孫瑞雪，米薇，葉子弘

1.中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2.中國計量科學(xué)研究院，北京100029

蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）和蛋白-配體相互作用，涉及多種藥物作用機制［1］。蛋白-蛋白結(jié)合的調(diào)節(jié)也代表了一種新興的治療模式，蛋白質(zhì)界面為藥物開發(fā)提供了一類新的靶點。在PPI 中尋找關(guān)鍵的蛋白、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)、診斷標(biāo)記物以及治療靶點，可為相關(guān)疾病的治療和靶向藥物的開發(fā)提供參考，并可協(xié)助探尋疾病成因。單克隆抗體（mAbs）具有作用機制明確、高結(jié)合親和力和對選定靶點有特異性等優(yōu)勢，已成為蛋白質(zhì)治療的主要類別［2-3］。蛋白質(zhì)的功能主要通過與其他蛋白質(zhì)相互作用來實現(xiàn)，因此PPI 網(wǎng)絡(luò)是識別遺傳變異功能后果的重要工具。與疾病有關(guān)的基因突變被定位到細(xì)胞過程的重要PPIs，通過引入攜帶突變的蛋白或病原體蛋白的外源性表達(dá)，將疾病狀態(tài)與野生型參考圖進(jìn)行對比，有望揭示疾病發(fā)病過程中網(wǎng)絡(luò)的變化。

基于質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrometry，MS）的蛋白互作方法正蓬勃發(fā)展，并越來越廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究中?；谫|(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法的發(fā)展使得通過測定動態(tài)蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、翻譯后修飾、組裝、結(jié)構(gòu)和PPI來全面表征蛋白質(zhì)復(fù)合物成為可能［4］。盡管目前的質(zhì)譜分析方法在靈敏度和細(xì)胞通量方面尚存在缺陷，但使用液滴微流體，可以將樣品的檢測限從μL 精確到nL，這大大提高了分析性能。到目前為止，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)已經(jīng)越來越廣泛地與基于質(zhì)譜的方法相融合，逐漸被用于補充結(jié)構(gòu)生物學(xué)工具［5］。

1 經(jīng)典的蛋白互作研究方法

研究蛋白質(zhì)間相互作用的經(jīng)典方法較多，主要包括生物物理學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)等方法。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）可直接作用于活細(xì)胞，能夠監(jiān)測實時或者瞬時的PPI，檢測相互作用位點，監(jiān)測復(fù)雜的相互作用動力學(xué)［6］。表面等離子體共振技術(shù)（surface plasmon resonance，SPR）具有實時分析、樣品用量少、樣品無需標(biāo)記、自動化和中到高通量篩選能力等優(yōu)勢，這廣泛地促進(jìn)了治療性單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展［7］。此外，SPR 和MS 的結(jié)合為蛋白質(zhì)間相互作用的鑒定和表征提供了一個非常靈敏的工具［8］，該技術(shù)可使用相對少量的材料測量膜蛋白與配體分子互作的實時定量結(jié)合親和力和動力學(xué)參數(shù)［9］。經(jīng)典的蛋白互作方法優(yōu)缺點見表1。

表1 經(jīng)典的蛋白質(zhì)互作方法優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of classical protein interaction methods

雙分子熒光互補（bimolecular fluorescent complimentary，BiFC）技術(shù)可直接顯示活細(xì)胞中的PPIs，提供關(guān)于PPIs 發(fā)生的亞細(xì)胞位置的空間信息，該技術(shù)靈敏度高，可用于檢測內(nèi)源性或近內(nèi)源性表達(dá)蛋白互作，以及微弱和短暫互作。但它測量PPI 的動態(tài)或?qū)崟r變化并不理想，在某些情況下，它可能檢測到假陽性的熒光信號，這與重組片段的熒光強度有關(guān)，而與正在研究的兩個蛋白質(zhì)之間（或非特異性）的相互作用無關(guān)［10］。

酵母雙雜交技術(shù)（yeast two-hybrid technique，Y2H）可用于全基因組范圍內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用的高通量研究，能夠在真正的細(xì)胞環(huán)境中檢測體內(nèi)的相互作用［11］，有助于避免一些與細(xì)胞裂解相關(guān)的并發(fā)癥和人為因素［12］。它可以篩選目標(biāo)基因的互作蛋白，檢測瞬時或弱相互作用，繪制蛋白質(zhì)相互作用圖譜，篩選藥物靶標(biāo)，定量檢測互作強度。但Y2H 需要兩個互作的蛋白進(jìn)入細(xì)胞核以驅(qū)動報告基因的轉(zhuǎn)錄，所以不適合用于某些細(xì)胞膜受體蛋白和細(xì)胞外蛋白［13］。在某些情況下使用酵母宿主可能無法檢測到來自其他生物體的PPIs，原因是表達(dá)不良、缺乏必要的翻譯后修飾、輔助因子或其他結(jié)合因子［14］。

2 親和純化-質(zhì)譜

親和純化-質(zhì)譜（affinity purification-mass spectrometry，AP-MS）的原理是將目的蛋白固定在固體載體上（最常見的是瓊脂糖或磁珠），利用目的蛋白與互作蛋白的相互作用將互作蛋白固定在載體上，從而實現(xiàn)從復(fù)雜混合物中的分離，隨后將分離得到的混合物用質(zhì)譜鑒定［15］。

親和純化與定量質(zhì)譜聯(lián)用已成為研究蛋白質(zhì)復(fù)合物以及整個生物體蛋白質(zhì)組在體內(nèi)相互作用的主要方法，這種組合產(chǎn)生高度可靠的蛋白互作數(shù)據(jù)，通過使用定量蛋白質(zhì)互作信息，可以將特定蛋白質(zhì)相互作用物與非特定背景蛋白質(zhì)區(qū)分開［16-18］。但分析AP-MS 實驗數(shù)據(jù)較困難，需要MS專業(yè)知識和特定的生物信息學(xué)工具。串聯(lián)親和純化（tandem affinity purification，TAP）結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)可以識別互作蛋白并對蛋白復(fù)合物進(jìn)行純化，TAP-MS 已被用于分析許多不同生物體中的蛋白互作和蛋白質(zhì)復(fù)合物。同時，TAP 還可以分析突變體對蛋白質(zhì)相互作用和關(guān)聯(lián)的影響，還可能發(fā)現(xiàn)結(jié)合位點［19］。

3 生物素鑒定-質(zhì)譜

生物素鑒定-質(zhì)譜（biotin identification-mass spectrometry，BioID-MS）的原理是原核生物素連接酶分子（BirA）連接目的蛋白，當(dāng)細(xì)胞中融合蛋白表達(dá)后，接近目的蛋白的互作蛋白被生物素化而帶上生物素標(biāo)簽，隨后用帶親和素的固相載體進(jìn)行捕獲，可分離得到生物素化的蛋白，最后使用MS 鑒定可得到目的蛋白的互作蛋白［20］。BioIDMS 的核心優(yōu)勢是它在天然細(xì)胞環(huán)境中檢測PPIs時，細(xì)胞的正常生命活動基本不會受到干擾，通過改變?nèi)诤系鞍字g連接部分的長度，可以調(diào)控檢測范圍，該技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域意義重大。

BioID-MS 還適合識別微弱或瞬時互作、難溶性蛋白互作、翻譯后修飾介導(dǎo)的蛋白互作等。它在檢測低豐度蛋白方面可能比AP-MS 更有效［21］。該技術(shù)被用于鑒定冠狀病毒復(fù)制、HIV 病毒蛋白互作網(wǎng)、細(xì)菌宿主識別、有絲分裂相關(guān)蛋白互作等［22］。但低表達(dá)水平的PPI 伴侶也可能導(dǎo)致假陰性，在某些情況下，生物素化過程本身可能會對蛋白質(zhì)的行為/相互作用造成影響。

4 氫氘交換質(zhì)譜法

4.1 氫氘交換質(zhì)譜法的原理

氫氘交換質(zhì)譜法（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX-MS）的原理是蛋白質(zhì)樣品在不同的時間點用氘進(jìn)行標(biāo)記，通過降低pH 至2.5 來淬滅交換，氘化的樣品保持在0 ℃以避免回交，樣品酶解后，用HPLC 及UPLC 分離多肽，最后用MS 檢測。因為氘比氫重，質(zhì)譜信號將逐漸向高質(zhì)荷比（m/z）方向移動。通過對反應(yīng)前后HDX-MS 數(shù)據(jù)的比較，不同HDX-MS 譜的肽段可以突出蛋白與小分子/其他蛋白互作中潛在的相互作用界面［23］。

4.2 氫氘交換質(zhì)譜法的應(yīng)用

20 世紀(jì)90 年代以來，HDX-MS 在學(xué)術(shù)界被廣泛應(yīng)用，其中包括對蛋白質(zhì)復(fù)合物、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、配體結(jié)合、構(gòu)象變化和折疊/展開/再折疊的動態(tài)特性、由變構(gòu)效應(yīng)引起的構(gòu)象變化等的研究。Puchades 等［24］基于HDX-MS 揭示了溶液中血凝素（hemagglutinin，HA）三聚體的構(gòu)象動力學(xué)。該技術(shù)在修飾的氨基酸水平相對較低或在多個位點有修飾時也可用來評估蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）在單個位點的影響。它可以識別抗體-抗原互作表位，了解抗原-抗體的相互作用和識別表位對于設(shè)計有效的蛋白治療藥物尤為重要。此外，該技術(shù)可進(jìn)一步輔助藥物研發(fā)與表征蛋白質(zhì)治療的高階結(jié)構(gòu)以及動態(tài)的微小變化，可以作為一種有效的常規(guī)檢查方法，用于生產(chǎn)過程各個階段的質(zhì)量控制。Puchades等［24］應(yīng)用該技術(shù)探索各種藥物分子在血凝素上的主要抗原表位，并在藥物開發(fā)的早期階段確定候選藥物。

HDX-MS 可作為篩選候選藥物庫、早期和晚期先導(dǎo)物優(yōu)化的工具和蛋白質(zhì)治療藥物生產(chǎn)中的常規(guī)質(zhì)量控制方法［25］。它還可以揭示配體結(jié)合位點和誘導(dǎo)構(gòu)象變化，為理解藥物的定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）提供依據(jù)。該方法在單克隆抗體治療的發(fā)展中貢獻(xiàn)巨大，可作為一種可靠的方法來定位抗體-抗原在其固有溶液狀態(tài)下的相互作用構(gòu)象表位［26-28］，也被用于詢問抗體偶聯(lián)藥物的高階結(jié)構(gòu)，以評估藥物偶聯(lián)過程如何影響單克隆抗體的構(gòu)象和動力學(xué)特性［29］。Pan 等［30］首次將HDX-MS 應(yīng)用于mAb和相應(yīng)的抗體-藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）直接比較，以了解藥物結(jié)合對ADC 的構(gòu)象和動力學(xué)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，ADC 和單抗在溶液中具有非常相似的構(gòu)象和動力學(xué)參數(shù)，且HDX-MS 數(shù)據(jù)表明，藥物偶聯(lián)過程不會在蛋白質(zhì)骨架上引起大規(guī)模的構(gòu)象變化。

HDX-MS 有助于新藥物的設(shè)計和發(fā)現(xiàn)，已用于單克隆抗體、抗體-藥物偶聯(lián)物和生物類似抗體的評估和開發(fā)［31］。

4.3 氫氘交換質(zhì)譜法的優(yōu)勢

HDX-MS 可用于研究蛋白質(zhì)中氫鍵網(wǎng)絡(luò)和折疊，特別是當(dāng)樣本有限時，優(yōu)勢明顯。HDX-MS 與其他方法相結(jié)合，如化學(xué)交聯(lián)，有助于闡明單個蛋白質(zhì)和大型蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象動力學(xué)［32］。Yang 等［33］通過SPR 結(jié)合HDX-MS 技術(shù)對血清樣本中存在的抗體進(jìn)行了全面的定量和定性評估，SPR 技術(shù)提供抗體親和力信息和抗原特異性抗體定量信息，MS提供血清抗體與其抗原之間結(jié)構(gòu)相互作用信息，這對開發(fā)治療性抗體或疫苗至關(guān)重要。Domina等［34］通過噬菌體結(jié)合HDX-MS技術(shù)確定了NHBA的結(jié)合位點。Rafalik等［35］通過HDX-MS 結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗揭示了抗原-抗體的親和力和特異性的信息，以及表位信息。Calvaresi 等［36］通過尺寸排阻色譜結(jié)合HDX-MS 實現(xiàn)了從蛋白質(zhì)-脂質(zhì)系統(tǒng)中高效地在線去除脂質(zhì)成分，在抗原表位定位期間耗盡抗原中的抗體，以及在HDX-MS 分析二硫鍵結(jié)合蛋白過程中消除MS 干擾化合物，如三（2-羧乙基）膦（TCEP）。它與低溫電子顯微鏡（cryogenic electron microscope，Cryo-EM）有互補性，通過HDX-MS 測量分離和復(fù)合的蛋白質(zhì)，可以揭示分子間相互作用如何影響其動力學(xué)和變構(gòu)調(diào)節(jié)，低溫電磁可能有助于解釋HDX質(zhì)譜的結(jié)果，尤其是當(dāng)晶體學(xué)信息不可用時。

表位作圖是識別參與抗原-抗體相互作用的結(jié)合位點的過程，表位的鑒定對于開發(fā)新的基于抗體的治療和疫苗至關(guān)重要。揭示表位也有助于闡明靶蛋白的作用機制，HDX-MS 在表位定位方面的優(yōu)勢源于其高靈敏度和對蛋白質(zhì)大小的極大耐受性，即使是大的蛋白質(zhì)復(fù)合物，如組織相容性復(fù)合物，也可以通過表位作圖鑒定［37］。Bereszczak等［38］應(yīng)用HDX-MS 對病毒衣殼進(jìn)行表位分析，并檢測了兩個重要的單克隆抗體片段FabE1 和Fab3120 以及乙型肝炎病毒衣殼中的核心抗原。Fernandez 等［39］利用HDX-MS 技術(shù)對乙型肝炎病毒、輪狀病毒、登革熱病毒和乙型腦炎病毒進(jìn)行了表位作圖，這表明HDX-MS 技術(shù)在病毒組裝領(lǐng)域表位作圖中有巨大的應(yīng)用潛力。

5 化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜法

5.1 化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜法的原理

化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜法（chemical cross-linking mass spectrometry，CX-MS）的原理是對一個選定的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物在其自然狀態(tài)下加入化學(xué)交聯(lián)劑，交聯(lián)劑可以共價連接空間上接近的氨基酸殘基，其次交聯(lián)蛋白被水解，生成的肽混合物被分離，并用LC-MS 進(jìn)行分析。隨后對MS 數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，以闡明交聯(lián)肽的序列以及交聯(lián)位點，交聯(lián)位點可用于確定蛋白質(zhì)單體或復(fù)合物的結(jié)構(gòu)域和氨基酸側(cè)鏈的鄰近程度，識別蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間潛在的結(jié)合位點。

5.2 化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜法的應(yīng)用

CX-MS 主要應(yīng)用于解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和研究蛋白質(zhì)間互作。解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對于了解蛋白質(zhì)的功能具有重要作用，蛋白質(zhì)功能的調(diào)控主要取決于其構(gòu)象和相互作用的動態(tài)調(diào)節(jié)。有許多用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面結(jié)構(gòu)表征的技術(shù)，如最常見的X 射線結(jié)晶學(xué)，該技術(shù)能夠確定抗體與其抗原互作的精確位點，但X 射線結(jié)晶學(xué)對于蛋白質(zhì)樣品的純度、濃度及結(jié)晶性等有嚴(yán)格的要求，不適合解析大分子蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，且無法捕捉相互作用蛋白質(zhì)的動力學(xué)［40］。CX-MS 能與蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件相結(jié)合從而確定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，能夠固定弱/瞬時互作，以及幫助區(qū)分直接互作還是間接互作，確定蛋白質(zhì)互作的界面［41］。

Chavez 等［42］演示了CX-MS 技術(shù)在鑒定組織樣本中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征和相互作用方面的應(yīng)用，為小鼠心臟中存在的蛋白質(zhì)復(fù)合物提供了系統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)視角，每個確定交聯(lián)肽對都提供了一個有用的分子探針，可用來量化組織中蛋白質(zhì)構(gòu)象或蛋白互作的變化，并可能幫助識別分子相互作用，作為線粒體靶向治療心血管或其他疾病的新靶點。Huang 等［43］利用此方法探測了牛血清白蛋白的三維結(jié)構(gòu)。CX-MS 也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組的細(xì)胞裂解物、完整的細(xì)胞或細(xì)胞器、同時監(jiān)測整個蛋白質(zhì)組的PPIs 及其空間信息［44-45］。定量CX-MS 方法已被用于研究耐藥癌細(xì)胞相互作用的信息，熱休克蛋白90（Hsp90）和有絲分裂抑制劑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象和相互作用的變化，以及擬磷酸化突變和核苷酸結(jié)合對Hsp90 與其輔伴侶Aha1 相互作用的影響［46］。定量CX-MS 將在可視化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用動力學(xué)中發(fā)揮越來越重要的作用［47］。

5.3 化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜法的優(yōu)勢

CX-MS 的日益普及很大程度上歸因于它在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中作為一種整合方法，可創(chuàng)建更可靠的目標(biāo)蛋白模型。許多技術(shù)可以與CX-MS 結(jié)合使用，如將不同的低分辨率方法結(jié)合，可以生成更精確的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，特別是那些傳統(tǒng)技術(shù)難以研究的結(jié)構(gòu)［48］。

當(dāng)CX-MS 與冷凍電鏡和天然質(zhì)譜結(jié)合使用時，這些空間約束數(shù)據(jù)可以指導(dǎo)分子建模，并繪制蛋白質(zhì)復(fù)合物的動態(tài)行為圖［49-50］。Courouble 等［51］通過將HDX-MS 與CX-MS 相結(jié)合，闡明了SARSCoV-2 全長nsp7：nsp8 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)動力學(xué)特征。Zhang等［52］成功地利用HDX-MS、CX-MS和分子對接技術(shù)確定了IL-7/IL-7Rα 結(jié)合界面，并預(yù)測了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物在溶液中的三維四級結(jié)構(gòu)。此外，交聯(lián)試劑可以共價連接兩個或多個非共價相互作用的蛋白質(zhì)，且與相互作用的時間和強度無關(guān)，因此即使是短暫的和弱的PPI 也可以被保留下來［53-54］。CX-MS 有助于確定交聯(lián)氨基酸側(cè)鏈的位置，從而將物理作用位點限制在特定的結(jié)構(gòu)區(qū)域［55］。

6 展望

本文介紹了基于質(zhì)譜的PPI 方法的一般原則及各種方法的優(yōu)缺點，如表2 所示。質(zhì)譜具有靈敏度高、可高通量檢測等優(yōu)點，采用質(zhì)譜檢測蛋白互作可在一定程度上彌補經(jīng)典方法的局限性?；谫|(zhì)譜的方法檢測的結(jié)構(gòu)特征可以與傳統(tǒng)的技術(shù)互補，如X 射線晶體學(xué)、電磁和核磁共振波譜學(xué)等。CX-MS 將會極大地推動生物大分子復(fù)合體結(jié)構(gòu)和蛋白互作的研究。HDX-MS 技術(shù)不僅能夠分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，還能分析結(jié)構(gòu)動態(tài)變化，但設(shè)備條件限制了該技術(shù)在國內(nèi)的應(yīng)用，因此，提高數(shù)據(jù)自動解析度是HDX-MS技術(shù)推廣的關(guān)鍵。未來HDX 質(zhì)譜將繼續(xù)在評估蛋白質(zhì)治療的高階結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。相信更先進(jìn)的質(zhì)譜檢測技術(shù)將更廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)互作領(lǐng)域。蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成及其互作表面、化學(xué)計量學(xué)、動力學(xué)等方面的研究將進(jìn)一步提高這些技術(shù)在整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用價值。

表2 基于質(zhì)譜的蛋白互作方法優(yōu)缺點Table 2 Advantages and disadvantages of protein interaction methods based on mass spectrometry