呂海超，賈哲康，張文，蔣麗雯，晁玉文，竇文芳

江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122

尿苷二磷酸糖（uridine diphosphate sugar，UDP-糖）是單糖的半縮醛羥基與尿苷二磷酸的末端磷酸基之間脫水縮合而成的化合物。在糖基化反應(yīng)中，糖基轉(zhuǎn)移酶以尿苷二磷酸糖作為主要糖基供體［1-3］。尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖（uridine diphosphate-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）參與透明質(zhì)酸和肝素的生物合成［4-5］。尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate gluase，UDP-Glc）具有組織特異性，能特異性抑制肝臟腫瘤中PRPP合成酶的活性［6］。尿苷二磷酸葡萄糖也是合成某些UDP-糖的基礎(chǔ)物質(zhì)，如尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGlcA）［7-9］。研究表明，長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）JCM1217 表達(dá)的N-乙酰己糖胺激酶（N-acetylhexosamine kinase，NahK）能直接將N-乙酰氨基葡萄糖磷酸化成1-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖［10］，大腸桿菌（Escherichia coli）JM83表達(dá)的尿苷轉(zhuǎn)移酶（uridine transferase，GlmU）可以進(jìn)一步地利用1-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖生成尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖［11］。Zhai等［12］構(gòu)建并表達(dá)了截短GlmU 和NahK 的融合酶，利用此游離酶可一步酶法合成UDP-GlcNAc，經(jīng)凝膠過(guò)濾分離純化后，總收率為77%。Cai 等［13］首次使用雙酶（NahK 和GlmU）系統(tǒng)體外酶法合成了UDP-2-ketoGlc；Zachary 等［14］也利用雙酶（NahK 和GlmU）系統(tǒng)制備了5種C6 取代的UDP-GlcNAc 類(lèi)似物。研究表明，利用生物酶法合成尿苷二磷酸糖具有催化效率高、專(zhuān)一性強(qiáng)和綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)［15］。然而，由于生物酶的純化過(guò)程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)且重復(fù)利用率低，所以迫切需要提高生物酶的重復(fù)利用率。

固定化酶技術(shù)是將游離酶限制在特定的固體材料上，保留其催化活性并可進(jìn)行重復(fù)利用的一種技術(shù)。鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂是將鎳離子螯合到聚丙烯酸酯樹(shù)脂上，進(jìn)而對(duì)帶有HIS 標(biāo)簽的生物酶進(jìn)行親和吸附的固體材料。本文利用鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂與游離酶之間的親和吸附原理，將游離的NahK 和GlmU 固定到鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂上，并采用一鍋法進(jìn)行反應(yīng)（圖1），選取了N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、果糖等6種單糖作為底物參與反應(yīng)，以期得到更多不同種類(lèi)的UDP-糖。

圖1 合成UDP-糖的反應(yīng)路線（以葡萄糖為例）Fig.1 Reaction route of UDP sugar synthesis(taking glucose as an example)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源 蛋白表達(dá)選用的菌株和質(zhì)粒分別是E.coliBL21 和pET-28a。PCR 的上下游引物、目的基因nahK（GenBank：CUM80178.1）和glmU（GenBank：AJE23430.1）均由天霖生物科技（無(wú)錫）有限公司合成?；蛑亟M菌E.coliBL21/pET-28a-nahK和E.coliBL21/pET-28a-glmU均 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.1.2 試劑及儀器 SanPfu PCR擴(kuò)增試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T4 DNA 連接酶、BamHⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；鎳填料及聚丙烯酸酯樹(shù)脂購(gòu)自西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司，其中，鎳填料即鎳螯合高流速瓊脂糖層析介質(zhì)，其產(chǎn)品名稱為Ni seplife 6FF（IDA），包裝規(guī)格為100 mL，聚丙烯酸酯樹(shù)脂（樹(shù)脂上鍵合了亞氨基二乙酸基）的產(chǎn)品名稱為L(zhǎng)X-1000IDA，包裝規(guī)格為1 kg；葡萄糖等單糖購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；腺苷三磷酸購(gòu)自杭州鎧朋生物技術(shù)有限公司；尿苷三磷酸購(gòu)自武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司；Q 柱購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；PCR 儀為蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；NanoDrop 分光光度計(jì)為美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀為安捷倫公司產(chǎn)品，型號(hào)為安捷倫1260；超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀為WATERS 公司產(chǎn)品；紫外檢測(cè)器為上海琪特公司產(chǎn)品；Avance Ⅲ全數(shù)字化核磁共振波譜儀為布魯克公司產(chǎn)品，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、高速冷凍離心機(jī)和冷凍干燥機(jī)為寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到nahK（GenBank：CUM80178.1）和glmU（Gen-Bank：AJE23430.1）的基因序列。以nahK和glmU為模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：F1（5'-CGGGATCCAATCTCGTCGG-3'）、R1（5'-GCGTCGACATGTCCCTCGATATC-3'）、F2（5'-CGGGATCCTCAACGTTTCTTCTG-3'）、R2（5'-GCGTCGACATGTCCCTCGATA-3'）（下劃線為酶切位點(diǎn)）。nahK和glmU的上下游酶切位點(diǎn)均分別為BamH Ⅰ和SalⅠ。

PCR反應(yīng)體系：模板DNA（100 ng）1 μL，上、下游引物（1 μmol·L-1）各1 μL，dNTPs（0.2 mmol·L-1）5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，Pfu DNA聚合酶0.5 μL，用ddH2O 補(bǔ)足體積至50 μL。PCR 反應(yīng)條件 為95 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃150 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

將載體質(zhì)粒pET-28a 和PCR 反應(yīng)后所得目的基因用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，42 ℃熱激90 s，冰浴5 min，從而將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 感受態(tài)細(xì)胞中。挑取菌落PCR 結(jié)果合格的菌，220 r·min-1、37 ℃下?lián)u瓶培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行基因測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果合格的菌液保存在含15%甘油的保菌管中。

1.2.2 NahK、GlmU 的表達(dá) 在50 mL LB 培養(yǎng)基中（含50 μg·mL-1卡那霉素）加入200 μL 保菌管凍存液，220 r·min-137 ℃下培養(yǎng)16 h；以2%的接種量接種至500 mL LB 培養(yǎng)基中（含50 μg·mL-1卡那霉素），220 r·min-137 ℃下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8，加入終濃度0.4 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)，220 r·min-130 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

1.2.3 NahK、GlmU 粗酶液的制備 發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌泥（7 000 r·min-1，4 ℃，14 min）。取4 g 菌泥，加入24 mL 破碎液（20 mmol·L-1Tris，100 mmol·L-1NaCl，pH 7.5）進(jìn)行溶解。利用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，條件為破碎8 s，停息15 s，功率40%，通過(guò)鏡檢判斷破碎是否完全，破碎后即得粗酶液。

1.2.4 菌體量與酶量實(shí)際對(duì)應(yīng)值的測(cè)定 離心粗酶液（15 000 r·min-1，4 ℃，20 min），取上清，使用0.22 μm 濾膜對(duì)上清進(jìn)行抽濾，抽濾后即得上樣緩沖液。選取鎳填料填裝5 mL 柱體積的鎳柱，用平衡液（20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl，pH 7.5）平衡鎳柱后，取由4 g 菌泥處理得到的上樣緩沖液過(guò)柱，再次用平衡液平衡鎳柱后，用洗脫液（20 mmol·L-1Tris，250 mmol·L-1咪唑，500 mmol·L-1NaCl，pH 7.5）洗脫目標(biāo)蛋白，即得NahK 和GlmU純酶液。利用NanoDrop 測(cè)定純酶液中目標(biāo)蛋白濃度，根據(jù)收集的純酶液體積，計(jì)算出純化的酶量，從而得出菌體量和酶量的實(shí)際對(duì)應(yīng)值。

1.2.5 鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂量與酶量實(shí)際對(duì)應(yīng)值的測(cè)定 取2 mL 已純化的NahK 和GlmU 純酶液，分別加入8 mL 純水進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯罄肗anoDrop測(cè)定濃度分別為2.45 mg·mL-1和4.63 mg·mL-1。稱取10 g 聚丙烯酸酯樹(shù)脂倒入布氏漏斗，用純水淋洗至透清，抽干后轉(zhuǎn)移至100 mL小燒杯中。在燒杯中加入15 mL 0.1 mol·L-1NiCl2溶液攪拌5 h，再次轉(zhuǎn)移至布氏漏斗并用純水淋洗至透清，抽干挖出即為鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂。稱取2 份鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂，每份2 g，分別加入10 mL 2.45 mg·mL-1的NahK 純酶液和10 mL 4.63 mg·mL-1的GlmU 純酶液中，4 ℃攪拌1 h，用NanoDrop 測(cè)定固定化以后純酶液中目標(biāo)蛋白濃度，由固定化前后目標(biāo)蛋白的濃度差計(jì)算出鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂量與酶量的實(shí)際對(duì)應(yīng)值。

1.2.6 固定化NahK、GlmU 的制備 依據(jù)菌體量、酶量和鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂量的實(shí)際對(duì)應(yīng)值，在NahK、GlmU 粗酶液（體積均為24 mL）中分別加入8、6 g 鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂。4 ℃攪拌1 h后，將溶液中的鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂分別轉(zhuǎn)移至2 個(gè)布氏漏斗中，用pH 7.5 的磷酸緩沖液淋洗干凈，抽干取出即得固定化NahK、GlmU。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)粗酶液中目標(biāo)蛋白的固定化情況進(jìn)行檢驗(yàn)分析。

1.2.7 總固定化酶量的條件優(yōu)化 以葡萄糖作為基礎(chǔ)底物，在10 mL 反應(yīng)體系中，依次加入0.216 g葡萄糖，0.304 g ATP，7.5 mL 純水，2.5 mL 1 mol·L-1pH 8.0 的Tris 緩沖液，78 μL 1 mol·L-1的氯化鎂，xg固定化NahK（x值的梯度設(shè)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 g）。在35℃、150 r·min-1條件下，反應(yīng)4 h。使用高效液相色譜（high perfomance liquid chromatography，HPLC）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并繪制ATP的消耗量與固定化NahK 量的曲線圖，由ATP 的消耗量來(lái)判定最優(yōu)固定化NahK量。

以葡萄糖作為基礎(chǔ)底物，在10 mL 反應(yīng)體系中，依次加入0.216 g 葡萄糖，0.304 g ATP，7.5 mL純 水，2.5 mL 1 mol·L-1pH 8.0 的Tris 緩沖液，78 μL 1 mol·L-1的氯化鎂，0.071 5 g UTP，5.5 g 固定化NahK，yg 固定化GlmU（y值的梯度設(shè)為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）。在35 ℃、150 r·min-1條件下，反應(yīng)4 h。使用HPLC 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并繪制UDP-葡萄糖的生成量和固定化GlmU量的曲線圖，由UDP-葡萄糖的生成量來(lái)判定最優(yōu)固定化GlmU 量。最優(yōu)固定化NahK 量和最優(yōu)固定化GlmU量的總和即為最優(yōu)總固定化酶量。

1.2.8 總固定化酶酶學(xué)性質(zhì)分析 以葡萄糖作為基礎(chǔ)底物，pH 的梯度設(shè)為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。在10 mL 反應(yīng)體系中，依次加入0.216 g 葡萄糖、0.304 g ATP、7.5 mL 純水、2.5 mL 1 mol·L-1的Tris緩沖液、78 μL 1 mol·L-1的氯化鎂、0.071 5 g UTP、5.5 g 固定化NahK、2.5 g 固定化GlmU。在35 ℃、150 r·min-1條件下，反應(yīng)4 h。使用HPLC 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并繪制總固定化酶酶活與反應(yīng)液pH之間的曲線圖。

以葡萄糖作為基礎(chǔ)底物，溫度的梯度設(shè)為20、25、30、35、40、45 ℃。在10 mL 反應(yīng)體系中，依次加入0.216 g 葡萄糖，0.304 g ATP，7.5 mL 純水，2.5 mL 1 mol·L-1pH 8.0 的Tris 緩沖液，78 μL 1 mol·L-1的氯化鎂，0.071 5 g UTP，5.5 g 固定化NahK，2.5 g 固定化GlmU。在150 r·min-1條件下，反應(yīng)4 h。使用HPLC 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并繪制總固定化酶酶活與反應(yīng)液溫度之間的曲線圖。

1.2.9 總固定化酶的重復(fù)穩(wěn)定性分析 以葡萄糖作為基礎(chǔ)底物，使用同一批總固定化酶重復(fù)反應(yīng)9個(gè)批次。在10 mL 反應(yīng)體系中，依次加入0.216 g葡萄糖，0.304 g ATP，7.5 mL 純 水，2.5 mL 1 mol·L-1pH 8.0 的Tris 緩沖液，78 μL 1 mol·L-1的氯化鎂，0.071 5 g UTP，5.5 g 固定化NahK，2.5 g固定化GlmU。在35 ℃、150 r·min-1條件下，反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，利用布氏漏斗對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，總固定化酶聚集于濾紙表面，用pH 7.5的磷酸緩沖液將總固定化酶淋洗干凈，抽干后取出，準(zhǔn)備投入下一個(gè)批次反應(yīng)。使用HPLC 對(duì)每一批反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并制作UDP-葡萄糖的生成量與反應(yīng)批次之間的曲線圖，通過(guò)UDP-葡萄糖的生成量來(lái)判定總固定化酶的重復(fù)穩(wěn)定性。

以葡萄糖作為基礎(chǔ)底物，將所用固定化酶酶量等量替換成游離酶進(jìn)行反應(yīng)。在10 mL 反應(yīng)體系中，依次加入0.216 g葡萄糖，0.304 g ATP，2.5 mL 1 mol·L-1pH 8.0 的Tris 緩沖液，78 μL 1 mol·L-1的氯化鎂，0.071 5 g UTP，4.5 mL 12.25 mg·mL-1游離NahK，2.2 mL 23.15 mg·mL-1游離GlmU，純水補(bǔ)足10 mL。在35 ℃、150 r·min-1條件下，反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，使用HPLC對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.10 總固定化酶催化UDP-糖反應(yīng) 選取N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、果糖等6種單糖作為底物參與反應(yīng)。在10 mL 反應(yīng)體系中，依次加入終濃度為120 mmol·L-1的單糖，0.304 g ATP，7.5 mL 純水，2.5 mL 1 mol·L-1pH 8.0 的Tris 緩沖液，78 μL 1 mol·L-1的氯化鎂，0.071 5 g UTP，5.5 g 固定化NahK，2.5 g 固定化GlmU。在35 ℃、150 r·min-1條件下，反應(yīng)4 h。使用HPLC對(duì)反應(yīng)情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.11 UDP-糖分離純化 選用強(qiáng)陰離子吸附柱Q柱對(duì)生成的UDP-糖進(jìn)行分離純化。Q柱的填裝體積為25 mL，抽取20 mL 反應(yīng)液，將反應(yīng)液稀釋20倍，調(diào)pH 9.5，紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)設(shè)置為260 nm，使 用20 mmol·L-1Tris 和1 mol·L-1NaCl 對(duì)UDP 糖進(jìn)行梯度洗脫，NaCl 的含量梯度為2%、4%、6%、8%、10%。通過(guò)HPLC 對(duì)洗脫液中的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.12 UDP-糖的檢測(cè)分析方法 利用高效液相色譜儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜分析，色譜柱選用YMC-PACK Polyamine Ⅱ，柱溫設(shè)為25 ℃。紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置為260 nm。流動(dòng)相：A 為超純水，B 為1 mol·L-1KH2PO4，程序：0 min 為0%B，30 min為100%B，60 min為100%B，后運(yùn)行15 min。

利用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)產(chǎn)物的分子量進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）；離子方式：負(fù)離子源；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：20 V；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃。

利用布魯克Avance Ⅲ全數(shù)字化核磁共振波譜儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行核磁共振氫譜分析（1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）；磁場(chǎng)：9.4 T；射頻：600 MHz；樣品用氘代重水溶解；以TMS為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化NahK、GlmU的制備

在誘導(dǎo)表達(dá)NahK、GlmU 后，進(jìn)行蛋白純化和純酶固定化實(shí)驗(yàn)。由表1可知，對(duì)于表達(dá)NahK 的重組菌，通過(guò)鎳柱純化結(jié)果得出1 g 菌泥能表達(dá)20 mg 左右的NahK，1 g 鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂能固定約10 mg NahK，對(duì)于表達(dá)GlmU 的重組菌，1 g菌泥能表達(dá)30 mg 左右GlmU，利用純酶固定化結(jié)果計(jì)算可得1 g 鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂能固定約20 mg的GlmU。

表1 菌體量、酶量和鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂量的實(shí)際對(duì)應(yīng)值Table 1 Actual corresponding values of bacteria amount,enzyme amount and nickel chelated polyacrylate resin amount

根據(jù)菌體量、酶量和鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂量的實(shí)際對(duì)應(yīng)值，利用鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂對(duì)粗酶液中游離NahK 和游離GlmU 進(jìn)行固定，通過(guò)SDS-PAGE（圖2）對(duì)固定化情況進(jìn)行檢驗(yàn)分析。由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的酶信息可知，NahK 條帶大小為38.6 kD，GlmU 條帶大小為43.1 kD。圖中顯示NahK 和GlmU 條帶位置準(zhǔn)確［10-11］，且通過(guò)固定化前后條帶深淺程度，可以看出粗酶液中游離NahK和游離GlmU 均已被鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂固定，即制備了固定化NahK和固定化GlmU。

圖2 SDS-PAGE分析NahK、GlmU固定化情況Fig.2 The immobilization of NahK and GlmU by SDS-PAGE analysis

2.2 總固定化酶量條件優(yōu)化

為探究總固定化酶量的最優(yōu)配比，在相同體系下，設(shè)置不同質(zhì)量的固定化NahK、固定化GlmU進(jìn)行反應(yīng)。在一鍋法反應(yīng)中，固定化NahK參與1-磷酸-糖的生成反應(yīng)，而固定化GlmU 參與UDP-糖的合成反應(yīng)?？偣潭ɑ噶康淖顑?yōu)配比為固定化NahK 最優(yōu)量和固定化GlmU 最優(yōu)量的和。通過(guò)HPLC 對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并制作ATP 的消耗量與固定化NahK 量的曲線圖（圖3A），發(fā)現(xiàn)5.5 g的固定化NahK 基本上已經(jīng)將ATP 消耗完畢，所以固定化NahK 的最優(yōu)量為5.5 g。同時(shí)，由UDP-葡萄糖的生成量和固定化GlmU 量的曲線圖（圖3B）可知，當(dāng)固定化GlmU 的量超過(guò)2.5 g 時(shí)，UDP-葡萄糖的生成量可穩(wěn)定在4.5 mg·mL-1左右，所以固定化GlmU 的最優(yōu)量為2.5 g。綜上所述，總固定化酶量的最優(yōu)配比為5.5 g 固定化NahK 和2.5 g固定化GlmU。

圖3 總固定化酶的條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of total immobilized enzyme conditions

2.3 總固定化酶酶學(xué)性質(zhì)分析

為探究pH和溫度對(duì)總固定化酶酶活的影響，在相同體系下，設(shè)置了不同梯度pH和溫度進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)HPLC 對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析。由圖4A可知，當(dāng)pH 為8.0 時(shí)，UDP-葡萄糖生成量最高，所以將pH 8.0 時(shí)的產(chǎn)物生成量作為對(duì)照，制作總固定化酶酶活與反應(yīng)液pH 之間的曲線圖。pH 低于8.0 時(shí)，總固定化酶酶活迅速下降，pH 高于8.0 時(shí)，總固定化酶酶活下降較為緩慢。由圖4B可知，當(dāng)反應(yīng)液溫度為35 ℃時(shí)，UDP-葡萄糖生成量最高，所以將35 ℃時(shí)的產(chǎn)物生成量作為對(duì)照，制作總固定化酶酶活與反應(yīng)液溫度之間的曲線圖。總固定化酶在25～45 ℃之間可以保持較高的酶活性，而當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，酶活下降明顯?？偣潭ɑ傅淖钸mpH和溫度分別為8.0和35 ℃。

圖4 總固定化酶酶學(xué)性質(zhì)Fig.4 Enzymatic properties of total immobilized enzyme

2.4 總固定化酶的重復(fù)穩(wěn)定性分析

為探究總固定化酶的重復(fù)穩(wěn)定性，在相同體系下，使用同一批總固定化酶重復(fù)反應(yīng)9個(gè)批次。通過(guò)高效液相色譜對(duì)每個(gè)批次的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并制作UDP-葡萄糖的生成量與反應(yīng)批次之間的曲線圖（圖5）。在9個(gè)反應(yīng)批次中，同一批次總固定化酶，前5 個(gè)反應(yīng)批次的UDP-葡萄糖生成量均能保持在4.5 mg·mL-1左右。然而，從第6 個(gè)反應(yīng)批次開(kāi)始，隨著反應(yīng)次數(shù)的增加，總固定化酶的酶活逐漸下降，UDP-葡萄糖生成量隨之減少。在一鍋法合成UDP-糖的重復(fù)反應(yīng)中，總固定化酶可以穩(wěn)定地反應(yīng)5 個(gè)批次，且無(wú)肉眼可見(jiàn)的絮凝現(xiàn)象。在同樣的反應(yīng)體系中，將固定化酶替換成等量游離酶進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于游離酶參與的反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，反應(yīng)液中有肉眼可見(jiàn)的絮凝，且游離酶僅能反應(yīng)一次。使用高效液相色譜對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，UDP-葡萄糖生成量?jī)H為4.2 mg·mL-1，略低于固定化酶所反應(yīng)的生成量。

圖5 總固定化酶重復(fù)穩(wěn)定性分析Fig.5 Stability analysis of total immobilized enzyme

2.5 總固定化酶催化UDP-糖反應(yīng)結(jié)果

為合成不同種類(lèi)的UDP-糖，選取了6 種常見(jiàn)單糖（N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、果糖）作為底物進(jìn)行反應(yīng)。催化結(jié)果如圖6 所示，16.35 min 出現(xiàn)的峰為AMP 和UMP的混合物；28.02 min 出現(xiàn)的峰為UDP；33.95 min出現(xiàn)的峰為ADP；44.01 min 出現(xiàn)的峰為UTP；57.22 min出現(xiàn)的峰為ATP。

由圖6可知，在17.25 min出現(xiàn)了新峰，初步判定為新生成的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖；在18.69 min出現(xiàn)了新峰，初步判定是新生成的UDP-葡萄糖；在18.81 min 出現(xiàn)了新峰，初步判定是新生成的UDP-甘露糖。前3 種單糖參與的反應(yīng)中，ATP 和UTP 均被消耗完全，且有新峰出現(xiàn)，表明N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖均可以參與一鍋法反應(yīng)。后3 種單糖參與的反應(yīng)中，ATP 和UTP 均未被消耗完全，且無(wú)新峰出現(xiàn)，表明葡萄糖醛酸、半乳糖和果糖均無(wú)法參與一鍋法反應(yīng)。

圖6 不同單糖作為底物的合成情況Fig.6 Synthesis of different monosaccharides as substrates

2.6 UDP-糖的分離純化結(jié)果

選用Q 柱對(duì)新生成的UDP-糖進(jìn)行分離純化，將20 mL 反應(yīng)液稀釋20 倍以降低樣品的離子濃度，增大UDP-糖的吸附量。使用20 mmol·L-1Tris和1 mol·L-1NaCl 對(duì)UDP-糖進(jìn)行梯度洗脫后，經(jīng)HPLC 檢測(cè)顯示（圖7），80 mmol·L-1的NaCl 可以將UDP-糖洗脫下來(lái)，且3種UDP-糖的純度均達(dá)到90%以上；同時(shí)，UDP-GlcNAc、UDP-Glc 和UDPMan的純化起始量均為90 mg，純化后產(chǎn)物的量分別為80.2、78.5和78.8 mg，產(chǎn)物得率均超過(guò)85%。

圖7 UDP-糖的分離純化Fig.7 Separation and purification of UDP sugar

2.7 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

對(duì)純化后的UDP-糖做進(jìn)一步的液質(zhì)聯(lián)用分析，檢測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量。UDP-GlcNAc、UDPGlc、UDP-Man 的理論相對(duì)分子質(zhì)量分別為607、566、566。由于采用的是負(fù)離子源，失去了一個(gè)氫，所以實(shí)際的檢測(cè)值依次應(yīng)該是606、565、565，這與質(zhì)譜圖（圖8）顯示的檢測(cè)值一致。因?yàn)闃悠窛舛冗^(guò)高，所以在1 131 m·z-1（或1 213 m·z-1）處產(chǎn)生了二聚體準(zhǔn)分子離子峰，這也能側(cè)面驗(yàn)證實(shí)際檢測(cè)值的可靠性。

圖8 UDP-糖的LC-MS分析Fig.8 LC-MS analysis of UDP sugar

2.8 核磁共振氫譜分析（1H-NMR）

將UDP-糖純化后，進(jìn)行透析凍干，進(jìn)一步采用核磁共振氫譜法來(lái)分析UDP-糖的結(jié)構(gòu)。以TMS為內(nèi)標(biāo)，使用重水進(jìn)行溶解，測(cè)定結(jié)果如圖9所示。UDP-GlcNAc 共有25 個(gè)氫，其中有7 個(gè)活潑氫會(huì)被氘取代，所以理論上只有18 個(gè)氫能夠被檢測(cè)到，實(shí)際積分結(jié)果與理論一致。借助MNova 模擬的氫譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在3 600 Hz 處的積分個(gè)數(shù)與模擬一致，均為3 個(gè)氫。同時(shí)，由于UDPGlcNAc 已經(jīng)過(guò)Q 柱純化及透析凍干，純度較高，且乙酰基上甲基的氫會(huì)在化學(xué)位移為1 200 Hz處形成共振峰，共振峰的實(shí)際積分結(jié)果為3個(gè)氫，與理論相符，所以綜合說(shuō)明生成的物質(zhì)是UDPGlcNAc。

圖9 UDP-糖的1H-NMR分析Fig.9 1H-NMR analysis of UDP sugar

UDP-Glc 共有22 個(gè)氫，其中有7 個(gè)活潑氫會(huì)被氘取代，如圖9所示，所以理論上共有15個(gè)氫能夠被檢測(cè)到，實(shí)際積分結(jié)果與理論一致。同時(shí)，借助MNova模擬的氫譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在3 600 Hz處的積分個(gè)數(shù)與模擬的一致，均為3個(gè)氫，綜合說(shuō)明生成的物質(zhì)是UDP-Glc。

UDP-Man 與UDP-Glc 的區(qū)別僅在于1 個(gè)羥基位置的不同。由圖9 可知，UDP-Man 的氫譜中有15 個(gè)氫能夠被檢測(cè)到，實(shí)際積分結(jié)果與理論一致。同時(shí)借助MNova 模擬的氫譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在3 600 Hz處的積分個(gè)數(shù)與模擬的一致，均為3個(gè)氫，綜合說(shuō)明生成的物質(zhì)是UDP-Man。

3 討論

UDP-糖是糖的活化形式，作為糖基供體參與糖基化反應(yīng)。UDP-糖在肝素和透明質(zhì)酸的生物合成中發(fā)揮重要作用［16-18］。國(guó)內(nèi)對(duì)于UDP-糖的合成研究相對(duì)較少，且其市場(chǎng)價(jià)格相對(duì)高昂?，F(xiàn)今UDP-糖的合成方式大多采用生物酶法。雖然生物酶催化效率較高，但是酶的純化過(guò)程繁瑣、耗時(shí)耗力，而且生物酶對(duì)pH和溫度比較敏感［19］。固定化酶技術(shù)可更好地利用生物酶進(jìn)行多次反應(yīng)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值［20-23］。本實(shí)驗(yàn)利用鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂親和固定游離的NahK 和GlmU，不僅省去了純化等繁瑣步驟，也提高了酶的重復(fù)利用率。固定化酶技術(shù)為UDP-糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新思路和新方向。

為了合成更多不同種類(lèi)的UDP-糖，本研究選取了N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、果糖等6種常見(jiàn)單糖作為底物參與反應(yīng)。雖然合成了UDP-Glc、UDP-GlcNAc 和UDP-Man，但是葡萄糖醛酸、半乳糖和果糖卻無(wú)法參與一鍋法反應(yīng)。葡萄糖醛酸有一個(gè)羧基，這可能是它無(wú)法參與反應(yīng)的原因。半乳糖和葡萄糖是差向異構(gòu)體，僅4號(hào)位羥基的位置不同，可能由于4 號(hào)位羥基的空間構(gòu)象導(dǎo)致了NahK 無(wú)法捕捉半乳糖。果糖的不飽和氧在2 號(hào)位，而葡萄糖的不飽和氧在1 號(hào)位，不飽和氧位置的不同可能是導(dǎo)致反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行的原因；同時(shí)，蛋白膠結(jié)果顯示，NahK 和GlmU 的固定化效果不高，為了提高酶的利用率，后期可以嘗試不同的固定化條件，如將鎳離子更換成銅離子、鋅離子或鈷離子，也可深入探究pH 和溫度對(duì)酶固定化效果的影響。本研究的反應(yīng)體系為10 mL，放大中試的相關(guān)實(shí)驗(yàn)尚未深入展開(kāi)，這也是本研究的不足之處。

本研究以鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂親和固定游離的NahK和GlmU，結(jié)果表明，鎳螯合聚丙烯酸酯樹(shù)脂對(duì)游離NahK 和GlmU 的實(shí)際載量分別為10 mg·g-1和20 mg·g-1?？偣潭ɑ噶康淖顑?yōu)配比為5.5 g 固定化NahK 和2.5 g 固定化GlmU?？偣潭ɑ傅淖钸mpH 和溫度分別為8.0 ℃和35 ℃，且在9 個(gè)反應(yīng)批次中能夠穩(wěn)定反應(yīng)5 個(gè)批次。基于固定化酶技術(shù)，采用一鍋法反應(yīng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的兩步法反應(yīng)，合成了UDP-Glc、UDP-GlcNAc 和UDPMan。利用Q 柱對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，3 種UDP-糖的純度均達(dá)到90%以上，且產(chǎn)物得率均超過(guò)85%。對(duì)純化后的3 種UDP-糖進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，UDP-Glc、UDP-GlcNAc 和UDP-Man 的相對(duì)分子質(zhì)量分別為566、607、566。通過(guò)進(jìn)一步的核磁共振氫譜檢測(cè)，驗(yàn)證3 種UDP-糖的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與理論一致。