高欣欣，馬夢男，劉春龍，2，王夢凡，3*

1.天津大學化工學院，天津 300072；2.侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室丹娜生物分中心，天津 300467；3.天津大學生命科學院，天津300072

血清淀粉樣蛋白A (serum amyloid A，SAA)從結構上看是一類多形態(tài)蛋白的總稱，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其是由不同基因編碼、表達不同種類的血清淀粉樣蛋白A，而且這些蛋白具有高等位基因變異和物種之間高度同源的特點[1-2]。研究表明，SAA 主要產生于肝臟部位，并且在急性免疫反應中起著不可或缺的作用[3]。一般情況下，在急性炎癥事件發(fā)生的第3 天，血清淀粉樣蛋白A 濃度水平達到峰值，并且大約在第4天回到基礎水平[4]。據(jù)研究報道，在炎癥發(fā)生過程中，血清中血清淀粉樣蛋白A 濃度可以升高為正常值的1 000 倍以上[5]，因此，血清淀粉樣蛋白A 長期以來一直被認為是炎癥的敏感標志物[6-7]。已有文獻報道，血清淀粉樣蛋白A的生物合成和分泌不僅與慢性感染和炎癥有關，還與腫瘤和癌癥有關[8-10]。Tamamoto 等[3]發(fā)現(xiàn)了一種獨特的血清淀粉樣蛋白A，其僅在移植有胃癌細胞系的小鼠中出現(xiàn)，表明血清淀粉樣蛋白A 可以用作胃癌診斷的生物標志物。Bourika等[11]發(fā)現(xiàn)血清淀粉樣蛋白A 與兒童敗血癥有關。有研究表明，血清淀粉樣蛋白A 可作為新型冠狀病毒（coronavirus disease 2019,COVID-19）的一種炎癥指標[12]。此外，史清梅等[13]研究表明血清淀粉樣蛋白A 和C 反應蛋白水平升高對急性主動脈夾層具有較高的預測價值，因此這2 個指標有望作為急性主動脈夾層的實驗室輔助診斷檢測指標。以上研究表明，檢測血清淀粉樣蛋白A 水平對評估炎癥性疾病的感染情況和正確應對治療具有極其重要的臨床意義[4]。

目前，血清淀粉樣蛋白A 檢測方法主要有散射比濁法、酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA+）以及磁微?；瘜W發(fā)光法，但散射比濁法和酶聯(lián)免疫吸附試驗法存在以下不足：散射比濁法需特定的分析儀器，試劑價格高；酶聯(lián)免疫吸附試驗屬于手動操作，對實驗員的專業(yè)要求比較高，且耗時較長，磁微?；瘜W發(fā)光法與免疫學中經典實驗ELISA不同的是，該方法使用固相載體為磁性微球，具有較高的比表面積，能夠充分與樣品反應，而且磁微粒技術無需通過離心或色譜進行樣品預處理，從而縮短了所需的時間，使得該方法具有更高的靈敏度和更快的檢測速度[14]，因此，近年來磁珠化學發(fā)光法已廣泛應用于體外診斷領域。目前血清淀粉樣蛋白A的磁微粒化學發(fā)光法檢測使用的是與辣根過氧化物酶（hovseradish pevoxidase，HRP）標記血清淀粉樣蛋白A抗體即辣根過氧化物酶魯米諾系統(tǒng)為酶促系統(tǒng)，其應用于化學發(fā)光免疫分析時發(fā)光效率較低，需要配合催化劑及增強劑，這導致該體系背景發(fā)光增強，使測量本底升高，從而限制了這一技術的靈敏度。此外，磁微粒化學發(fā)光法中傳統(tǒng)的鏈霉親和素磁珠體系有缺陷，部分人群會服用復合維生素補充劑從而造成生物素干擾，且磁珠本身存在很多未知干擾，而對于裸磁珠體系，從根本上沒有生物素干擾，且未經任何修飾，所以后期可以通過調整抗原包被量來增強特異性，從而減少假陽性因素。此外，使用吖啶酯作為發(fā)光劑光量子產率高，背景低，與蛋白、抗原、抗體等偶合后，發(fā)光效率幾乎不受影響，因而可作為優(yōu)良的化學發(fā)光免疫分析標記試劑。

基于以上背景，為了消除傳統(tǒng)鏈霉親和素磁珠體系和酶促發(fā)光系統(tǒng)存在的生物素干擾、發(fā)光率低、特異性差的缺陷，本研究設計了一種裸磁珠-吖啶酯發(fā)光體系來快速測定血清淀粉樣蛋白A 濃度的方法，并評價其性能指標，旨在為血清淀粉樣蛋白A的快速測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本與試劑

1.1.1 試驗材料 試驗所需樣本均由相關醫(yī)院提供，共152例，其中男女比例1∶1，年齡范圍：剛出生嬰兒～80歲。采集時間為2018年12月—2019年4月。將血清或血漿樣品離心分離（3 000g，10 min），4°C保存?zhèn)溆?。所有樣本的信息均進行匿名處理。

1.1.2 試劑與儀器 血清淀粉樣蛋白A測定試劑盒（散射比濁法）購自德國西門子公司；血清淀粉樣蛋白A 抗原、血清淀粉樣蛋白A 抗體對、磁珠均由侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室丹娜生物分中心提供；血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯均購自北京普天同創(chuàng)公司；其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

全自動化學發(fā)光免疫分析儀購于重慶科斯邁生物科技有限公司；全自動蛋白分析儀購于德國西門子公司；醫(yī)用低速自動平衡離心機購于湖南湘儀公司。

1.2 方法

1.2.1 雙抗夾心體系建立 包被抗體1——吖啶磺酰胺標記血清淀粉樣蛋白A 抗體1 制備：用0.01 mol·L-1CBS 緩沖液將血清淀粉樣蛋白A 抗體1 稀釋到1 mg·mL-1，取溶解了吖啶酯的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液加入上述抗體稀釋液中，混勻，避光置于室溫1 h。加終止液（10%賴氨酸）混勻，避光置于室溫30 min 后進行透析，收集透析后液體，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

包被抗體2——裸磁珠偶聯(lián)血清淀粉樣蛋白A 抗體2 制備：取磁珠溶液，磁分離棄去上清；取0.1 mol·L-1MES 偶聯(lián)緩沖液分散磁珠，后加入碳二亞胺（carbodimide，EDC）溶液活化磁珠30 min；磁分離，棄上清；取偶聯(lián)緩沖液重新分散上述磁珠，并加入血清淀粉樣蛋白A 抗體2，室溫震蕩反應3 h；磁分離，棄上清，加入封閉液[3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）]于上述反應體系中，繼續(xù)反應2 h；磁分離，棄上清；取洗滌緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液）重新分散上述磁珠，之后重新分散抗原偶聯(lián)磁珠于存儲液（0.02 mol·L-1PBS緩沖液）中，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為驗證裸磁珠與血清淀粉樣蛋白A 抗體2 偶聯(lián)效果，利用前述制備的包被抗體1與包被抗體2反應，并監(jiān)測其發(fā)光值變化。隨后利用配對好的包被抗體1，包被抗體2及血清淀粉樣蛋白A 抗原建立雙抗夾心檢測體系。

1.2.2 空白限和檢出限 根據(jù)EP17-A2 方法，準備5 份空白樣本和5 份低值樣本，分別使用3 臺發(fā)光儀測試3 d，每天每個樣本各設2 次生物學重復，采用該文件數(shù)據(jù)處理規(guī)則得到相應空白限和檢出限。

1.2.3 線性范圍 線性評估試驗所需樣本的基質不含有血紅蛋白、甘油三酯等未明確是否會產生干擾的物質。本研究線性實驗設定9 個濃度水平（P1～P9），其中P1 溶液的濃度為1 mg·L-1，P9 溶液的濃度為100 mg·L-1。樣本采用等間距稀釋法，具體方法為：P5 溶液由等體積P1 溶液和P9 溶液混合；P3溶液由等體積P1溶液與P5溶液混合；P4溶液由等體積P3 溶液與P5 溶液混合；P7 溶液由等體積P5 溶液與P9 溶液混合，P8 溶液由等體積P7 溶液與P9 溶液混合。參考NCCLS 標準和指南CLSI EP6-A[15]，檢測9 個樣本，每個樣本設4 次生物學重復，取均值，將樣本測定濃度的平均值與樣本理論濃度采用最小二乘法進行線性擬合（R2＞0.990可證線性）。

1.2.4 精密度 EP05-A3[16]的單點精度評價研究（single-site precision evaluation study）指南為定量測量程序提供了反映重復性和實驗室內精度估計的一種方法，本研究評估方法即采用該指南提出的雙因素嵌套方差分析（two-way nested ANOVA），即檢測4 個不同濃度樣本和2 個質控，每個樣本進行20 d測試，每天運行2次（上午和下午），每次實驗平行測定2 次（20×2×2 設計），計算重復性、室內精密度的CV值。

1.2.5 干擾因素 參考CLSI EP07[17]中對于干擾因素實驗的理論指導，本研究分別采用已知濃度的低值和高值測試樣本，在樣本中分別加入不同濃度的血紅蛋白（最終濃度為1、3、5、7 mg·mL-1）、膽紅素（最終濃度為30、75、150、300 mg·L-1）、甘油三酯（最終濃度為1.5、2.5、5.0、7.5 mmol·L-1），以加入干擾物前理論濃度和加入干擾物質后的測試濃度的相對偏差為衡量指標，評價上述干擾物質對血清淀粉樣蛋白A測定的影響。相對偏差計算公式為：RD（%）=（測定濃度-理論濃度）/理論濃度×100%。

1.2.6 HOOK 效應 HOOK 效應是指當檢測高劑量樣本時會出現(xiàn)假低值甚至假陰性的結果，影響實驗結果，因此，臨床檢測要避免此類情況的發(fā)生。用陰性血清將血清淀粉樣蛋白A抗原稀釋成濃度為1、10、100、1 000、10 000 mg·L-1的參考品進行檢測，評價是否發(fā)生HOOK效應。

1.2.7 方法學比較 由于西門子試劑盒在國內市場的認可度較高，本研究采用該企業(yè)開發(fā)的基于散射比濁法的血清淀粉樣蛋白A 測定試劑盒與本研究建立的方法進行臨床樣本對比檢測，以評價2 種方法的等效性。參考CLSI EP 09-A3[18]中的離群值計算及偏倚分析和回歸分析比較方法，對150 份來自常規(guī)診斷的匿名血清樣本進行測試。記錄測試結果，并對一致性進行分析評估。

1.2.8 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計分析采用OriginPro 9.0和MedCalc 19.3.1 軟件。用Bland-Altman 一致性分析來評判實驗法與西門子試劑盒（散射比濁法）之間的偏移。

2 結果與分析

2.1 裸磁珠與血清淀粉樣蛋白A抗體2偶聯(lián)效果的檢驗

由圖1和圖2可知，當每個測試磁珠添加量恒定時，發(fā)光值隨抗體添加量的增加而大體上呈現(xiàn)增加趨勢（經線性擬合后，以添加磁珠量12 μg·well-1的曲線為例，r=0.979）；另一方面，對于相同抗體添加量的磁珠，發(fā)光值隨著磁珠添加量的增加也呈現(xiàn)增加趨勢（經線性擬合后，以血清淀粉樣蛋白A 抗體2 添加量200 ng·well-1曲線為例，r=0.999），表明，血清淀粉樣蛋白A 抗體2 與磁珠成功偶聯(lián)。

圖1 血清淀粉樣蛋白A抗體添加量與相對發(fā)光單位（RLU）的關系Fig 1 Relationship between serum amyloid antibody addition and relative light escence unit(RLU)

圖2 磁微粒添加量與相對發(fā)光單位（RLU）的關系Fig 2 Relationship between magnetic particle addition and relative light emitting unit(RLU)

2.2 空白限和檢出限

經EP 文件所述規(guī)則計算，本方法空白限為0.6 mg·mL-1，檢出限為1.0 mg·mL-1。

2.3 線性范圍

對原始檢測數(shù)據(jù)進行初步目測線性檢查和離群值檢驗，經格魯布斯(Grubbs)檢驗未發(fā)現(xiàn)有離群點。將數(shù)據(jù)用最小二乘法線性擬合，擬合圖如圖3 所示，回歸線的線性擬合方程為y=1.017 4x-0.065 5，線性區(qū)間內線性相關系數(shù)R2=0.999＞0.995，因此，線性范圍為1～100 mg·L-1。

圖3 線性范圍的評估Fig.3 Evaluation of the learar range

2.4 精密度驗證

本研究參考EP文件單點精度評價研究，采用20×2×2 設計。離群值檢驗使用格魯布斯（Grubbs）檢驗法。離群值剔除后，按照EP 文件所述精密度相關公式計算結果，結果如表1所示，在運行內（批內）因素引起的變異性的“重復性”評估中，SD 值和CV 值均＜10%，表明在其他變化來源最小的條件下，短時間內使用本研究檢測體系檢測樣本內在變異較小。此外，室間精密度評估中的SD 值和CV 值均＜10%，這說明實驗室內運行和日常因素導致的變異性也較小。綜上所述，這2種變異評估結果均可表明本研究體系可滿足常規(guī)臨床檢測要求。此外，在臨床應用中，通過分析精度評估結果，也可作為儀器或故障排除工作的依據(jù)。

表1 精密度檢測結果Table 1 Precision test results

2.5 干擾測試

本研究評估了血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯對臨床樣本的潛在干擾程度。臨床樣本中的非顯性溶血中血紅蛋白濃度＜0.5 mg·mL-1（非顯性溶血指肉眼觀察不到溶血的情況，但不能表明樣本中不含血紅蛋白）；輕度和中度溶血血紅蛋白濃度為0.5～5 mg·mL-1；重度溶血血紅蛋白濃度＞5 mg·mL-1。由表2 可知，當血紅蛋白濃度達到7 mg·mL-1時，低值、高值樣本檢測結果的相對偏差絕對值均＜10%，對檢測結果無干擾；膽紅素在正常人血清中的含量范圍為2～8 mg·L-1，但是出生1周內的嬰兒膽紅素范圍為10～120 mg·L-1，EP07第三版中推薦的最高干擾檢測濃度為150 mg·L-1。由表2 可知，當樣本中的膽紅素濃度高達300 mg·L-1時，低值、高值樣本檢測結果的相對偏差絕對值均＜10%，對檢測結果無干擾；臨床樣本中甘油三酯正常高限為1.7 mmol·L-1，EP07 第三版中推薦的最高干擾檢測濃度為2.83 mmol·L-1。由表2可知，當樣本中甘油三酯含量為7.5 mmol·L-1時，低值、高值樣本檢測結果的相對偏差絕對值均＜10%，對檢測結果無干擾。綜上所述，這些常見污染物均不干擾血清淀粉樣蛋白A的測試結果。

表2 不同干擾物質添加量下樣品檢測濃度和理論濃度的相對偏差Table 2 Relative deviation of test concentration and theoretical concentration of samples under the different add amount of interference materials

2.6 HOOK效應測試

HOOK 效應發(fā)生的核心問題在于抗原抗體的量是否匹配，如圖4 所示，以血清淀粉樣蛋白A 抗原稀釋濃度為橫坐標，發(fā)光值為縱坐標，橫縱坐標都取對數(shù)（lg），對該圖進行分析，發(fā)光值隨血清淀粉樣蛋白A抗原含量的增加而增加，后趨于平緩，表明此時抗原含量已達到飽和狀態(tài)；由于血清淀粉樣蛋白A 抗原含量1～100 mg·L-1處于增長趨勢，表明本方法在線性范圍內不產生HOOK效應。

圖4 HOOK效應檢測結果Fig 4 HOOK effect detection results

2.7 方法學比較

本研究臨床評價共檢測血清樣本152 例，其中2 例樣本檢測結果低于對比試劑檢測線性范圍下限，故不納入統(tǒng)計。用本方法（Xi）和西門子試劑（Yi）的測試結果的平均值為X 軸，差值（Xi-Yi）為Y 軸做偏倚圖，并將比值平均值的95%置信區(qū)間設定為2 種檢測試劑的一致性邊界。由圖5 所示，對納入統(tǒng)計的150 例樣本中，界外點數(shù)占比2%（3/150），即超過95%的本方法試劑和西門子試劑測試結果比值在一致性范圍內，表明這2 種試劑的最大比值在臨床上是可以接受的，因此，2種試劑具有良好的一致性。由圖6 可知，線性方程為y=0.993 5x-0.037 3，相關系數(shù)R2=0.987＞0.975，表明2 種試劑盒檢測結果具有較高的一致性，在臨床檢測上可以替代西門子試劑產品。

圖5 測試結果的偏差分析Fig 5 Deviation analysis of the test results

圖6 回歸分析Fig 6 Regression analysis

3 討論

在目前的血清淀粉樣蛋白A 的檢測方法中，西門子的散射比濁法較為常見，認可度較高，但是該法從原理上存在缺陷，檢測時間較長，而且隨著檢測時間的延長，抗原抗體復合物有重新結合的可能，會影響散射值的變化，此外，本底的干擾也是一個不可忽略的因素。散射比濁法的應用目前已逐漸減少；酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測和膠體金檢測也有應用，但是同樣在原理上存在缺陷：酶聯(lián)免疫法重復性差，人工操作造成的干擾因素不可避免；膠體金法除了免疫學實驗存在的缺點外還存在建立定量體系困難的缺點。目前磁微?；瘜W發(fā)光平臺因其高通量、低成本、高靈敏度、適合小型化和高選擇性的優(yōu)點而應用較為廣泛，然而關于血清淀粉樣蛋白A檢測使用磁微?；瘜W發(fā)光法的相關研究較少。有研究者在檢測血清淀粉樣蛋白A 時使用了鏈霉親和素磁珠-生物素體系[19]，但明顯具有生物素干擾問題，而且鏈霉親和素磁珠體系中使用的鏈霉親和素磁珠品種繁多，出廠前雖已做過封閉，但是不能很好地應對未知的非特異性吸附。有研究者采用了辣根過氧化物酶魯米諾系統(tǒng)[20]，結果發(fā)現(xiàn)其發(fā)光效率低，測量本底高，靈敏度受限制?？紤]到上述問題，本研究進行以下改進：一方面選擇裸磁珠為載體，從根本上解決了生物素干擾問題，而且通過抗原包被量的優(yōu)化選擇可以減少未知的非特異性吸附；另一方面選擇使用吖啶酯系統(tǒng)，其光量子產率高、背景低，且與抗體偶合后發(fā)光效率幾乎不受影響。用該方法建立的檢測體系進行分析性能評估，經檢測后的空白限為0.6 mg·L-1，檢測限為1 mg·L-1；在線性實驗中，對數(shù)據(jù)使用最小二乘法進行線性回歸擬合，得到線性相關系數(shù)R2＞0.990，且線性范圍在1～100 mg·L-1，滿足臨床檢測要求。對于精密度評估，以CV表示的重復性、室內精密度很好地反映了數(shù)據(jù)間的離散程度，經計算后的CV值均＜10%，也可滿足臨床檢測要求。此外，本研究還評估了血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯對臨床樣本的潛在干擾程度，基于上述干擾研究可以得出結論，這些常見污染物均不干擾血清淀粉樣蛋白A的測試結果。關于方法學比較實驗結果表明，本研究方法與西門子試劑盒的測量值比值基本在95%置信區(qū)間的一致性界限內波動，證實了二者一致性較優(yōu)，此外，回歸分析結果也表明二者之間的相關性較好，測試結果基本一致，符合EP文件相關要求。

綜上所述，經過評價分析，裸磁珠偶聯(lián)血清淀粉樣蛋白A 抗體，以吖啶酯作為發(fā)光標記物的檢測體系成功建立，且該體系的性能參數(shù)均可滿足臨床檢測要求，常見干擾物不影響檢測，臨床一致性程度高，適用于血清中血清淀粉樣蛋白A 濃度的快速檢測。