黃赳，師雙峰，張二特，李梅，于躍，劉昱輝

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

氮是葉綠素、核酸和氨基酸的重要組成部分，是植物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，通常情況下，施用氮肥會(huì)顯著促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。硝酸鹽是大多數(shù)陸生植物的主要氮源[1]，硝酸鹽在土壤中的分布是不均勻的，差異可達(dá)100 倍以上[2]。植物中有兩個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（nitrate transport system，NTS），分別為高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（high-affinity transport system，HATS）和低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（low-affinity transport system，LATS）[3-4]。當(dāng)外界硝酸鹽濃度大于1 mmol·L-1時(shí)，植物利用LATS 吸收硝酸鹽；當(dāng)外界硝酸鹽濃度低于1 mmol·L-1時(shí)，植物利用HATS 系統(tǒng)吸收硝酸鹽[5]。NRT 是植物根系從土壤中吸收并在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽的關(guān)鍵蛋白，根據(jù)其作用環(huán)境的不同分為NRT1 蛋白家族和NRT2蛋白家族。大部分的NRT2均屬于HATS 蛋白家族，大部分的NRT1 均屬于LATS 蛋白家族[6]。NRT 蛋白在高等植物中普遍以多基因家族的形式存在，不同的NRT 蛋白表達(dá)部位不同,功能也存在明顯差異，如AtNRT1.2在根表皮細(xì)胞中表達(dá)，負(fù)責(zé)從土壤中吸收硝酸鹽[7]；AtNRT1.4在葉中表達(dá),與硝酸鹽積累有關(guān)[8]；AtNRT1.5在根部表達(dá)，主要功能是促進(jìn)硝酸鹽向地上部分運(yùn)輸[9]。

水稻是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中氮肥使用量最多的作物，氮肥的過(guò)量施用雖然提高了水稻的產(chǎn)量但也引起了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題[10-11]。已有研究表明，在轉(zhuǎn)基因水稻中組成型表達(dá)OsNRT2.1，可促進(jìn)水稻對(duì)硝酸鹽的吸收和水稻的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，但對(duì)水稻的產(chǎn)量無(wú)明顯影響[12]，而過(guò)表達(dá)OsNRT2.3b的水稻在中 氮（135 kg·N·hm-2）條件下，產(chǎn)量增加了22.78%[13]。克隆NRT基因，培育過(guò)表達(dá)NRT轉(zhuǎn)基因水稻，在保證水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的前提下，減少氮肥施用，將極大減輕對(duì)自然環(huán)境造成的污染和壓力。

矮珍珠（Glossostigma elatinoides）是透骨草科水生植物，其在美國(guó)甚至被認(rèn)定為外來(lái)入侵物種[14]。矮珍珠根系的生長(zhǎng)環(huán)境與水稻類似，因此矮珍珠根部特異表達(dá)的NRT 蛋白在功能上可能與水稻中的NRT 更接近，但相比水稻，矮珍珠還具有快速生長(zhǎng)的特性，因此從矮珍珠這一新物種中克隆根部特異表達(dá)的NRT基因，對(duì)培育氮高效利用轉(zhuǎn)基因水稻具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)速生水生植物的篩選，發(fā)現(xiàn)矮珍珠具有生長(zhǎng)速度快、耐低氮等特點(diǎn)。本研究從矮珍珠中克隆了GeNRT2.1基因，并對(duì)GeNRT2.1表達(dá)的組織特異性和功能進(jìn)行了初步的研究，旨在通過(guò)對(duì)GeNRTs基因的克隆和研究，豐富NRT基因資源，為培育氮高效利用轉(zhuǎn)基因水稻提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用水生植物材料為小水榕（Anubias nana）、金魚藻(Ceratophyllum demersum）、黑藻（Hydrilla verticillata）、矮珍珠（Glossostigma elatinoides）、香菇草（Hydrocotyle vulgaris）、虎耳草（Saxifraga stolonifera）、南美青竹（Tradescantia albiflora）、綠菊（Cabomba caroliniana）、百葉草（Pterylae Pavo Mutici）、草茨藻（Najas graminea）、宮廷草（Rotala rotundifoliavar）、草甸排草（Lysimachia nummularia）、馬來(lái)眼子菜（Potamogeton wrightii）、小對(duì)葉草（Bacopa monnieri）、青蘋果草（Cardamine lyrata）、直立石龍尾（Limnophila erecta）、紅菊（Cabomba piauhyensis）、水蓑衣（Hygrophila ringens）、水芹（Oenanthe javanica）、五色莧（Alternanthera bettzickiana）。野生型多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）菌株WT、Leu-YNT雙突變型多形漢遜酵母突變體Δynr以及酵母穿梭載體pYNR-EX 均由海南大學(xué)江行玉教授惠贈(zèng)。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列詳見表1。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 SMARTer?RACE 5'/3' Kit 購(gòu)自GeneStar 公司；熒光定量qPCR SYBR 試劑和HiScript?ⅡQ RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Bio-Rad PTC-200 PCR 儀購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司；ABI 7500 Fast 熒光定量PCR 儀購(gòu)自北京北嘉美儀生物科技有限公司，蔡司激光掃描共聚焦顯微鏡LSM700 購(gòu)自北京悠然睿智系統(tǒng)技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水生植物的篩選和生長(zhǎng)速度檢測(cè) 將河沙淘洗干凈，滅菌后平鋪至塑料托盤底部，厚度約為2 cm，注入自來(lái)水，使水沒過(guò)河沙約0.3 cm。選擇生長(zhǎng)旺盛、健康狀態(tài)良好的20 種水生植物，用鋒利、無(wú)菌的手術(shù)刀片精準(zhǔn)切割0.5 g 健壯莖枝（確保傷口整齊，且切口與莖枝垂直），快速移栽到蛭石中，置于光照培養(yǎng)箱中，16 h 光照/8 h 黑暗，26/20°C，光照強(qiáng)度22 000 Lux，保持濕度100%。每7天測(cè)定1 次濕重，均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，連續(xù)觀察4周。

1.2.2 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì) 從NCBI 上下載不同植物的NRT 蛋白的氨基酸序列并利用DNAMAN 進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同植物NRT 的氨基酸序列存在保守區(qū)域，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，分別是DeF1/DeR1/、DeF2/DeR2 和DeF3/DeR3，通過(guò)檢索GenBank，未發(fā)現(xiàn)矮珍珠NRT的cDNA和氨基酸序列，為了克隆矮珍珠NRT基因，以根為材料，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用簡(jiǎn)并引物DeF1/DeR1進(jìn)行Touch-down PCR擴(kuò)增，引物序列詳見表1。

1.2.3GeNRT2.1基因的克隆 采用Trizol 法，從矮珍珠的根部提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物DeF1/DeR1/、DeF2/DeR2、DeF3/DeR3 和TaqDNA 聚合酶，通過(guò)Touch-down PCR技術(shù)從cDNA 中克隆GeNRT基因的CDS。反應(yīng)體系（50 μL）為：10×TaqMix Buffer 5 μL，模板cDNA 1 μL，10 μmol?L-1上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，2 mmol?L-1dNTP5 μL，ddH2O 36 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；94 ℃30 s，50～60 ℃30 s，72 ℃1 min，共30個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)的退火溫度降低1℃）；72 ℃10 min。對(duì)獲得的EST 系列進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)EST序列重新設(shè)計(jì)序列特異性引物，進(jìn)行3'RACE 和5'RACE 試驗(yàn)，根據(jù)中間序列、3'RACE序列和5'RACE 序列進(jìn)行拼接，獲得完整的基因序列，利用Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)和分析。

1.2.4GeNRT2.1基因表達(dá)的組織特異性分析以生長(zhǎng)狀態(tài)一致的矮珍珠為材料，分別用2.0 mmol?L-1和0.5 mmol?L-1硝酸鈉處理2 h，采用Trizol 法分別提取根、莖和葉的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，以Actin5 和Actin3 為內(nèi)參基因引物，以qGeNRT5 和qGeNRT3為GeNRT2.1的特異性引物，采用RT-PCR 方法對(duì)GeNRT2.1進(jìn)行基因表達(dá)量的分析，檢測(cè)目的基因在矮珍珠不同組織中的表達(dá)。PCR反應(yīng)條件和操作步驟詳見說(shuō)明書。

1.2.5 GeNRT2.1 的亞細(xì)胞定位 為構(gòu)建用于亞細(xì)胞定位分析的植物表達(dá)載體，設(shè)計(jì)引物NRT-F和NRT-R，以矮珍珠cDNA為模板，PCR 擴(kuò)增GeNRT2.1完整的cDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切后，連接到經(jīng)相同酶切處理后的載體pRTL-2-GFP中，構(gòu)建得到以CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GeNRT2.1-GFP融合蛋白基因表達(dá)的植物表達(dá)載體p35S::GeNRT2.1-GFP。將其轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中[15]。轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體，25 ℃避光誘導(dǎo)18 h 后，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP 熒光在擬南芥原生質(zhì)體中的分布，確定GeNRT2.1 的亞細(xì)胞定位。

1.2.6 酵母穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建 以p35S::GeNRT2.1-GFP為模板，利用引物GeNRT5 和GeNRT3（表1），PCR 擴(kuò)增GeNRT2.1基因，PCR 反應(yīng)體系同1.2.3，反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。經(jīng)SalⅠ/SpeⅠ雙酶切連接到載體pYNR-EX上，獲得以酵母YNR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GeNRT2.1表達(dá)的酵母穿梭表達(dá)載體pYNR::GeNRT2.1。

1.2.7 基因功能互補(bǔ)試驗(yàn) 分別將pYNR-EX和pYNR::GeNRT2.1用電擊法轉(zhuǎn)入雙突變型多形漢遜酵母Δynt的感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于含100 mg?L-1氨芐霉素的YNGH（0.17%無(wú)氨基酸無(wú)硫酸的酵母氮源基礎(chǔ)，2%葡萄糖，5 mmol?L-1NH4Cl）平板上，37 ℃培養(yǎng)3～4 d，挑取單菌落，以qGeNRT5 和qGeNRT3（表1）為引物，用PCR 擴(kuò)增篩選獲得酵母陽(yáng)性克隆，PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.4。

表1 本研究所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.2.8pYNR::GeNRT2.1酵母吸收硝酸鹽的速率測(cè)定 利用紫外分光光度法測(cè)定培養(yǎng)基中的硝酸鹽濃度，將YNR::GeNRT2.1酵母在YGNH 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至過(guò)飽和，離心取菌體，加入YG 培養(yǎng)基，37 ℃氮饑餓處理90 min，離心，棄上清，重懸菌體浮于含有不同濃度NaNO3（50、100、250、500、1 000、1 500 μmol?L-1）的YG 培養(yǎng)基中，使酵母濃度達(dá)到10 mg?mL-1，37 ℃培養(yǎng)150 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 速生水生植物的篩選和鑒定

氮素的利用與植物生長(zhǎng)速度密切相關(guān)，為獲得可以在低氮條件下快速生長(zhǎng)的植物材料，本研究首先對(duì)20 種水生植物進(jìn)行了篩選和鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分植物在6～10 d 后長(zhǎng)出新葉。生物量在前2 周增長(zhǎng)最快，第3 周增速變緩，第4 周又快速增加，其中矮珍珠具有非常強(qiáng)的生存能力，可以在純凈水中長(zhǎng)期存活，且無(wú)需向水中添加營(yíng)養(yǎng)液，此外，矮珍珠的生長(zhǎng)速度也較快，可以在2 d 內(nèi)長(zhǎng)出一對(duì)完整葉片。由表2 可知，所有植物中28 d內(nèi)鮮重增加最多的是小水榕、黑藻、金魚藻和矮珍珠，濕重分別增加402.00%、376.00%、362.00%和372.00%。

表2 水生植物的鮮重情況檢測(cè)Table 2 Detection of fresh weight of aquatic plants

2.2 矮珍珠硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因GeNRT2.1的克隆

利用簡(jiǎn)并引物DeF1/DeR1 進(jìn)行Touch-down PCR 擴(kuò)增，得到1 條大小為663 bp 的EST 序列（圖1），在Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)上對(duì)EST 的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與多個(gè)物種的高親和NRT2具有同源性，同源性為70%～80%。根據(jù)該EST 的序列，設(shè)計(jì)3'RACE 和5'RACE 的基因特異性引物H3outer/H3inner 和H5outer/H5inner（表1），通 過(guò)RACE 技術(shù)，分別獲得797 bp 的3'序列和992 bp的5'序列（圖1）。將EST 序列、5'-RACE 序列和3'-RACE 序列進(jìn)行拼接，并在GenBank 上進(jìn)行序列BLAST 檢索和分析發(fā)現(xiàn)，獲得的cDNA 序列的全長(zhǎng)為2 078 bp，包含228 bp 的5'非翻譯區(qū)、254 bp 的3'非翻譯區(qū)以及1 596 bp 的開放閱讀框，該序列可能編碼一個(gè)由530 個(gè)氨基酸組成的NRT2蛋白。在GenBank上檢索NRT2發(fā)現(xiàn)，目前已注冊(cè)的NRT2有51個(gè)，其中植物38個(gè)，藻類5個(gè)，地衣4個(gè)，細(xì)菌3 個(gè)，真菌1 個(gè)，利用MAGE6 進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明該序列與煙草NRT2.1的序列相似度較高（圖2），推測(cè)本研究已成功從矮珍珠中克隆得到NRT2基因，將其命名為GeNRT2.1，并在Genbank上進(jìn)行了注冊(cè)（登錄號(hào)：KX230796.1）。

圖1 GeNRT2.1基因的克隆Fig.1 Cloning of GeNRT2.1 gene

圖2 GeNRT2.1的進(jìn)化樹分析Fig.2 Evolutionary tree analysis of GeNRT2.1

2.3 矮珍珠GeNRT2.1的生物信息學(xué)分析

NRT2 蛋白多數(shù)由500 多個(gè)氨基酸組成，通過(guò)中間的親水環(huán)將12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域等分為兩組[16]，C 端和N 端以及親水環(huán)均位于胞質(zhì)一側(cè)[17]。使用TMHMM-2.0 對(duì)GeNRT2.1 進(jìn)行蛋白質(zhì)的跨膜螺旋預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示GeNRT2.1 具有親水的N 端和C 末端，中間一個(gè)較長(zhǎng)的親水環(huán)將中部12 個(gè)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域分隔成兩組各6 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3A）。通過(guò)SOPMA 對(duì)GeNRT2.1 的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示GeNRT2.1 由170 個(gè)α 螺旋、130 個(gè)延伸鏈，59 個(gè)β 折疊和171 個(gè)自由卷曲組成（圖3B）。對(duì)GeNRT2.1 的氨基酸序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，12個(gè)疏水區(qū)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列位置分別為67～87、102～118、131～151、159～179、192～211、224～243、281～301、316～336、352～372、381～401、410～430 和441～461（圖3C）。GeNRT2.1 中間的親水區(qū)（244～280，37 個(gè)氨基酸）將GeNRT2.1 的12 個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域分為兩組，每組6 個(gè)，這與NRT2 家族成員的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征完全符合。此外，在GeNRT2.1 的2 跨膜區(qū)與3 跨膜區(qū)之間還存在1 個(gè)GAVCDLLGPR序列，由于基元序列（G-x-x-x-D-x-x-G-x-R）是NRT蛋白所特有的序列，在MFS 超家族成員中高度保守，說(shuō)明克隆得到的GeNRT2.1可能是硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因。

圖3 GeNRT2.1的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Amino acid sequence and structure analysis of GeNRT2.1

2.4 GeNRT2.1在矮珍珠中的表達(dá)特性分析

為研究GeNRT2.1對(duì)硝酸鹽的響應(yīng)以及在矮珍珠中表達(dá)的組織特異性，分別將矮珍珠放置于含有2.0 mmol?L-1硝酸鈉和0.5 mmol?L-1硝酸鈉的水溶液中處理，觀察根、莖、葉中GeNRT2.1的表達(dá)情況。qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，2.0 mmol?L-1和0.5 mmol?L-1硝酸鹽處理的矮珍珠，GeNRT2.1在根中的表達(dá)量均最高，其次是葉和莖，此外，0.5 mmol?L-1硝酸鹽處理的矮珍珠根、葉、莖中GeNRT2.1的表達(dá)量分別為2.0 mmol?L-1硝酸鹽處理對(duì)應(yīng)樣本中GeNRT2.1表達(dá)量的1.89、1.93 和2.07倍（圖4）。以上結(jié)果說(shuō)明GeNRT2.1編碼蛋白為高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要在根中表達(dá)并發(fā)揮相關(guān)功能。

圖4 GeNRT2.1在矮珍珠中表達(dá)的組織特異性Fig.4 Tissue specific expression of GeNRT2.1 in Glossostigma elatinoides

2.5 GeNRT2.1的亞細(xì)胞定位

植物從土壤中吸收硝酸鹽，需要位于膜上的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與[18]。最早發(fā)現(xiàn)的擬南芥At-NRT1.1 就是定位于細(xì)胞膜上的，屬于質(zhì)子依賴的硝酸鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[19]。為研究GeNRT2.1 的亞細(xì)胞定位，利用pRTL-2載體構(gòu)建了以35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GeNRT2.1-GFP 融合蛋白表達(dá)載體p35S::GeNRT2.1-GFP，將其轉(zhuǎn)化入新鮮制備的擬南芥原生質(zhì)體中，孵育18 h 后用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)GeNRT2.1-GFP 融合蛋白定位于原生質(zhì)體的細(xì)胞膜上（圖5）。

圖5 GeNRT2.1在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of the GeNRT2.1 in Arabidopsis thaliana protoplasts

2.6 GeNRT2.1對(duì)YNT基因缺陷型酵母的影響

將4 種 酵 母（Δynt、WT、ΔYNR-EX和YNR::GeNRT2.1）分別接種于含有0.5 mmol?L-1硝酸鹽的YGNH 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取菌液，用分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，分別為0.05±0.03、1.48±0.05、0.05±0.03、1.31±0.04（圖6）?；蛉毕菪徒湍甫nt由于不能吸收硝酸鹽，因此不能正常生長(zhǎng)，但GeNRT2.1能使缺陷型酵母Δynt恢復(fù)生長(zhǎng)，表明GeNRT2.1在功能上能夠與酵母內(nèi)源的NRT互補(bǔ)，具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。

圖6 GeNRT2.1對(duì)基因缺陷型酵母Δynt生長(zhǎng)的影響Fig.6 The effect of GeNRT2.1 on the growth of gene-deficient yeast Δynt

每30分鐘用分光光度計(jì)測(cè)定A220和A275的值，并計(jì)算出酵母對(duì)硝酸鹽的吸收速率，繪制酵母吸收速率曲線（圖7）。按照Km值等于最大吸收速率50%時(shí)硝酸鹽濃度計(jì)算，GeNRT2.1的Km值為140 μmol?L-1。已知高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Km＜1 000 μmol?L-1，低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Km＞1 000 μmol?L-1，說(shuō)明GeNRT2.1編碼高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

圖7 GeNRT2.1吸收硝酸鹽的速率Fig.7 Rate of nitrate absorption by GeNRT2.1

3 討論

硝酸鹽是植物從土壤中吸收氮素營(yíng)養(yǎng)的主要形式，而硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT 是該過(guò)程的執(zhí)行者和主要限制因子，此外NRT 蛋白也在硝酸鹽從根到地上部的運(yùn)輸過(guò)程起關(guān)鍵作用，表明NRT 蛋白能否發(fā)揮作用與作物的形態(tài)建成、干物質(zhì)積累和產(chǎn)量形成直接相關(guān)。不同物種來(lái)源的NRT 蛋白，在幫助植物吸收硝酸鹽的能力上存在明顯差異。有報(bào)道表明，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以有效提高受體植物的生物量，但不能有效提高作物的產(chǎn)量[20]。但范曉榮等[13]報(bào)道，在田間試驗(yàn)中，增加OsNRT2.3b的表達(dá)可使籽粒產(chǎn)量和氮肥利用效率提高40%。說(shuō)明硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是利用遺傳改良技術(shù)提高作物氮素利用效率的關(guān)鍵蛋白，同時(shí)說(shuō)明不同來(lái)源的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)植物的產(chǎn)量具有不同的作用。

本研究結(jié)果表明，28 d內(nèi)，矮珍珠鮮重由0.5 g增加到2.31 g，增加了3.62倍，是20種供試植物中鮮重增加速度比較快的植物，其鮮重增加速度僅次于小水榕、黑藻和金魚藻，推測(cè)其快速生長(zhǎng)的能力可能與其能夠更好地利用水中的氮素有關(guān)。此外，矮珍珠根系的生長(zhǎng)環(huán)境與水稻類似，矮珍珠根部特異表達(dá)的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在功能上可能與水稻更接近。GenBank檢索未發(fā)現(xiàn)矮珍珠NRT基因及其氨基酸序列，本研究通過(guò)對(duì)不同物種中NRT蛋白保守區(qū)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼530 個(gè)氨基酸，具有親水的N 端和C 末端，中部12 個(gè)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，由中間一個(gè)大的親水環(huán)分隔成兩組各6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這與NRT2家族成員的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征完全符合。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，GeNRT2.1與煙草NRT2.1 的序列相似度最高，該蛋白屬于NRT2蛋白家族。

植物通過(guò)位于細(xì)胞膜上的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從土壤中吸收硝酸鹽。DsNRT3.1 主要定位于擬南芥根毛細(xì)胞的質(zhì)膜上[21]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的GeNRT2.1亞細(xì)胞定位研究結(jié)果表明GeNRT2.1定位于細(xì)胞膜上，這一結(jié)果符合離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大部分是膜蛋白的特征。此外，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥根系對(duì)硝酸鹽攝取的調(diào)控主要依賴于NRT2.1/NAR2.1的協(xié)同作用[22]，但GeNRT2.1 是否需要與NAR2.1存在協(xié)同作用尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

將GeNRT2.1轉(zhuǎn)入YNT基因缺失的缺陷型酵母Δynt中進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)GeNRT2.1的Δynt酵母無(wú)論在低濃度硝酸鹽還是在高濃度硝酸鹽條件下均能正常生長(zhǎng)和繁殖，其生長(zhǎng)情況與WT 酵母一致，表明GeNRT2.1在功能上能夠與酵母內(nèi)源NRT互補(bǔ)，具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。繪制GeNRT2.1轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)硝酸鹽的吸收曲線并測(cè)定Km值發(fā)現(xiàn)，GeNRT2.1屬于高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，該結(jié)果與GeNRT2.1序列同源性比對(duì)結(jié)果和GeNRT2.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果具有一致性。雖然缺陷型酵母表達(dá)系統(tǒng)提供了一種便捷有效的鑒定目的基因功能的系統(tǒng)，可以幫助人們快速獲得更加有效的NRT基因，但在自然環(huán)境下，植物易受到天氣、土壤耕作條件、田間管理措施等的干擾和影響，因此，缺陷型酵母表達(dá)系統(tǒng)測(cè)定的Km值與實(shí)際情況存在差異。

不同的NRT 根據(jù)其功能的不同表達(dá)部位存在差異。如AtNRT1.3 在花、葉、莖中的表達(dá)均較高[23]，OsNRT1.1B主要在水稻根中表達(dá)[24]。本研究中，GeNRT2.1在根中的表達(dá)量最高，其次是葉，在莖中的表達(dá)量最低。此外，0.5 mmol·L-1硝酸鹽處理后，GeNRT2.1在根、葉、莖中的表達(dá)量分別是2.0 mmol·L-1硝酸鹽處理后的1.89、1.93 和2.07倍，說(shuō)明GeNRT2.1 編碼蛋白主要在根中表達(dá)并行使功能。

綜上所述，從矮珍珠中克隆NRT 蛋白編碼基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化水稻，可培育GeNRT2.1轉(zhuǎn)基因水稻，對(duì)豐富NRT基因資源，培育氮肥高效利用轉(zhuǎn)基因水稻具有重要意義。本課題組已獲得15 株轉(zhuǎn)GeNRT2.1水稻，今后將對(duì)其農(nóng)藝性狀及生理性狀開展進(jìn)一步研究，探究如何獲得氮營(yíng)養(yǎng)高效的遺傳改良作物。