嚴(yán) 方， 于靜洋， 崔和平， 夏書芹， 張曉鳴

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

食鹽是飲食中不可缺少的調(diào)味品，攝入過多則帶來很多健康問題[1]，減鹽已經(jīng)被全球公認(rèn)為最具有成本效益的慢性病干預(yù)策略之一。 受到傳統(tǒng)飲食文化等因素的影響， 我國(guó)居民食鹽攝入量居高不下。 通過低鈉飲食改善國(guó)民健康現(xiàn)狀、提高人民生活質(zhì)量已經(jīng)成為全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題。 雖然人們?cè)诘外c鹽開發(fā)方面進(jìn)行了積極探索，卻由于其犧牲食品口味的代價(jià)而難以從根本解決國(guó)民食鹽攝入過量的問題。 提出“科學(xué)減鹽、技術(shù)減鹽”的有效方法，是我國(guó)社會(huì)亟待解決的重要民生問題，也是食品行業(yè)技術(shù)創(chuàng)新的必然要求。

為了實(shí)現(xiàn)科學(xué)減鹽，人們采用其他金屬元素的無機(jī)鹽取代鈉鹽[2]，以氯化鉀和硫酸鎂為添加劑的低鈉鹽已在市場(chǎng)流通，但其成本高、后苦味重，很難被消費(fèi)者廣泛接受， 并且鉀離子增加心臟負(fù)擔(dān)，對(duì)心臟病、腎功能不全、高血鉀等病癥患者并不適用[3]。近年來，有關(guān)咸味肽的研究逐漸成為風(fēng)味領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)，為食鹽替代物的研發(fā)開辟了新的方向[4]。

雖然小分子咸味肽可以作為咸味強(qiáng)化劑用于食品的減鹽增咸，但是通過提取或合成法來制備特定小肽過程復(fù)雜、成本較高。 研究表明，采用酶解技術(shù)將食源性蛋白質(zhì)水解為肽， 再添加至食品中，對(duì)食品風(fēng)味具有顯著的改善作用[5]，為了兼顧食品鮮味、醇厚味和整體香氣的提升，可以將蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行美拉德反應(yīng)，得到揮發(fā)性小分子香氣物質(zhì)及改善醇厚味的美拉德肽[6-8]。 目前，國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物 （Maillard reaction products，MRPs）的主要原料是動(dòng)植物蛋白。 動(dòng)物蛋白原料成本高、冷鏈運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過程中內(nèi)源酶活性不穩(wěn)定，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量難以標(biāo)準(zhǔn)化，且隨著出口食品安全性要求的提高， 已開始限制以動(dòng)物源為原料生產(chǎn)的熱反應(yīng)產(chǎn)品。 植物蛋白則來源廣泛、價(jià)格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

與常見的大豆、玉米等蛋白質(zhì)相比，豌豆蛋白作為新型植物基原料，具有非過敏原、非轉(zhuǎn)基因的優(yōu)點(diǎn)。 同時(shí)，豌豆蛋白是豌豆淀粉工業(yè)化生產(chǎn)而得的副產(chǎn)物，主要用于飼料生產(chǎn)。 為提高豌豆蛋白附加值，實(shí)現(xiàn)植物蛋白資源綜合利用，以豌豆蛋白作原料，利用酶解技術(shù)對(duì)豌豆肽進(jìn)行定向制備，以水解度（degree of hydrolysis，DH）和固形物溶出率為參數(shù)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以豌豆蛋白為反應(yīng)物進(jìn)行美拉德反應(yīng)， 研究美拉德反應(yīng)初始pH 對(duì)MRPs 褐變程度、增味效果（咸味、鮮味和醇厚味）及揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響，為減鹽增鮮風(fēng)味產(chǎn)品的研發(fā)提供了指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%）：煙臺(tái)東方蛋白科技有限公司產(chǎn)品；復(fù)合蛋白酶、氨肽酶：安徽強(qiáng)旺調(diào)味食品有限公司產(chǎn)品；甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖、L-半胱氨酸、1，2-二氯苯：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；谷胱甘肽：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；食鹽、味精：市售食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204 電子天平、酸度計(jì)：上海梅特勒有限公司產(chǎn)品；集熱式恒溫?zé)岽帕嚢杵鳎红柫x予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；PAL-1 手持式折光儀： 廣州ATAGO 科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜：沃特世科技（上海）有限公司產(chǎn)品；A360 型紫外可見分光光度計(jì)：上海翱藝儀器有限公司產(chǎn)品；SA402B 電子舌：日本INSENT 公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豌豆肽的制備 稱取8.0 g 豌豆蛋白于酶解罐中，加適量去離子水，調(diào)節(jié)底物質(zhì)量濃度為80 g/L，于95 ℃下熱處理20 min 使豌豆蛋白變性。 冷卻后用6 mol/L 的 NaOH 溶液調(diào)節(jié)酶解液 pH 到 8.0，加入適量復(fù)合蛋白酶，在60 ℃條件下酶解一定時(shí)間，冷卻后再向酶解液中加入適量氨肽酶， 在50 ℃條件下酶解一定時(shí)間。 反應(yīng)結(jié)束后，立即置于沸水浴中滅酶10 min， 冷卻后于10 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，上清液即為豌豆蛋白肽溶液。

1.3.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備 取10 g 豌豆蛋白肽溶液（相當(dāng)于0.1 g 豌豆肽），加入0.15 g 葡萄糖和0.10 g L-半胱氨酸， 用 6 mol/L 的 NaOH 溶液調(diào)節(jié)混合液 pH 分別至 6.4、7.4、8.4， 然后轉(zhuǎn)移到 50 mL 反應(yīng)瓶中，加磁力攪拌子，旋緊密封，在油浴鍋中120 ℃條件下反應(yīng)1 h 后，立即冰浴終止反應(yīng)。

1.3.3 水解度的測(cè)定 利用甲醛滴定法[9]測(cè)定。 水解度（DH）由樣品量與滴定消耗NaOH 體積計(jì)算得到。

式中：c 為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V1為樣品溶液在加甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為空白溶液在加甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V 為酶解上清液的體積，mL；m 為初始豌豆蛋白質(zhì)量，g；n為豌豆蛋白原料中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；8 為每克豌豆蛋白中肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol/g。

1.3.4 固形物溶出率的測(cè)定 參照NY/T 2637—2014 測(cè)定固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算固形物溶出率。

式中：W 為固形物溶出率，%；P 為離心后上清液的固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m1為離心后上清液的質(zhì)量，g；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 氨基酸質(zhì)量濃度的測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定。 ODS Hypersil 色譜柱（250 mm×4.6 mm），柱溫 40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 338 nm，流量 1.0 mL/min。 流動(dòng)相 A：0.06 mmol/L 乙酸鈉，B：0.15 mmol/L 混合液（乙酸鈉、乙腈、甲醇體積比為 1∶2∶2）。

1.3.6 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 采用凝膠滲透色譜法進(jìn)行測(cè)定。 TSKgel 2000SWXL 色譜柱 （300 mm×7.8 mm），柱溫 30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 220 nm，流量0.5 mL/min；流動(dòng)相：乙腈、水、三氟乙酸體積比為40∶60∶0.1。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用以下標(biāo)準(zhǔn)品分析繪制：細(xì)胞色素C（相對(duì)分子質(zhì)量12 500）、抑蛋白酶肽（相對(duì)分子質(zhì)量6 500）、桿菌肽（相對(duì)分子質(zhì)量1 450）、四肽GGYR（相對(duì)分子質(zhì)量451）和三肽GGG（相對(duì)分子質(zhì)量189）。

1.3.7 褐變程度的測(cè)定 將樣品加水稀釋5 倍，用分光光度計(jì)在420 nm 處測(cè)定吸光度。

1.3.8 電子舌分析 以5 g/L 鹽溶液為對(duì)照， 樣品溶液配制時(shí)，保證其中鹽質(zhì)量濃度為5 g/L，再分別加入5 g/L MRPs 樣品，混合均勻。 然后將配制好的溶液直接倒入電子舌專用測(cè)定杯中， 于室溫下測(cè)定。 每個(gè)樣品測(cè)定4 次，第一次測(cè)定后儀器趨于穩(wěn)定，取后3 次信號(hào)數(shù)據(jù)的平均值作為樣品味覺信號(hào)強(qiáng)度。

1.3.9 感官評(píng)定 感官評(píng)定小組由12 名經(jīng)驗(yàn)豐富的感官評(píng)定員（23~55 歲，8 女 4 男）組成，在實(shí)驗(yàn)前， 每個(gè)小組成員需要先對(duì)參照品進(jìn)行感官評(píng)定，以熟悉各項(xiàng)感官指標(biāo)。 將美拉德產(chǎn)物以5 g/L 添加到5 g/L 鹽溶液中，分別對(duì)樣品溶液的咸味、鮮味和醇厚味3 項(xiàng)指標(biāo)在0~6 分內(nèi)打分，分?jǐn)?shù)越高表明該滋味越強(qiáng)。 為避免順序效應(yīng)，樣品以隨機(jī)3 位數(shù)標(biāo)記，并隨機(jī)呈送給每個(gè)感官評(píng)定員品嘗。 各滋味參照溶液及其強(qiáng)度評(píng)分：5 g/L 鹽溶液 （咸味，3 分）；5 g/L 味精溶液（鮮味，3 分）；30 mmol/L 谷胱甘肽溶液（醇厚味，3 分）。 每個(gè)樣品重復(fù) 3 次，取平均值為最終得分。

1.3.10 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析 采用頂空固相微萃取（HS-SPME）結(jié)合氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（GCMS）分析。 HS-SPME 條件：取 3.0 g MRPs 于頂空瓶中， 加入 10 μL 的 0.015 g/L 1，2-二氯苯甲醇溶液做內(nèi)標(biāo)，加入磁力攪拌子，迅速封蓋。 插入老化過的萃取頭，50 ℃下萃取30 min 后進(jìn)樣， 進(jìn)樣口溫度250 ℃，解吸 7 min。 GC-MS 條件：采用 DB-WAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），參照文獻(xiàn)[8]測(cè)定。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0 通過Duncan 多重檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05 表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆蛋白的酶解參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 復(fù)合蛋白酶的添加量 為了提高酶解效率，采用雙酶分步酶解的方法水解豌豆蛋白。 首先采用復(fù)合蛋白酶（內(nèi)切酶）迅速降低大分子蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，然后采用氨肽酶（外切酶）從肽的鏈端逐一水解肽鍵，形成游離氨基酸。 酶的添加量是影響DH 的重要因素， 通常酶的催化反應(yīng)速率正比于酶的添加量， 加酶量的提高能夠縮短酶解反應(yīng)時(shí)間。 因此，首先考察復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)豌豆蛋白的DH 和固形物溶出率的影響。 取8.0 g 豌豆蛋白，加水配制成80 g/L 溶液，分別加入2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U/g（以底物質(zhì)量計(jì)）的復(fù)合蛋白酶，在 60 ℃和pH 8.0 下酶解 3 h，降溫至 50 ℃后，加入300 U/g 的氨肽酶，繼續(xù)酶解2 h，終止反應(yīng)后測(cè)定不同加酶量條件下產(chǎn)物的DH 與固形物溶出率，結(jié)果見圖1。

豌豆蛋白的DH 和固形物溶出率都隨著復(fù)合蛋白酶加酶量的增加而增加。 加酶量越大，復(fù)合蛋白酶為底物提供的催化活性位點(diǎn)越多，酶促反應(yīng)的最大速率越大，根據(jù)米氏方程可知，在相同底物質(zhì)量濃度條件下，其酶解速率也越大。 酶解速率的提高促進(jìn)蛋白質(zhì)向肽的快速轉(zhuǎn)化，因此在相同酶解時(shí)間條件下，加酶量越大則DH 越大。當(dāng)加酶量從3 000 U/g 增加到 3 500 U/g 時(shí)，DH 增加了 2.22%，固形物溶出率增加了3.80%，增加速度最快。當(dāng)加酶量超過3 500 U/g 底物時(shí)，DH 和固形物溶出率的增長(zhǎng)速率變緩慢。 這是因?yàn)榧用噶吭酱?，酶解速率越快，底物消耗越快，根?jù)米氏方程，底物質(zhì)量濃度降低會(huì)引起酶解速率下降，最終達(dá)到平衡狀態(tài)。 所以加酶量的增加雖然會(huì)加快酶解速率，同時(shí)也會(huì)加快平衡到來的時(shí)間，繼續(xù)增加加酶量，DH 不會(huì)繼續(xù)提高。 因此，選擇3 500 U/g 為復(fù)合蛋白酶的最優(yōu)添加量。 從圖1 還可以看出，隨著加酶量增加，DH 與固形物溶出率表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，并且同時(shí)在3 500 U/g的加酶量下達(dá)到最大值，這是由于蛋白質(zhì)或肽在水中的溶解度與其相對(duì)分子質(zhì)量有密切的關(guān)系。 隨著蛋白質(zhì)水解的發(fā)生，大分子蛋白質(zhì)逐漸變?yōu)橄鄬?duì)分子質(zhì)量較小的肽，極性基團(tuán)尤其是氨基和羧基的數(shù)目增加，電荷密度增大，分散相的水溶性逐漸增加，導(dǎo)致酶解液的固形物溶出率逐漸提高。

圖1 復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)豌豆蛋白的DH 和固形物溶出率的影響Fig. 1 Effect of protamex protease concentration on DH and solid dissolution ratio of pea protein

2.1.2 復(fù)合蛋白酶的酶解時(shí)間 在復(fù)合蛋白酶添加量的優(yōu)化基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究酶解時(shí)間對(duì)豌豆蛋白DH 和固形物溶出率的影響。 取8.0 g 的豌豆蛋白，加水配成80 g/L 溶液，加入3 500 U/g 的復(fù)合蛋白酶， 在 60 ℃和 pH 8.0 下分別酶解 1、2、3、4、5 h，降溫至50 ℃后，加入300 U/g 的氨肽酶，繼續(xù)酶解2 h，測(cè)定復(fù)合蛋白酶不同作用時(shí)間制得產(chǎn)物的DH 與固形物溶出率，結(jié)果見圖2。

圖2 復(fù)合蛋白酶的酶解時(shí)間對(duì)豌豆蛋白的DH 和固形物溶出率的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time by protamex protease on DH and solid dissolution ratio of pea protein

隨著復(fù)合蛋白酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，大分子蛋白質(zhì)被逐漸水解形成相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽段，因此豌豆蛋白的DH 和固形物溶出率呈上升趨勢(shì)。 DH在1~2 h 和3~4 h 時(shí)增速明顯， 因?yàn)閺?fù)合蛋白酶在酶解初始階段活力較高，與底物結(jié)合充分，水解效率較高，而隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，底物減少，產(chǎn)物質(zhì)量濃度增加， 由于產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)水解的抑制作用，使得酶活力下降， 導(dǎo)致酶解速率下降，DH 增速變慢。 另一方面，由于底物質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于酶的質(zhì)量濃度，在酶促反應(yīng)早期可認(rèn)為底物質(zhì)量濃度為一個(gè)常數(shù)，酶促反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)，酶解速率不受底物質(zhì)量濃度的影響；隨著酶解的進(jìn)行，底物質(zhì)量濃度下降，反應(yīng)逐漸遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，肽的形成速率隨反應(yīng)的進(jìn)行而減小，這也會(huì)導(dǎo)致在水解反應(yīng)后期豌豆蛋白DH 增速放緩。在酶解1~3 h 內(nèi)，固形物溶出率增長(zhǎng)迅速，在此之后趨于平穩(wěn)，而3 h 后豌豆蛋白的DH 仍然持續(xù)增長(zhǎng)。 這一結(jié)果說明酶解3 h 形成的豌豆肽即使進(jìn)一步形成相對(duì)分子質(zhì)量更小的肽，水溶性不再增加。 在酶解1~3 h 形成的肽，水溶性對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量的變化更敏感。 綜合考慮固形物溶出率和DH 的增長(zhǎng)速率， 選擇4 h 為復(fù)合蛋白酶的最優(yōu)酶解時(shí)間。

2.1.3 氨肽酶的添加量 作為外切酶，氨肽酶對(duì)游離氨基酸的形成具有重要作用，因此進(jìn)一步對(duì)氨肽酶添加量進(jìn)行優(yōu)化。 取8.0 g 豌豆蛋白， 加水配成80 g/L 溶液，按上述條件用復(fù)合蛋白酶酶解4 h 后，分別加入 250、300、350、400、450 U/g 的氨肽酶，在50 ℃下酶解2 h，測(cè)定不同加酶量條件下產(chǎn)物的DH與固形物溶出率，結(jié)果見圖3。

對(duì)比圖1 與圖3 可知，氨肽酶在較低的加酶量水平下即可達(dá)到與復(fù)合蛋白酶相同的DH 提高幅度， 證實(shí)氨肽酶比復(fù)合蛋白酶具有更高的催化效率。 隨著氨肽酶加酶量的增大，DH 隨之上升。 而氨肽酶的添加量低于350 U/g 時(shí)， 固形物溶出率沒有顯著性變化，添加量從350 U/g 上升到400 U/g 時(shí)，固形物溶出率提高幅度最高，相比增加了2.37%。此時(shí)氨肽酶在復(fù)合蛋白酶的酶解作用基礎(chǔ)上，持續(xù)切斷肽鏈末端肽鍵，把肽徹底水解成氨基酸。 綜合DH和固形物溶出率的結(jié)果， 選擇400 U/g 為氨肽酶的最優(yōu)添加量。

圖3 氨肽酶添加量對(duì)豌豆蛋白的DH 和固形物溶出率的影響Fig. 3 Effect of aminopeptidase concentration on DH and solid dissolution ratio of pea protein

2.1.4 氨肽酶的酶解時(shí)間 取8.0 g 豌豆蛋白，加水配成80 g/L 溶液，按上述條件用復(fù)合蛋白酶酶解4 h 后，加入400 U/g 的氨肽酶，在50 ℃下分別酶解1、2、3、4、5 h，測(cè)定不同酶解時(shí)間下產(chǎn)物的 DH 與固形物溶出率，結(jié)果見圖4。

圖4 氨肽酶的酶解時(shí)間對(duì)豌豆蛋白的DH 和固形物溶出率的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis time by aminopeptidase on DH and solid dissolution ratio of pea protein

氨肽酶的酶解時(shí)間對(duì)DH 和固形物溶出率影響較大，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，豌豆蛋白DH 與固形物溶出率顯著提高。 與圖2 比較可以看出，在相同的酶解時(shí)間內(nèi)， 氨肽酶比復(fù)合蛋白酶對(duì)豌豆蛋白DH的提高作用更明顯，并且5 h 內(nèi)未達(dá)到平衡狀態(tài)，表明隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行與游離氨基酸的累積，產(chǎn)物的抑制作用并未出現(xiàn)， 因此在相同的酶解條件下，相比于大分子豌豆肽向小分子豌豆肽的轉(zhuǎn)化平衡而言，小分子豌豆肽向氨基酸的轉(zhuǎn)化平衡更難逆向移動(dòng)。 此外，與復(fù)合蛋白酶酶解過程相比，隨著氨肽酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，所得產(chǎn)物固形物溶出率的增加更為顯著。 結(jié)合兩步酶解過程固形物溶出率的變化規(guī)律可知，豌豆蛋白降解為大分子肽時(shí)，水溶性顯著提高； 而大分子肽進(jìn)一步降解為小分子肽時(shí)，在一定的相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)，不同相對(duì)分子質(zhì)量豌豆肽的水溶性無顯著差異；在小分子肽水解為游離氨基酸時(shí)，水溶性顯著提高，游離氨基酸對(duì)豌豆蛋白水解產(chǎn)物水溶性的貢獻(xiàn)最大。 在氨肽酶作用前2 h，豌豆蛋白的DH 增長(zhǎng)較快，但固形物溶出率增長(zhǎng)較慢。 延長(zhǎng)水解時(shí)間到4 h 時(shí)，DH 和固形物溶出率增長(zhǎng)速率均顯著提高，雖然不及4 h 到5 h 的漲幅，但節(jié)約了時(shí)間成本。因此，選擇4 h 為氨肽酶最優(yōu)酶解時(shí)間。

綜上可知，豌豆蛋白酶解最優(yōu)工藝為：3 500 U/g復(fù)合蛋白酶酶解4 h，400 U/g 氨肽酶酶解4 h。 此時(shí)， 酶解液DH 達(dá)到17.48%， 固形物溶出率達(dá)到71.99%。 DH 在一定程度上也可以反映出小分子肽的質(zhì)量濃度。 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果可知，酶解液中相對(duì)分子質(zhì)量小于250 的組分占18.86%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）， 相對(duì)分子質(zhì)量 250 到 1 000 的組分占72.74%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）， 相對(duì)分子質(zhì)量大于1 000 的組分僅有8.40%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）， 表明豌豆蛋白在此酶解參數(shù)下水解程度較高，大分子的蛋白質(zhì)被深度水解成了小分子的氨基酸或肽類。 由表1 可知，豌豆蛋白酶解液中游離氨基酸占水解氨基酸的9.17%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）， 而肽結(jié)合氨基酸占水解氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)90.83%，肽結(jié)合氨基酸質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于游離氨基酸，表明在酶解液中的氨基酸主要都以結(jié)合態(tài)的形式存在。 結(jié)合上述相對(duì)分子質(zhì)量的結(jié)果分析可知，在此最優(yōu)酶解工藝下，豌豆蛋白主要被水解為小分子肽，水解成游離氨基酸的比例較低。 有研究表明，相對(duì)分子質(zhì)量低于1 000 的肽反應(yīng)活性更強(qiáng)，與大分子肽相比，更容易發(fā)生美拉德反應(yīng)[10]。

表1 豌豆蛋白酶解液的氨基酸質(zhì)量濃度Table 1 Mass concentration of amino acids in pea protein hydrolysates

2.2 美拉德反應(yīng)pH 對(duì)褐變程度的影響

美拉德反應(yīng)過程復(fù)雜，時(shí)間、溫度、pH、水分活度等參數(shù)都會(huì)對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響。 其中，反應(yīng)時(shí)間和溫度是兩個(gè)重要因素， 但前人對(duì)其報(bào)道較多，而關(guān)于反應(yīng)pH 的研究較少，尤其是在產(chǎn)物的滋味方面。 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)可知，美拉德反應(yīng)時(shí)間為1 h的產(chǎn)物減鹽增鮮效果最佳， 隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)到2 h 和3 h，MRPs 的減鹽增鮮效果顯著下降， 咸味值分別降低了4.98%和13.51%， 鮮味值分別降低了6.26%和12.98%， 因此后續(xù)研究都以1 h 為美拉德反應(yīng)時(shí)間。

顏色變化是美拉德反應(yīng)最直觀的特征，反應(yīng)液在420 nm 處吸光度可以表示反應(yīng)后期類黑精等深色物質(zhì)的形成程度。 由圖5 可知，在相同溫度下，隨著初始pH 的升高，MRPs 的褐變程度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與孫方達(dá)等[11]的研究結(jié)果相符合。 pH 是影響美拉德反應(yīng)路徑的重要因素之一， 在酸性環(huán)境下，氨基處于質(zhì)子化狀態(tài)，阻礙氨基葡萄糖生成，從而抑制后續(xù)美拉德反應(yīng)進(jìn)行。隨著初始pH 升高，美拉德反應(yīng)速率變快， 加速了Amadori 重排產(chǎn)物及其下游褐變前體物的形成與積累，促進(jìn)了類黑精生成。 而在堿性環(huán)境下， 二羰基化合物具有更強(qiáng)的反應(yīng)活性，容易與豌豆肽側(cè)鏈的胍基、氨基或咪唑基發(fā)生羰氨反應(yīng)進(jìn)而交聯(lián)形成類黑精大分子。 此外，堿性條件有利于糠醛與α-羥基醛發(fā)生羥醛縮合引起環(huán)狀呈色物質(zhì)的形成。 堿性條件還可活化呋喃與吡咯的α 位碳的氫鍵，通過親電取代反應(yīng)引起呋喃醛或吡咯醛之間的聚合，這也是類黑精形成的重要途徑。

圖5 反應(yīng)pH 對(duì)MRPs 的褐變程度的影響Fig. 5 Effect of reaction pH values on the browning degree of MRPs

2.3 美拉德反應(yīng)pH 對(duì)滋味的影響

MRPs 的主要呈味功能是增強(qiáng)咸味食品的醇厚味[12]，同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)豌豆肽MRPs 具有增咸和增鮮功能，為此，通過電子舌分析不同初始pH 下產(chǎn)物的咸味、鮮味增強(qiáng)效果，結(jié)果見表2。 與5 g/L NaCl 溶液對(duì)照組相比，加入5 g/L MRPs 后，溶液鮮味和咸味響應(yīng)值都有了不同程度的提高， 這表明MRPs 具有增咸增鮮的效果。 同時(shí)，pH 越高，MRPs 的增咸和增鮮效果越佳，尤其是在pH 8.4 條件下，溶液的鮮味較另外兩個(gè)樣品分別增長(zhǎng)了36.48%和21.27%，咸味較另外兩個(gè)樣品分別增長(zhǎng)了57.30%和27.61%；與NaCl 對(duì)照組相比，咸味、鮮味分別提高了41.03%和303.39%。有研究表明，氨基酸或小分子肽具有滋味增強(qiáng)作用。 在提高初始pH 的情況下加速了氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)， 可能促進(jìn)一些呈味肽的生成，進(jìn)而促使產(chǎn)物增咸、增鮮的效果得到提升。 如從牛肉湯中分離出來的Alapyridaine[13]、從魚露中分離出來的精氨酸二肽等[14]都曾被報(bào)道具有咸味或鮮味。此外， 在pH 8.4 的初始條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，產(chǎn)物的最終pH 降到了7 左右，也避免了在低pH 下產(chǎn)生的酸澀味會(huì)對(duì)整體滋味起負(fù)面作用。

表2 電子舌測(cè)定的MRPs 增味效果Table 2 Taste enhancement of MRPs measured by electronic tongue

電子舌是一種模擬人的味覺感受機(jī)理研制出的智能檢測(cè)系統(tǒng)，可以以數(shù)字化的形式快速對(duì)食品的多種基本滋味指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 牛云蔚等利用感官評(píng)定和電子舌對(duì)櫻桃酒的多種滋味進(jìn)行比較，得出兩者結(jié)果相關(guān)性很高[15]。 但并沒有研究表明電子舌可以完全取代感官評(píng)價(jià)，且醇厚味是美拉德反應(yīng)過程中形成的特征性滋味，電子舌無法測(cè)定，僅僅能通過感官評(píng)定法來分析。 感官評(píng)定結(jié)果表明（見表3）， 隨著初始 pH 的增加，MRPs 的增味效果都顯著增加。 對(duì)于咸味和鮮味來說，感官評(píng)定與上述電子舌分析結(jié)果一致。 結(jié)合這兩種滋味分析方法可知，在相同的鹽質(zhì)量濃度下， 添加一定量的MRPs 可以在不降低咸味的情況下，減少鹽的攝入，達(dá)成“科學(xué)減鹽”和“減鹽不減咸”的目標(biāo)。

表3 感官評(píng)定獲得的MRPs 的增味效果Table 3 Taste enhancement of MRPs measured by sensory evaluation

2.4 美拉德反應(yīng)pH 對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)在一定程度上共同決定了樣品的香氣特征，因此，通過GCMS 檢測(cè)不同初始反應(yīng)pH 下MRPs 的揮發(fā)性化合物，結(jié)果見表4。 3 個(gè)樣品中檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別為 69.78、82.71、125.94 ng/g，表明反應(yīng) pH 對(duì)美拉德產(chǎn)物的揮發(fā)性物質(zhì)有著較大的影響。 提高反應(yīng)pH 可以促進(jìn)Amadori 化合物及氨基酸的降解、脫氧糖酮的環(huán)化與裂解等反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)小分子揮發(fā)性物質(zhì)的形成。 不同pH 條件下制備的豌豆肽MRPs 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類差別不大， 以酮類和醛類為主，還有少量含氮類和呋喃類化合物。

表4 不同初始pH 條件下制備的MRPs 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4 Composition and mass fraction of volatile flavor compoundsof MRPs prepared at different initial pH

醛類化合物在3 個(gè)樣品中分別為41.47、44.52、92.40 ng/g，是主要的風(fēng)味物質(zhì)，且因?yàn)樗拈撝递^低，對(duì)樣品風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度比較大。 醛類主要是由脫氧糖酮逆醛化或氨基酸Strecker 降解產(chǎn)生的，在所有樣品中均檢出了己醛、壬醛和苯甲醛。 己醛和壬醛主要呈現(xiàn)出花果香味[16]，而苯甲醛具有櫻桃或苦杏仁香味[17]。

在美拉德反應(yīng)中，含氮化合物由氨基酸羰氨縮合并進(jìn)一步降解生成，氨基在較低的pH 下質(zhì)子化，無法進(jìn)行親核進(jìn)攻，因此較難形成含氮揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。 含有堅(jiān)果、焙烤風(fēng)味的吡嗪、2-甲基吡嗪只有在pH 大于7.4 時(shí)才生成， 含氮化合物總含量隨著pH 的升高而增加，這與前人的研究結(jié)果一致[18]。 呋喃化合物具有水果、焦糖香，可能是由還原糖降解生成的，雖然其含量較低，但對(duì)美拉德產(chǎn)物整體香氣也起到了一定的修飾作用[19]。 綜上分析，初始pH的提高可以促進(jìn)MRPs 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)釋放， 在提高滋味的同時(shí)，使整體香氣更濃郁。

3 結(jié) 語

以豌豆蛋白為原料，采用酶解技術(shù)與美拉德反應(yīng)相結(jié)合的方法，制備了具有滋味（咸味、鮮味和醇厚味）增強(qiáng)及整體風(fēng)味濃郁的產(chǎn)物。 優(yōu)化后的豌豆肽制備工藝為雙酶分步酶解： 先加入3 500 U/g 的復(fù)合蛋白酶，在60 ℃、pH 8.0 下酶解4 h，然后加入400 U/g 的氨肽酶，在50 ℃下繼續(xù)酶解4 h，在此條件下得到的豌豆蛋白酶解液的DH 為17.48%，固形物溶出率為71.99%，酶解液中相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 的組分占91.60%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）， 肽結(jié)合氨基酸

占總氨基酸的90.83%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），酶解產(chǎn)物主要是小肽。 在美拉德反應(yīng)中， 初始pH 分別調(diào)節(jié)到6.4、7.4 和 8.4， 發(fā)現(xiàn) MRPs 的褐變程度隨著 pH 的提高而提高。 由電子舌分析和感官評(píng)定法的共同結(jié)果可知， 在相同的鹽質(zhì)量濃度下，5 g/L 的MRPs 具有增強(qiáng)咸味、鮮味和醇厚味的作用，且pH 越高，增味作用越強(qiáng)， 這也意味著添加MRPs 可以達(dá)到一定的減鹽不減咸效果。 GC-MS 結(jié)果表明，提高pH 可以加快美拉德反應(yīng)速率，增加MRPs 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。目前，由于美拉德反應(yīng)的復(fù)雜性，MRPs 增加滋味的機(jī)理尚未明晰，后續(xù)可以從味覺受體和味覺感知生理學(xué)等方面進(jìn)一步探究。