劉媛媛 薛念宇 張博熙 李士澤 呂紅明

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319)

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗設(shè)計

體內(nèi)慢性冷暴露模型建立：將12只3周齡C57BL/6雄性小鼠(購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物中心)，體重(22±1) g，隨機分為2組(對照組和冷暴露組)，每組6只。先將小鼠置于人工智能氣候室中進(jìn)行為期7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)，環(huán)境溫度設(shè)定為(28.0±0.5) ℃，相對濕度為(40±5)%，自由采食、飲水。日光燈照明，明暗周期比為1∶1(開燈08：00，關(guān)燈20：00)。然后將冷暴露組小鼠每日隨機置于4 ℃環(huán)境中3 h，連續(xù)4周，冷暴露結(jié)束后將小鼠同時安樂死，并收集其血液和肝臟。將血液樣本靜置在4 ℃冰箱中12 h，然后3 500 r/min離心20 min，取上清液至1.5 mL離心管中保存。將肝臟放進(jìn)1.5 mL離心管中，做好標(biāo)記保存在-80 ℃冰箱。試驗涉及的試驗動物操作符合黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)(20180328002)。

體外冷暴露模型建立：將小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞(購自美國ATCC公司)隨機分為4組(對照組、冷暴露1 h組、冷暴露3 h組、冷暴露6 h組)，先在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將冷暴露組細(xì)胞置于32 ℃培養(yǎng)箱中分別亞低溫冷刺激0、12、24、36 h，冷刺激結(jié)束后將細(xì)胞刮取下來進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.1.2 主要試劑

Trx-1(1∶1 000，A0053)抗體購自ABclonal公司(中國)；TXNIP(1∶1 000，A0053)抗體購自ABclonal公司(中國)；辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)(1∶10 000，#SA00001-1，Proteintech，美國)；HRP山羊抗兔IgG(1∶10 000，#SA00001-2，Proteintech，美國)。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶由賽默飛世爾生物化學(xué)制品(美國)有限公司生產(chǎn)；Solarbio血清由北京Solarbio & Technology公司生產(chǎn)；磷酸鹽緩沖液(PBS)由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

每天對小鼠肝細(xì)胞系進(jìn)行換液，2 d進(jìn)行1次傳代。將DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)和青鏈雙抗分別按照90%、10%和1%的比例配制成細(xì)胞完全培養(yǎng)基。首先將凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，操作步驟:1)將完全培養(yǎng)基、PBS和胰酶提前在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱30 min，同時將酒精燈、PE手套、15 mL離心管、50 mL離心管、移液槍、槍頭等放進(jìn)無菌操作臺進(jìn)行紫外滅菌30 min；2)將凍存的小鼠肝細(xì)胞系從液氮罐中取出，迅速放入37 ℃水浴鍋中融化，約1 min后取出，放入無菌操作臺中；3)從凍存管中吸出培養(yǎng)基放進(jìn)15 mL離心管中，并緩慢加入1 mL完全培養(yǎng)基，用移液槍來回吹打混勻；4)然后1 000 r/min離心4 min，離心結(jié)束后吸棄上層培養(yǎng)基；5)加入2 mL PBS，1 000 r/min離心4 min，離心結(jié)束后吸棄上層PBS；6)再加入1 mL完全培養(yǎng)基，吹打混勻后轉(zhuǎn)移到含有4 mL完全培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中，“8”字混勻后轉(zhuǎn)移到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，操作步驟:1)待細(xì)胞長滿70%～80%后，先吸棄細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基，加入PBS 2 mL，對細(xì)胞進(jìn)行清洗，之后再吸棄PBS；2)加入1 mL胰酶，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中約1 min，待貼壁細(xì)胞完全消化后，拿到無菌操作臺中，加入2 mL完全培養(yǎng)基進(jìn)行終止反應(yīng)，并輕輕吹打細(xì)胞瓶底部，以保證細(xì)胞完全脫離；3)將細(xì)胞瓶中含有的完全培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1 000 r/min離心4 min，離心結(jié)束后吸棄上層培養(yǎng)基；4)然后加入2 mL PBS，輕輕地將細(xì)胞吹散，1 000 r/min離心4 min，離心結(jié)束后吸棄上層PBS；5)加入1 mL完全培養(yǎng)基，吹打混勻后轉(zhuǎn)移到含有4 mL完全培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中，“8”字混勻后轉(zhuǎn)移到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞系完全穩(wěn)定后開始試驗。

本文提出了對于接入海上風(fēng)電場的區(qū)域電網(wǎng)的多風(fēng)電場無功優(yōu)化算法,在MATLAB中驗證所提出算法的有效性和正確性。

1.2.2 細(xì)胞計數(shù)

先將肝細(xì)胞用胰酶消化下來，然后往消化下來的細(xì)胞中加入完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，充分混合后，吸取10 μL細(xì)胞懸液與10 μL臺盼藍(lán)染色液混合，混合均勻后吸取10 μL滴加在血細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)并記錄。然后將細(xì)胞平均鋪到8個35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞放入32 ℃培養(yǎng)箱中冷刺激12、24、36 h，冷刺激結(jié)束后將細(xì)胞消化下來，再次進(jìn)行計數(shù)并記錄。

1.2.3 血清生化指標(biāo)

小鼠血清中MDA和GSH含量分別按照碧云天的MDA和GSH檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 Western Blot檢測抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)

先用NP40裂解液(碧云天，中國)分別提取細(xì)胞和肝臟組織的總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，中國)進(jìn)行蛋白濃度的測定，然后把蛋白濃度調(diào)成一致。首先配制10%或者12%的分離膠、5%濃縮膠，按每孔20 μg蛋白量上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。其次根據(jù)“三明治”結(jié)構(gòu)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉-三羥甲基氨基甲烷(Tris)鹽溶液和吐溫-20(TBST)溶液室溫封閉1 h，然后一抗4 ℃過夜。第2天先用TBST洗滌5次，每次5 min，然后按1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG配制成二抗，室溫孵育1 h。最后再用TBST洗滌5次，每次5 min。滴加顯影劑后，在化學(xué)放光檢測器中顯影，用Image Pro Plus 5.0軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均通過統(tǒng)計軟件Graphpad Prism 5.0完成。對照組和冷暴露組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性冷暴露對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

如圖1所示，與對照組相比，冷暴露組小鼠血清中的GSH含量被顯著抑制(P<0.05)，而MDA含量顯著增加(P<0.05)。

與對照組相比，NS表示差異不顯著(P>0.05)，*表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 體外冷刺激對AML12細(xì)胞活力的影響

如表1所示，與對照組相比，隨著冷刺激時間的延長，活細(xì)胞數(shù)量逐漸下降(P<0.05)，并表現(xiàn)出一定的時間依賴性，說明冷刺激可能對細(xì)胞生長增殖產(chǎn)生一定的抑制作用。

表1 體外冷刺激對AML12細(xì)胞活力的影響

2.3 不同冷暴露時間對小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞抗氧化蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與對照組相比，冷暴露3和6 h后，抗氧化蛋白Trx-1的表達(dá)量顯著減少(P<0.05)。而冷暴露6 h后，TXNIP蛋白的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。結(jié)果說明冷暴露會導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞AML12的抗氧化功能受到抑制。

TXNIP：硫氧還蛋白互作蛋白 thioredoxin interacting protein；Trx-1：抗氧化蛋白硫氧還蛋白-1 thioredoxin-1；β-actin:β-肌動蛋白。

2.4 慢性冷暴露對小鼠肝臟組織中抗氧化蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與對照組相比，冷暴露小鼠的肝臟組織中抗氧化蛋白Trx-1的蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，TXNIP蛋白的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，與體外試驗結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了冷刺激會抑制抗氧化蛋白的表達(dá)，降低抗氧化功能。

TXNIP：硫氧還蛋白互作蛋白 thioredoxin interacting protein；Trx-1：抗氧化蛋白硫氧還蛋白-1 thioredoxin-1；Tubulin:微管蛋白。

3 討 論

3.1 慢性冷暴露對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

王金濤[5]的研究表明，冷應(yīng)激會造成機體的抗氧化功能受到不同程度的影響。在生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)氧化動態(tài)平衡受到活性氧(ROS)的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)防御機制，以及抗氧化酶的嚴(yán)格調(diào)控。比如GSH是哺乳動物細(xì)胞中含量最豐富的非蛋白硫醇，它所在的GSH系統(tǒng)能夠與Trx-1交叉提供電子，并作為彼此的備份系統(tǒng)，一起控制哺乳動物細(xì)胞中的氧化還原環(huán)境[6]，其活性的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力；MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)后產(chǎn)生的氧化終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，其含量是反映機體抗氧化潛力的重要指標(biāo)。本試驗結(jié)果表明，4 ℃慢性冷暴露后會導(dǎo)致小鼠血清中GSH含量顯著減少，MDA含量顯著增加，說明機體在暴露于寒冷環(huán)境中會使抗氧化酶的活性降低，氧化產(chǎn)物增多，從而導(dǎo)致抗氧化能力下降。

3.2 慢性冷暴露對小鼠肝細(xì)胞活性的影響

李寶貴等[7]的研究表明，大鼠在低溫刺激后，肝細(xì)胞間隙變小，肝臟血竇結(jié)構(gòu)突出明顯，肝細(xì)胞會發(fā)生變形，并且隨著低溫刺激時間的延長，這些變化更加明顯。蘇瑩瑩[8]通過蘇木精-伊紅(H&E)染色觀察到，大鼠暴露于低溫后，肝臟細(xì)胞會發(fā)生水腫，有絲分裂增加并且出現(xiàn)大量的雙核細(xì)胞和少量的凋亡細(xì)胞；電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞糖原減少，線粒體發(fā)生輕微腫脹。本試驗結(jié)果表明，小鼠肝細(xì)胞AML12用32 ℃亞低溫處理后，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，并呈現(xiàn)出一定的時間依賴性減少趨勢，說明冷暴露會對細(xì)胞造成損傷，產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。

3.3 慢性冷暴露對小鼠肝細(xì)胞及肝臟組織中抗氧化蛋白表達(dá)的影響

肝臟作為體內(nèi)重要的代謝器官，也是體內(nèi)最大的糖原儲存器官和靜息狀態(tài)時主要的產(chǎn)熱器官，在受到冷應(yīng)激后，會產(chǎn)生不同程度的損傷[9]。此外，當(dāng)動物暴露于低溫環(huán)境中，會導(dǎo)致肝糖原被大量消耗，分解為葡萄糖為機體提供能量底物，但此時肝臟通過偶聯(lián)作用產(chǎn)熱，這樣會使肝臟出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷[10]。同時，機體其他組織和器官的大量能量代謝中間產(chǎn)物可以通過血液運輸?shù)礁闻K，在肝臟內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，形成新的能量底物或被肝臟代謝，同樣導(dǎo)致肝臟代謝率增加和ROS的產(chǎn)量增加[11]。在體內(nèi)，Trx系統(tǒng)由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、TrxR和TXNIP組成，通過其二硫鍵還原酶活性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)二硫醇/二硫鍵平衡，從而成為抵御氧化應(yīng)激的關(guān)鍵抗氧化系統(tǒng)，是氧化蛋白的還原劑[12]。Trx-1的抗氧化功能還表現(xiàn)在通過減少核苷酸還原酶、蛋氨酸亞砜還原酶和調(diào)節(jié)許多氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子的活性來參與DNA和蛋白質(zhì)修復(fù)[13-14]。TXNIP是Trx-1的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可以阻礙其保護(hù)作用[15]。因此，Trx-1通過與TXNIP相互作用蛋白在免疫反應(yīng)、病毒感染和細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用[16-17]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性冷暴露會導(dǎo)致小鼠肝臟和AML12細(xì)胞中抗氧化蛋白Trx-1的表達(dá)量顯著減少，TXNIP的蛋白表達(dá)量顯著增加，進(jìn)一步說明了慢性冷暴露會導(dǎo)致小鼠肝臟的抗氧化能力下降。

目前，畜禽場主要通過以下幾個方面防控冷應(yīng)激，比如加強動物房舍系統(tǒng)的防風(fēng)和保暖功能；通過改善飼糧的配方加強畜禽的御寒能力；或者繁殖出抗寒的品種等[18-20]。本研究涉及相關(guān)指標(biāo)的檢測與整合將有助于拓展冷應(yīng)激對小鼠肝臟抗氧化功能的認(rèn)識，對提升畜牧抗寒能力、保證畜牧業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。

4 結(jié) 論

① 32 ℃亞低溫處理后，AML12細(xì)胞數(shù)量顯著減少，抗氧化蛋白Trx-1的表達(dá)量顯著降低，說明冷刺激一段時間后會對小鼠肝細(xì)胞造成一定的氧化損傷。

② 4 ℃慢性冷暴露4周后，小鼠肝臟中抗氧化蛋白Trx-1的表達(dá)量顯著降低以及血清中GSH和MDA的含量顯著增加，進(jìn)一步說明了冷暴露會導(dǎo)致小鼠肝臟抗氧化功能受損。