，在靠近頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處的頸外動(dòng)脈斜形切口，將帶有圓形尖端的4-0單絲尼龍縫線通過(guò)頸外動(dòng)脈殘端插入頸內(nèi)動(dòng)脈，并輕輕推進(jìn)以阻塞大腦中動(dòng)脈內(nèi)，使其閉塞2 h后(缺血)，拆除縫線恢復(fù)血流(復(fù)流)；IPC組在大腦中動(dòng)脈閉塞2 h后，復(fù)流30 s后再缺血30 s，完成“復(fù)流30 s—缺血30 s”3個(gè)循環(huán)，然后拆除縫線恢復(fù)血流；IPC+AS-IV10、IPC+AS-IV20、IPC+AS-IV50組在造模前分別按10、20、50 mg/kg劑量給予黃芪甲苷連續(xù)灌胃7 d，于末次灌胃后2 h進(jìn)行IPC手術(shù)；IPC+Nim組在IPC術(shù)前給予尼莫地平(10 mg/kg)連續(xù)口服15 d，于末次灌胃后2 h進(jìn)行IPC手術(shù)。

1.2.2神經(jīng)功能評(píng)估 手術(shù)24 h后，對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)估[13]，沒(méi)有神經(jīng)損傷體征計(jì)0分，不能完全伸直對(duì)側(cè)前爪計(jì)1分，身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分，身體向?qū)?cè)傾倒計(jì)3分，不能自發(fā)行走、意識(shí)喪失計(jì)4分。

1.2.3計(jì)算腦梗死面積 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TCC)染色檢測(cè)腦梗死面積。所有大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)估完成后處死并取出腦組織，在-20 ℃冰箱冷凍1～2 h，去除嗅球、小腦后將大腦冠狀面平均切分為5片，將腦片后放入1 %TTC溶液中，37 ℃染色10～15 min，期間注意避光并不斷的翻動(dòng)切片使之染色均勻，染色結(jié)束后擺齊，拍照并軟件計(jì)算梗死區(qū)面積。

1.2.4腦組織學(xué)觀察 大鼠腦組織4 %多聚甲醛固定后，石蠟包埋后切成5 μm薄片、行HE染色[14]，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5血清hs-CRP、S100-B水平檢測(cè) ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清hs-CRP、S100-B(腦組織損傷標(biāo)記物)水平，分別按照hs-CRP、S100-B商品化試劑盒說(shuō)明術(shù)操作步驟處理血清，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的OD值，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣本濃度。

1.2.6腦組織中Wnt3a、β-catenin、BDNFmRNA檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)腦組織中Wnt3a、β-catenin、BDNFmRNA表達(dá)。使用TRIpure RNA試劑提取腦組織的總RNA，并通過(guò)紫外分光光度計(jì)NANO 2000測(cè)定RNA濃度，然后用Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)ExicyclerTM 96熒光定量?jī)x進(jìn)行熒光定量分析，按2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequencing information

1.2.7腦組織中Wnt3a、β-catenin、BDNF和p-β-catenin的蛋白檢測(cè) 免疫印跡檢測(cè)Wnt3a、β-catenin、BDNF和p-β-catenin蛋白表達(dá)。取適量大鼠腦組織，使用全蛋白提取試劑盒抽提細(xì)胞蛋白并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取蛋白樣品進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，將Wnt3a(1 ∶500)、β-catenin(1 ∶400)、BDNF(1 ∶1 000)和p-β-catenin(1 ∶1 000)相應(yīng)一抗分別放入封閉液中，4 ℃孵育過(guò)夜，之后分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)，37 ℃孵育45 min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑使底物發(fā)光。用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值，以β-actin做內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

Sham組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分為0分，未見(jiàn)神經(jīng)功能損傷的癥狀。與Sham組相比，I/R組大鼠復(fù)流24 h后神經(jīng)功能損傷評(píng)分上升(P<0.05)；與I/R組相比，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分降低(P<0.05)；與IPC組相比，IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 大鼠腦梗死面積

Sham組腦組織沒(méi)有白色梗死組織，I/R組可見(jiàn)明顯白色梗死組織(P<0.05)。與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組白色梗死組織減少(P<0.05)；與IPC組比較，IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組白色梗死組織減少(P<0.05)；但I(xiàn)PC+Nim組與IPC+AS-IV50組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 大鼠腦組織學(xué)觀察

Sham組大鼠腦組織形態(tài)正常，染色均一；I/R組大鼠腦組織細(xì)胞明顯減少，無(wú)法分清各層，大部分神經(jīng)元出現(xiàn)變性、壞死，大量神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，部分核仁消失，胞體變形，出現(xiàn)嚴(yán)重空泡樣變。IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組出現(xiàn)異形、核固縮的細(xì)胞數(shù)量不同程度的減少，及輕微細(xì)胞水腫。IPC+Nim組正常細(xì)胞數(shù)量較I/R組明顯增多，僅有少量的空泡樣變。見(jiàn)圖3。

2.4 大鼠血清S-100B、hs-CRP含量

I/R組大鼠血清中S-100B、hs-CRP含量明顯高于Sham組(P<0.05)；與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組血清中S-100B、hs-CRP含量降低(P<0.05)；與IPC組比較，IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組血清中S-100B、hs-CRP含量降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.5 大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin以及BDNF mRNA表達(dá)

與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin以及BDNFmRNA水平降低(P<0.05)。與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組以及IPC+Nim組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin以及BDNFmRNA水平升高(P<0.05)。與IPC組比較，IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組大鼠腦組織中BDNF、Wnt3amRNA升高(P<0.05)，IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組大鼠腦組織中β-cateninmRNA升高(P<0.05)。此外，大鼠腦組織中Wnt3a、β-cateninmRNA的表達(dá)呈現(xiàn)黃芪甲苷劑量依賴；與IPC+AS-IV20組比較，IPC+AS-IV50組Wnt3amRNA的表達(dá)升高(P<0.05)；IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組間比較，β-cateninmRNA的表達(dá)隨劑量增高而升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

2.6 大鼠腦組織Wnt3a，β-catenin以及BDNF蛋白的表達(dá)

與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中Wnt3a，β-catenin和BDNF蛋白的表達(dá)均降低(P<0.05)；與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組的Wnt3a、β-catenin和BDNF蛋白水平升高(P<0.05)。與IPC組比較，IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組Wnt3a蛋白水平增高，且IPC+AS-IV50組的Wnt3a蛋白水平高于IPC+AS-IV20組(P<0.05)；與IPC組比較，IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組β-catenin蛋白水平增高(P<0.05)，且IPC+AS-IV50組的β-catenin蛋白水平高于IPC+AS-IV10組(P<0.05)；與IPC組比較，IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組BDNF蛋白水平增高，且IPC+AS-IV50組的BDNF蛋白水平高于IPC+AS-IV10組(P<0.05)。與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中p-β-catenin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與I/R組比較，IPC組、IPC+AS-IV10組、IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組的p-β-catenin蛋白水平下降(P<0.05)；與PIC組比較，IPC+AS-IV20組、IPC+AS-IV50組、IPC+Nim組的p-β-catenin蛋白水平下降(P<0.05)，且IPC+AS-IV20組p-β-catenin蛋白水平高于IPC+AS-IV50組(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

3 討論

近年來(lái)，缺血性卒中的治療方法不斷發(fā)展，但及時(shí)溶栓處理恢復(fù)血管血氧供應(yīng)一直是治療缺血損傷的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而血管再通后，隨之而來(lái)的是血小板過(guò)度活化、微血管損傷、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載以及過(guò)度炎癥反應(yīng)，因而對(duì)受損的腦組織造成第二次損傷即缺血再灌注損傷。在臨床治療上，缺血再灌注損傷的程度與患者的死亡率和致殘率密切相關(guān)。因此全面了解缺血再灌注損傷、抑制或減輕缺血再灌注損傷對(duì)提高再灌注治療的有效性有關(guān)鍵作用[15]。缺血后適應(yīng)是恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流灌注前給予反復(fù)幾次短暫灌注可明顯減輕再灌注損傷，并有研究表明，與缺血再灌注相比，缺血后適應(yīng)對(duì)局灶性腦損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[16]。

中藥單體黃芪甲苷是中藥黃芪中的有效成分，現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪甲苷對(duì)多種缺血再灌注、心血管疾病、肺部疾病、肝纖維化和糖尿病腎病等均有保護(hù)作用[17-18]。近年來(lái)，已有多項(xiàng)研究表明，黃芪甲苷對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[19]。本研究中，采用大鼠I/R模型，在大鼠腦缺血后給予缺血后適應(yīng)處理，結(jié)果表明，再灌注前進(jìn)行缺血后適應(yīng)處理有效的減少了大鼠腦梗死面積，并降低了大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。本研究探討中藥單體黃芪甲苷聯(lián)合缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，給予IPC大鼠不同劑量的黃芪甲苷后，大鼠腦梗面積和神經(jīng)功能損傷程度明顯減少。但是黃芪甲苷聯(lián)合缺血后適應(yīng)的治療在腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)保護(hù)作用及其分子機(jī)制尚不清楚。

研究表明，黃芪甲苷可以通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)刺激細(xì)胞成骨分化，揭示出黃芪甲苷對(duì)Wnt/β-catenin通路的調(diào)控作用[20]。但是黃芪甲苷聯(lián)合缺血后適應(yīng)處理緩解I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用是否通過(guò)Wnt/β-catenin通路尚不明確。Wnt是參與胚胎和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵信號(hào)，并維持成年期的神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)。Wnt/β-catenin是Wnt通路中經(jīng)典的信號(hào)通路，是神經(jīng)元發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)的重要的信號(hào)通路，在Wnt缺失的情況下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的GSK-3β與Axin和APC等以復(fù)合物的形式p-β-catenin并使其降解，Wnt通路關(guān)閉。當(dāng)Wnt配體蛋白與細(xì)胞表面受體FZD、卷曲蛋白LRP5/6結(jié)合時(shí)，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，隨后抑制β-catenin的磷酸化，從而促進(jìn)β-catenin的穩(wěn)定。穩(wěn)定的β-catenin易位到細(xì)胞核內(nèi)，與T細(xì)胞因子TCF相互作用，提高促細(xì)胞存活的關(guān)鍵因子表達(dá)[21]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BNDF是在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)的具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)，BNDF的表達(dá)水平與認(rèn)知功能呈正相關(guān)性。因此本研究采用了RT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin和BNDF mRNA及蛋白的表達(dá)，探究黃芪甲苷處理后對(duì)Wnt/β-catenin的調(diào)控作用，并以BNDF的表達(dá)反映黃芪甲苷調(diào)控Wnt/β-catenin對(duì)腦損傷的恢復(fù)功能。結(jié)果顯示缺血后適應(yīng)以及黃芪甲苷聯(lián)合缺血后適應(yīng)處理不同程度的上調(diào)了Wnt家族中重要蛋白Wnt3a及下游β-catenin的表達(dá)，并上調(diào)了BNDF的表達(dá)。

總之，本研究揭示了缺血后適應(yīng)處理有助于緩解缺血再灌注造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元損傷；黃芪甲苷可以促進(jìn)缺血后適應(yīng)處理對(duì)局灶性腦損傷腦保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷聯(lián)合缺血后處理可上調(diào)Wnt3a、β-catenin和BNDF的表達(dá)，這些影響可能通過(guò)Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)大鼠再灌注損傷。