費云燕，楊軍，景德道，林添資，李闖，錢華飛，曾生元，韓華新，龔紅兵

江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 句容212400

聯(lián)合國在《2019 世界人口展望》的報告中指出，2050 年全球人口將增長至97 億，糧食短缺將成為威脅人類生存最嚴重的問題之一［1］。在自然界中，影響糧食產(chǎn)量的因素主要有生物脅迫和非生物脅迫，其中生物脅迫主要包括病害、蟲害和草害等，而雜草危害被認為是影響全球作物產(chǎn)量、品質(zhì)以及糧食安全最主要的因素之一［2］。

雜草具有繁殖和傳播方式多樣、結(jié)實量大、生活周期短、生長迅速、光合作用效率高、適應性廣、再生能力和抗逆性均較強等生物學特性［3］，因而可與作物競爭生存空間、水分、養(yǎng)料和陽光等，進而影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)；同時，雜草常作為病蟲害的中間宿主，可引發(fā)作物發(fā)生病蟲害。此外，雜草會降低土壤“源”的輸入，導致肥沃土地流失，增加耕作成本［4］。據(jù)統(tǒng)計，我國每年雜草發(fā)生面積高達9 700 萬hm2，約為作物種植面積的80%，每年造成的經(jīng)濟損失高達900億美元［5-6］。

雜草防治一直是作物生產(chǎn)中的關鍵環(huán)節(jié)，人工除草是傳統(tǒng)的雜草防治方法，隨著科學技術的發(fā)展與更新，已研制出了機械、物理、生物、化學等除草方法。截至目前，化學除草劑除草是最省時、省力、高效且經(jīng)濟的方式，已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)體系中保證作物豐產(chǎn)的重要舉措［7］。目前，全球除草劑種類繁多，均可通過干擾雜草正常的生理生化過程，如破壞脂肪酸、氨基酸和ATP 的合成，抑制光合作用，阻礙呼吸作用等，使雜草生長受到抑制并最終死亡，從而實現(xiàn)除草的目的［8］。然而，化學除草劑在除草過程中，會傷害農(nóng)作物，施用不當會導致作物減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟損失。同時，由化學除草劑帶來的環(huán)境污染問題也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟需解決的問題。因此，培育抗除草劑作物是解決以上問題最有效的手段，也是育種工作的重要方向。

本文在概述抗除草劑作物育種方法的基礎上，詳細綜述了CRISPR/Cas 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、作用機理、育種應用存在的問題和發(fā)展方向，旨在為今后利用CRISPR/Cas 技術進行抗除草劑作物育種提供理論依據(jù)。

1 抗除草劑作物育種方法

獲得抗除草劑作物的途徑主要包括種質(zhì)資源的收集與鑒定、誘變育種、轉(zhuǎn)基因育種、基因編輯育種等。種質(zhì)資源的收集與鑒定主要是對作物及其野生材料、近源種等進行收集，經(jīng)過除草劑抗性篩選后獲得自然抗性材料，并通過傳統(tǒng)育種手段將抗性基因?qū)朐耘嘧魑镏校摲椒ù嬖诓牧鲜占щy、工作量大、野生材料或近源種與栽培品種存在生殖隔離等問題［9］。誘變育種是傳統(tǒng)育種中獲得抗除草劑作物最有效的方法之一，國際上商業(yè)化的抗除草劑Clearfield、Provisia 系列水稻品種均為人工誘變材料［10］，但該方法存在目標突變率低、誘變種質(zhì)其他性狀較劣質(zhì)、篩選和純化耗時耗力等缺點。轉(zhuǎn)基因育種是將外源抗性基因、靶標基因（超表達）導入作物中以獲得抗除草劑作物的方法，孟山都公司與拜耳公司分別推出的Roundup Ready 和Liberty Link 系列作物均是轉(zhuǎn)基因材料［11］。應用轉(zhuǎn)基因技術培育的農(nóng)作物中，抗除草劑類作物在市場上的占比最高（圖1），但公眾對轉(zhuǎn)基因技術安全性的憂慮及排斥已成為制約其發(fā)展最主要的因素。

圖1 不同轉(zhuǎn)基因性狀占轉(zhuǎn)基因作物種植面積百分比[12]Fig.1 Percentage of different transgenic traits in the planting area of transgenic crops[12]

基因編輯技術是利用序列特異核酸酶（sequence-specific nucleases，SSNs）對生物體內(nèi)特定位點進行靶向修飾的技術，主要包括鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）技術、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術、成簇規(guī)律間隔短回文重復序列與相關蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas）技術（圖2）。ZFN 是利用鋅指核酸酶的DNA 結(jié)合域與Ⅱ型核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割結(jié)合域整合而成，TALEN 的構(gòu)成與ZFN 相似，是由TALE蛋白（DNA 結(jié)合域）與FokⅠ融合而成，這兩類技術均是利用FokⅠ的酶切特性，使特定位點的DNA 雙鏈斷裂（double DNA stranded breaks，DSB），從而誘導細胞的非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復或者同源重組（homologous recombination，HR）修復。由于FokⅠ需要在二聚化狀態(tài)下才具有內(nèi)切酶活性，因此，ZFN 和TALEN 均需要在靶位點兩側(cè)各設計1個DNA 結(jié)合蛋白，表達載體組裝較為繁瑣。此外，鋅指核酸酶的DNA 結(jié)合特異性不高，使得ZFN 技術表現(xiàn)出較為明顯的脫靶效應。雖然TALEN 具有位點結(jié)合特異性高、脫靶效應低的優(yōu)點，但TALEN 蛋白組裝工作量較大，并且編輯效率較低［13-15］。

經(jīng)典的CRISPR/Cas 技術是由人工設計的單鏈引導RNA（single guide RNA，sgRNA）與Cas9 核酸酶組成。sgRNA 特異性引導Cas9 核酸酶對靶位點進行切割，造成DNA 雙鏈斷裂，誘發(fā)DNA 的修復機制（圖2）［15］。該技術無需設計和構(gòu)建DNA識別蛋白，僅需設計sgRNA 即可構(gòu)建CRISPR/Cas表達單元，隨后通過遺傳轉(zhuǎn)化手段直接實現(xiàn)作物目標基因的突變，獲得定點突變材料［16］。CRISPR/Cas 技術與其他技術相比，其操作更簡單、效率更高、穩(wěn)定性和通用性更強、成本更低；同時，載體元件（抗生素標記序列、Cas 序列等）可通過自交、雜交等手段進行剔除，最終獲得目的基因精準編輯的非轉(zhuǎn)基因植株，該材料與自然突變或人工誘變材料具有實質(zhì)等同性［14，17］。CRISPR/Cas系統(tǒng)根據(jù)Cas蛋白的不同可分為2個大類（1類和2類）5 個型（Ⅰ～Ⅴ型）。在干擾靶基因時，1 類CRISPR/Cas（包含Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型）需要多個Cas 蛋白構(gòu)成的多效應復合物協(xié)同完成；2類CRISPR/Cas（包含Ⅱ、Ⅴ型）則僅需1 個Cas 蛋白即可發(fā)揮其核酸內(nèi)切酶功能，結(jié)構(gòu)較簡單，在植物中應用最廣泛的CRISPR/Cas9 和CRISPR/Cpf1 均為2 類系統(tǒng)［18-19］。2015 年，第1 個利用基因編輯技術培育的抗除草劑油菜已被美國監(jiān)管部門認定為非轉(zhuǎn)基因作物，并在該國進行推廣種植［20］。2023 年CRISPR/Cas技術的市場價值預計將達到145.5 億美元［14］。CRISPR/Cas 已成為分子生物學領域最重要的技術之一［9］。

圖2 不同基因編輯系統(tǒng)構(gòu)成及其介導的非同源末端連接與同源重組修復[15]Fig.2 Composition of different gene editing systems and their mediated non-homologous end connection and homologous recombination repair[15]

2 CRISPR/Cas 技術在抗除草劑作物育種中的應用

自2012 年CRISPR/Cas 系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)具有基因編輯潛力以來，CRISPR/Cas 技術已成為全球研究的熱點領域。經(jīng)典的CRISPR/Cas 系統(tǒng)是基于靶位點的雙鏈斷裂，2016 年出現(xiàn)了無需引入雙鏈斷裂的堿基編輯（base editing）技術，該技術能夠?qū)崿F(xiàn)單堿基替換［21］。2019 年引導編輯技術（prime editing）的出現(xiàn)開創(chuàng)了基因精準編輯的新局面，該技術可以實現(xiàn)任意類型的堿基轉(zhuǎn)換、44 bp以內(nèi)的片段插入、80 bp以內(nèi)的片段缺失以及復雜的混合突變等［22］。

2.1 基于雙鏈斷裂的CRISPR/Cas技術及其應用

目前廣泛使用的CRISPR/Cas9 和CRISPR/Cpf1 系統(tǒng)均是基于雙鏈斷裂引起的DNA 修復機制，主要為NHEJ 與HDR。NHEJ 是一種快捷、高效但精準度不高的修復方式，往往會造成切割位點處序列的插入和（或）缺失，引起基因的突變，最終導致靶標基因功能的喪失；HDR 是當雙鏈斷裂處存在同源片段作為模板時，發(fā)生的一種較為精準的修復方式。由于NHEJ 可發(fā)生于幾乎所有的細胞中，因而其在生物體修復時發(fā)生頻率極高，占絕對主導地位；而HDR 僅在特定的細胞周期發(fā)生，其發(fā)生頻率極低。因此，CRISPR/Cas 系統(tǒng)產(chǎn)生的主要突變方式是NHEJ 的隨機插入/缺失突變［23-24］。

利用CRISPR/Cas9 和CRISPR/Cpf1 技術已在多種作物上實現(xiàn)了抗除草劑種質(zhì)資源的創(chuàng)制。Guo 等［25］敲除了水稻中與生長素信號傳導相關的AFB4（Auxin Signaling F-Box Protein 4）基因，獲得了具有毒莠定（一種內(nèi)吸型除草劑）抗性的植株。乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）是磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶羥苯甲酸類等50 多種商業(yè)除草劑的靶標酶，也是目前抗除草劑植物育種的主要靶位點［26］。Wang 等［27］利 用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過HR途徑實現(xiàn)了ALS的第628位甘氨酸（glycine，G）突變?yōu)樘K氨酸（threonine，T），即G628W，獲得的突變株具有咪草煙抗性。Butt等［28］利用CRISPR/Cas9 體系，在水稻SF3B1（spliceosomal protein）基因的CDS區(qū)設計了119個sgRNAs，進行愈傷組織的轉(zhuǎn)化后施加Herboxidiene（一種具有除草活性的植物毒性聚酮類化合物），獲得一些點突變抗性株，其可有效減弱藥物對其靶標SF3B1的結(jié)合。

為提高HR 效率，研究者在轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas的同時引入1 條用于與斷裂處序列進行同源重組的供體DNA 片段。利用此方法已在水稻、煙草、西紅柿、玉米以及大豆中實現(xiàn)ALS基因的定點突變，并獲得相應的抗除草劑植株［29-32］。已有研究采用類似方法對5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合 酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）進行定點突變，獲得具有草甘膦抗性的突變作物［33-35］。Svitashev 等［36］使用基因槍法將體外預先組裝好的Cas9/sgRNA 核酸蛋白復合體以及同源供體片段進行轉(zhuǎn)化，可獲得無外源基因元件的抗除草劑玉米新種質(zhì)。為提高HR 概率，Endo 等［37］利用兩步轉(zhuǎn)化法進行基因編輯。首先采用CRISPR/Cas9 技術敲除水稻中NHEJ 修復所必需的蛋白DNA Ligase 4（Lig4），隨后引入含ALS突變位點的同源序列，對首次敲除后篩選得到的lig4突變細胞進行2次打靶，獲得了ALS基因W548L和S627I的突變體。

2.2 堿基編輯技術及其應用

堿基編輯技術是CRISPR/Cas 系統(tǒng)的衍生體系，能夠在無需形成DSB、無需提供同源模板以及不依賴宿主的NHEJ和HDR途徑就能夠?qū)崿F(xiàn)特定位點的精確堿基替換［4］。該技術分為腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）和胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）2 種，主要由sgRNA、失去核酸內(nèi)切酶活性但保留DNA 結(jié)合能力的Cas9 突變體（即dCas9）及與dCas9 融合的腺苷脫氨酶或胞苷脫氨酶組成（圖3）。堿基編輯系統(tǒng)中的sgRNA 能夠引導dCas9 結(jié)合到靶位點，使得非互補鏈（即非靶標鏈）暴露為單鏈結(jié)構(gòu)，脫氨酶在該區(qū)域中使腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）脫氨基分別變成肌苷（I）、尿嘧啶（U），在DNA 修復過程中，I 被當做鳥嘌呤（G），U 變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），從而形成A 到G 或C 到T 的堿基替換［38］。堿基編輯技術能夠高效、精準地實現(xiàn)定點突變，在抗除草劑作物育種上的應用潛力巨大，目前已通過該技術獲得大量的抗性植株。

圖3 單堿基編輯系統(tǒng)構(gòu)成與作用機理Fig.3 The components and the action mechanisms of base editing system

Kuang 等［26］在水稻ALS基因的完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）內(nèi)共設計了63 個sgRNA，最終獲得P171F、R190H、P171F、P171F、R172C、P171L、P171S 等一系列突變材料，并指出P171F 對雙草醚具有極高的抗性，是一種新的抗性位點；Shimatani 等［39-40］和Endo 等［41］利用CBE 技術對ALS已知的抗性位點進行打靶，獲得了具有咪草煙除草劑抗性的水稻突變種質(zhì)；此外，在油菜、小麥、玉米、大豆、西瓜等作物中，通過堿基編輯技術得到了以ALS 為靶標的除草劑抗性株系［24，42-49］；乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）與脂肪酸的合成相關，是芳氧苯氧丙酸類、環(huán)己二酮類以及苯基吡唑啉類除草劑的靶位點。Liu 等［50］利用覆蓋ACCaseORF 區(qū)的141 個sgRNAs對水稻進行編輯，獲得一系列蓋草能抗性材料，并認為I1879V 是培育耐蓋草能水稻的最佳突變。Li 等［51］對水稻中的ACCase進行定點突變，將ACCase 編碼區(qū)的第2 186 位C 突變?yōu)镽，獲得了抗芳氧基苯氧丙酸酯和環(huán)己二酮類除草劑的水稻突變體。Zhang 等［48］利用堿基編輯技術將玉米ACCase 進行定點修飾，并發(fā)現(xiàn)ACCase突變株（A1992V）具有除草劑抗性；EPSPS 是草甘膦除草劑的靶位點，Endo 等［41］對EPSPS 進行定向修飾（T102I），獲得了抗草甘膦的水稻。TubA2為植物微管蛋白合成相關基因，是二硝基苯胺類除草劑的靶位點，Liu等［52］利用ABE技術使TubA2發(fā)生了M268T 的替換，獲得的水稻同時具有氟樂靈和二甲戊靈抗性。

2.3 引導編輯技術及其應用

引導編輯技術由向?qū)NA（prime editing guide RNA，pegRNA）、Cas9 核酸切口酶（nCas9）和逆轉(zhuǎn)錄酶組成。pegRNA 是一種經(jīng)過修飾的sgRNA，在其3'端引入一段引物結(jié)合位點（primer binding site，PBS）和人工設計的逆轉(zhuǎn)錄模板序列（包含編輯位點）。pegRNA 既能夠引導nCas9 結(jié)合到靶位點，也可以作為逆轉(zhuǎn)錄模板。引導編輯系統(tǒng)中的nCas9 在靶位點切割DNA 序列后，形成1 個單鏈DNA 缺口，單鏈DNA 缺口與PBS 序列互補配對形成雙鏈DNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成含有突變的序列（圖4）［53］。引導編輯技術能夠?qū)崿F(xiàn)任意形式的點突變、插入、缺失及復雜的混合突變，克服了堿基編輯技術僅能夠進行A 到G、C 到T 轉(zhuǎn)換的缺陷［22］。引導編輯技術在植物中的使用尚處于起步階段，用于抗除草劑作物的創(chuàng)制還需要更深入的研究。

圖4 引導編輯系統(tǒng)構(gòu)成與作用機理Fig.4 The components and action mechanism of prime editing system

研究發(fā)現(xiàn)，利用引導編輯技術對水稻EPSPS基因進行編輯，能夠?qū)崿F(xiàn)6種不同堿基的替換，包括C 到T、G 到C、T 到G、A 到C、T 到C、A 到G［54］。Li 等［55］完成了水稻EPSPST169I、A170V、P173S的突變，創(chuàng)制了對草甘膦具有高抗性的水稻。Xu等［56］利用引導編輯技術在水稻ACCase上實現(xiàn)了D2176G 的突變。目前，ALS在水稻、玉米、西紅柿上均獲得了各種類型的抗性突變［54，56-60］。引導編輯技術為抗除草劑作物育種提供了更為便利的手段。

目前，各種作物應用CRISPR/Cas 系統(tǒng)不同編輯工具進行抗除草劑育種的相關研究匯總于表1，說明CRISPR/Cas 系統(tǒng)在作物抗除草劑育種中應用廣泛。

3 CRISPR/Cas 技術在抗除草劑植物育種中存在的主要問題

3.1 同源重組效率低

由于植物除草劑的靶位點多數(shù)為新陳代謝中的關鍵基因，其功能缺失可能直接導致作物死亡。目前，基因編輯技術已在多種作物的除草劑抗性育種中成功應用。如表1 所示，除草劑抗性多數(shù)是由一個或多個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）造成的，而通過CRISPR/Cas 技術獲得單堿基突變的效率通常較低。雖然引入同源供體DNA 可在一定程度上提高同源重組的概率，但供體DNA 導入植物細胞的效率較低［17］。堿基編輯和引導編輯受PAM 識別位點的限制，并不能夠覆蓋所有感興趣的位點，因此，利用這兩種技術不能確保作物除草劑抗性的產(chǎn)生。在這種情況下，基于CRISPR/Cas 技術的同源重組是解決該問題的重要手段。由于引入包含除草劑抗性SNP 的DNA 片段效率較低，在一定程度上限制了CRISPR/Cas 技術在抗除草劑作物育種中的應用。

表1 CRISPR/Cas系統(tǒng)在抗除草劑作物育種中的應用Table 1 Application of CRISPR/Cas system in herbicide-resistant crops breeding

3.2 脫靶現(xiàn)象

CRISPR/Cas 技術存在脫靶問題，研究表明，sgRNA 有5 個堿基的錯配時，CRISPR/Cas 系統(tǒng)仍能切割DNA［61］，因而該技術可能會對非靶位點進行編輯，造成未知基因的突變，產(chǎn)生非預期的表型。目前脫靶位點主要通過軟件進行預測，但有些脫靶位點可能無法準確評估。

3.3 抗性雜草的產(chǎn)生

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種植抗除草劑作物將會使某種除草劑被長期單一的使用，最終導致抗性雜草的出現(xiàn)，使雜草防除措施失效。目前CRISPR/Cas 技術針對的抗除草劑基因主要為ALS（表1），這可能與ALS基因突變類型較多，研究較為深入有關。但ALS抑制類除草劑是發(fā)生抗性最為嚴重的一類除草劑，據(jù)統(tǒng)計，大約有167 種雜草產(chǎn)生了抗性（http：//weedscience.org/summary/SOASummary.aspx）。

4 利用CRISPR/Cas技術創(chuàng)制抗除草劑作物的發(fā)展方向

抗性雜草的產(chǎn)生是當前化學防治雜草面臨的最嚴重問題，利用抗性雜草少的除草劑、避免長期單一地使用作用機制相同的除草劑是解決該問題的有效途徑。因此，利用CRISPR/Cas 技術尋找新的抗性靶點、培育復合抗性品種是預防和解決該問題的重要方法。

4.1 除草劑新靶標育種

目前已利用的靶標主要包括ALS、ACCase以及EPSPS，通過對這些靶標進行修飾而創(chuàng)制的抗除草劑作物，會隨著抗性雜草的增多而導致其應用價值降低。對于一些無抗性或較少有抗性雜草的除草劑，根據(jù)其靶標而定向創(chuàng)制的抗性作物應用前景廣泛。目前仍有一些除草劑的靶標待利用，如已在模式植物擬南芥中證實的CESA3，該基因與纖維素的合成相關。CESA3的突變能夠產(chǎn)生C17（一種纖維素合成抑制類化合物）抗性，可以作為抗除草劑作物育種的新靶點［62］；同時，原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，PPO）、α-微管蛋白（α-tubulin）發(fā)生變異時，會分別產(chǎn)生氟丙嘧草酯和二硝基苯胺的抗性［63］；磷酸核糖基苯胺異構(gòu)酶（phosphoribosylaniline isomerase，PAI）和5-氧脯氨酸酶（5-oxoprolinase，OXP）的缺失突變會使植物分別產(chǎn)生6-鄰氨基苯甲酸甲酯和磺胺甲噁唑抗性［1］；羥基苯丙酮酸雙加氧酶（hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase，HPPD）抑制類除草劑的抗性雜草較少，是由于HPPD基因的抗性進化緩慢。因而，采用基因編輯技術創(chuàng)制的抗HPPD 抑制劑作物，將具有巨大的商業(yè)應用潛力［64］。

4.2 除草劑復合抗性育種

國際抗除草劑雜草數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，多數(shù)抗性雜草是對單一類型的除草劑有抗性，對多種類型除草劑有抗性的雜草（如部分稗屬、莧屬和假蓬屬植物）相對較少。CRISPR/Cas 技術可以實現(xiàn)多個靶標基因的定向修飾，利用該技術開發(fā)出對多種除草劑具有抗性的作物品種，能夠?qū)崿F(xiàn)不同除草劑的輪換使用，因而既可以有效防治具有單一除草劑抗性的雜草，同時，也能延緩或抵御雜草抗性的產(chǎn)生。因而合理利用CRISPR/Cas 技術可有效防控雜草。

5 展望

CRISPR/Cas 作為生命科學領域一項新興技術，能夠快速、簡單、高效、精確地實現(xiàn)作物的定向改造，創(chuàng)制各種無外源片段的抗除草劑新種質(zhì)，為雜草防治提供更多的可能。由于該技術的特殊性，各國政府對其監(jiān)管態(tài)度不同。目前，我國各官方機構(gòu)對基因編輯作物仍采取保守態(tài)度，尚無明確的監(jiān)管標準［65］。盡管基因編輯作物的監(jiān)管問題可能會長期存在爭議，但我國仍需要形成CRISPR/Cas 技術的自主知識產(chǎn)權(quán)，爭取在該領域具有主動權(quán)和話語權(quán)。隨著CRISPR/Cas 技術的完善，未來該技術可能會逐漸被人們所接受。