胡鑫，麻慧慈，韓明盛，原曉紅，楊鳴宇，馬艷琴

山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西晉中030801

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在女性癌癥相關死亡中居第2 位［1］。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）作為乳腺癌的1 個亞型，具有高度異質性、發(fā)病年齡偏小、分化程度低、侵襲性高、復發(fā)率高等特點［2］。TNBC由于雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人類上皮細胞生長因子受體2（human epithelial growth factor receptor 2，HER2）表達均為陰性，采用內分泌治療及抗HER2 治療后預后較差［2］。因此，探究與TNBC 發(fā)生、浸潤及轉移相關的分子機制對早期診斷、精準治療及預后評估具有重要臨床意義［3］。

微小RNA（miRNA）是一類小的非編碼RNA，長度一般為18～25 個核苷酸，可通過抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解而對基因表達起負調控作用［4］。miRNA 通過調節(jié)癌基因和抑癌基因的表達來調控腫瘤細胞的存活、增殖、侵襲、轉移、凋亡及對藥物的反應性等，對腫瘤早期診斷、預后判斷和治療靶標價值較高［5-6］。本研究利用基因表達數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）中TNBC相關的miRNA 表達譜芯片數(shù)據(jù)集，篩選差異表達miRNA并預測其靶基因，進而對靶基因進行相關生物信息學分析，從而獲得TNBC 發(fā)生發(fā)展中的關鍵miRNA 及其關鍵靶基因，旨在為TNBC 的研究提供潛在的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從GEO 數(shù)據(jù)庫中獲取miRNA 表達芯片數(shù)據(jù)集GSE38167（agilent-029297 human miRNA microarray，GPL14943平臺），包括31例原發(fā)性TNBC 樣本和23例正常乳腺組織。

1.2 差異miRNA篩選

利用GEO2R 在線分析軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）分析正常乳腺組織和TNBC 組織的差異表達miRNA，篩選條件為adj.P＜0.05，｜log2FC｜≥2。

1.3 差異miRNA靶基因預測

對差異表達倍數(shù)最大的5 個上調和5 個下調miRNA 進行靶基因預測。為降低軟件預測結果的假陽性率，擬定至少在miRDB（http：//mirdb.org/）、miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和TargetScanHuman7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）這3 個預測軟件中有記錄的基因才可以作為靶基因。

1.4 靶基因功能富集分析

通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）在線分析軟件對靶基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，篩選條件為P＜0.05。

1.5 靶基因PPI網(wǎng)絡及miRNA-靶基因網(wǎng)絡構建

將上調和下調miRNA 的靶基因分別映射到STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構建蛋白互作網(wǎng)絡（protein-protein interaction network，PPI），中置信度（medium confidence）值為0.400。結合Cytoscope 軟件的CytoHubba 插件篩選degree 值為Top10 的基因，并建立miRNA-靶基因調控網(wǎng)絡，篩選關鍵miRNA和關鍵靶基因。

1.6 生存分析

利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫（http：//gepia2.cancerpku.cn/）分析關鍵靶基因表達與TNBC 患者總體生存率的相關性。

2 結果與分析

2.1 差異miRNA的篩選

使用GEO2R 分析GSE38167數(shù)據(jù)集并繪制差異miRNA 的火山圖（圖1）。共篩選出486 個差異miRNA，其中上調的298 個，下調的188 個。上調倍數(shù)最大的5 個miRNA 分別是miR-452*、miR-611、miR-587、miR-615-5p、miR-1915*；下調倍數(shù)最大的5 個miRNA 分別是miR-339-5p、miR-511、miR-1205、miR-147b、miR-580（表1）。

表1 TNBC組織和正常乳腺組織中差異表達倍數(shù)最大的miRNATable 1 The largest differential expression of miRNA in TNBC tissue and normal breast tissue

圖1 差異表達miRNA火山圖Fig.1 Volcano map analysis of differentially expressed miRNA

2.2 差異miRNA靶基因的預測

通過miRWalk、TargetScanHuman7.2和miRDB分別對差異miRNA 進行靶基因預測并取交集，結果如圖2～3 所示，上調miRNA 中miR-1915-5p、miR-615-5p、miR-587、miR-611、miR-452-3p 的靶基因分別有211、81、287、33、47 個；下調miRNA中miR-339-5p、miR-511-3p、miR-1205、miR-147b-3p、miR-580-3p 的靶基因分別有3、29、161、4、79個。

圖2 表達上調倍數(shù)最大的5個miRNA的靶基因預測Fig.2 Target gene prediction of five miRNA with the largest up-regulated expression

圖3 表達下調倍數(shù)最大的5個miRNA的靶基因預測Fig.3 Target gene prediction of five MiRNA with the largest down-regulated expression

2.3 靶基因的功能富集分析

GO 分析結果表明，上調miRNA 的靶基因主要參與的生物學過程（biological process，BP）包括轉錄、轉錄調控、軸突導向、細胞周期阻滯等；細胞成分（cellular component，CC）主要集中于細胞核、細胞質、細胞溶質等；分子功能（molecular function，MF）主要為轉錄因子活性、DNA 結合、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)域序列特異性DNA結合等（表2）。下調miRNA 的靶基因主要參與的BP 為突觸傳遞的調節(jié)、成纖維細胞凋亡的正調控、伴侶蛋白介導的蛋白質折疊輔因子等；CC 主要定位于細胞質、晚期胞內體、細胞溶質；MF主要與RNA 結合等（表3）。KEGG 通路分析結果表明，上調miRNA 的靶基因主要參與ErbB 信號通路、癌癥中的轉錄失調、催乳素信號通路等；下調miRNA 的靶基因主要參與cGMP-PKG 信號通路（表4）。

表2 部分表達上調的miRNA靶基因的GO功能注釋Table 2 Partial results of GO function annotations of miRNA target genes with up-regulated expression

表3 部分表達下調的miRNA靶基因的GO功能注釋Table 3 Partial results of GO function annotation of down-regulated miRNA target genes

表4 miRNA靶基因的KEGG通路富集分析（部分結果）Table 4 KEGG pathway enrichment analysis of miRNA target genes(partial results)

2.4 靶基因PPI 網(wǎng)絡的構建和關鍵靶基因的篩選

利用STRING 在線數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡，上調miRNA 的靶基因PPI 網(wǎng)絡由608 個節(jié)點和1 228條邊連接組成（圖4A）；下調miRNA 的靶基因PPI網(wǎng)絡由271個節(jié)點和269條邊連接而成（圖4B）。

圖4 差異miRNA靶基因的PPI網(wǎng)絡圖Fig.4 PPI network diagram of different miRNA target genes

利用Cytohubba 插件分析顯著性最高的分子模塊，進而獲取關鍵靶基因。結果如圖5所示，上調miRNA的關鍵靶基因為CDC27、UBE2D2、UBR1、ASB1、SPSB1、HERC2、RLIM、MKRN1、UBE3B、RNF138。下調miRNA 的關鍵靶基因為FBXL3、WSB1、KBTBD6、FBXL8、CBLB、UBE2W、PTPN11、ARF6、DNAJC6、COPS2。

圖5 關鍵靶基因互作網(wǎng)絡圖Fig.5 Key target gene interaction network diagram

利用Cytoscape 構建miRNA-靶基因調控網(wǎng)絡，如圖6 所示，miR-611 可能調控6 個關鍵靶基因，分別為CDC27、UBE2D2、UBR1、SPSB1、HERC2、RLIM。miR-1205 可能調控7 個關鍵靶基因，分別為WSB1、FBXL8、UBE2W、PTPN11、ARF6、DNAJC6、COPS2，提示miR-611和miR-1205為TNBC的2個關鍵潛在調控miRNA。

圖6 miRNA-靶基因調控網(wǎng)絡圖Fig.6 miRNA-target gene regulatory network diagram

2.5 靶基因的生存曲線分析

利用GEPIA2 數(shù)據(jù)庫進一步分析關鍵靶基因表達與TNBC 患者生存率的關系，其中UBR1（P=0.007 2）和PTPN11（P=0.029）的高表達可顯著降低TNBC患者的整體生存率（圖7）。

3 討論

TNBC不表達或低表達ER、PR以及HER2，其惡性程度高、侵襲性強、預后差，臨床治療難度較大［7］。近年來，人們逐漸認識到miRNA 可通過靶向調控mRNA的表達而促進腫瘤的生長、侵襲、遷移、血管新生及免疫逃逸［8］。本研究篩選出486個差異miRNA，包括298 個上調miRNA 和188 個下調miRNA。對差異倍數(shù)最大的5 個上調和5 個下調的miRNA 進行靶基因預測。miRDB、miRWalk和TargetScanHuman7.2 是3 個重要的miRNA 靶點預測工具，可進行miRNA 與mRNA 的啟動子、5'非翻譯區(qū)、編碼區(qū)及3'非翻譯區(qū)結合位點的計算和預測［9］。富集分析顯示，靶基因主要參與ErbB信號通路、癌癥的轉錄失調和cGMP-PKG 信號通路等。進一步分析miRNA-靶基因調控網(wǎng)絡，獲得與TNBC發(fā)生發(fā)展相關的關鍵miRNA及關鍵靶基因，可用于探究miRNA 對TNBC 的調控作用及發(fā)現(xiàn)新的分子靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，多個mRNA（CDC27、UBE2D2、UBR1、SPSB1、HERC2和RLIM）共同受到miR-611 的調控，mRNAWSB1、FBXL8、UBE2W、PTPN11、ARF6、DNAJC6和COPS2共同受到miR-1205的調控。結合PPI網(wǎng)絡分析關鍵模塊，以上蛋白在整個蛋白調控網(wǎng)絡中處于核心地位，對TNBC 的發(fā)生發(fā)展有重要的作用。生存分析進一步表明，靶基因UBR1和PTPN11的高表達與TNBC 患者整體生存率降低顯著相關。研究表明，miR-611 可促進舌鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質轉化，其表達上調與TNM 分期呈正相關，與患者整體生存率呈負相關［10］。miR-1205 在喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）組織中表達下調，miR-1205 過表達可抑制LSCC 細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-1205 高表達則預示LSCC 患者預后良好［11］。同時，在非小細胞肺癌和胃癌中也證實了miR-1205作為腫瘤抑制基因的作用［12-13］。本研究中，miR-611 在TNBC 組織中表達顯著上調（log2FC=7.97，adj.P＜0.05），miR-1205 表達顯著下調（log2FC=-7.87，adj.P＜0.05），提示其可作為TNBC 潛在的診斷標志物，并為深入研究TNBC 的發(fā)病機制奠定了理論基礎。

靶基因UBR1能識別含不穩(wěn)定氨基末端的蛋白質，導致底物蛋白質的最終降解［14］。Hsp90 抑制劑通過泛素蛋白酶體途徑從而促進致癌蛋白激酶和轉錄因子的降解，可作為有效的化療藥物。UBR1可提高癌細胞對Hsp90抑制劑的敏感性［15］。但本研究結果顯示，UBR1高表達顯著降低了TNBC 患者整體生存率，但UBR1在TNBC 發(fā)生發(fā)展中的作用及作為治療靶點的應用價值還需要進一步的研究。研究表明靶基因PTPN11編碼SHP-2分子［16］。SHP-2 已證實與多種腫瘤的發(fā)生相關，包括胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、血癌等［17］。童雅蘭［18］研究發(fā)現(xiàn)，SHP-2通過調控TNBC干細胞而影響TNBC 的復發(fā)、轉移和化療耐藥。Wu 等［19］通過生物信息學分析得出PTPN11是乳腺癌差異表達基因的中心基因之一，進一步通過實時熒光定量實驗進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)在0.1 μmol·L-1Cd 處理下PTPN11表達顯著增加，表明PTPN11基因可能與Cd 誘導的乳腺癌進展相關。本研究中靶基因PTPN11高表達可顯著降低TNBC 患者整體生存率，提示其有望作為潛在的預后標志物。

綜上所述，經(jīng)篩選獲得的關鍵miRNA 及其關鍵靶基因可作為潛在分子標記物用于TNBC 的早期診斷、治療靶點選擇和預后判斷，并為未來更深入的研究提供理論參考依據(jù)。