丁永旺 任 曼 趙春芳 顧有方,2 靳二輝,2* 李升和,2*

(1.安徽科技學院動物科學學院，鳳陽233100；2.動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點實驗室，鳳陽233100)

硼是自然界中廣泛存在的一種非金屬元素，兼有金屬元素性質(zhì)，通常以硼酸或硼酸鹽形態(tài)存在于土壤、水和巖石中。研究表明，硼是人和動物不可缺少的微量元素之一，可促進礦物質(zhì)代謝、能量代謝、大腦功能和免疫反應，降低關節(jié)炎的風險，并參與降低某些癌癥發(fā)生率[1-4]。硼攝入不足會導致骨骼發(fā)育、大腦反應和免疫功能受損[5]。在培養(yǎng)的動物細胞中，降低硼含量可誘導絲裂原活化蛋白激酶激活，敲除硼離子轉運蛋白則導致細胞生長和增殖受到抑制[6]。研究發(fā)現(xiàn)，適量補充硼能夠改善許多代謝酶活性，調(diào)節(jié)動物骨骼發(fā)育及礦物質(zhì)和能量代謝，增強抗氧化功能和免疫功能，促進T淋巴細胞分化，降低血清甘油三酯含量[7-9]。添加低劑量(0.01～0.10 mmol/L)硼可促進細胞因子分泌，抑制鴕鳥脾臟淋巴細胞凋亡，而添加高劑量(25～100 mmol/L)硼則產(chǎn)生相反的作用[10]。經(jīng)口灌胃100 mg/kg硼酸能夠顯著升高乙醇誘導的肝臟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性減低，減少肝臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和半胱天冬蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)陽性細胞數(shù)量，從而減弱乙醇誘導的肝臟氧化損傷[11]。飲水補充100 mg/L硼對肉雞免疫器官(脾臟和胸腺)發(fā)育和顯微結構改善均可產(chǎn)生積極影響[12]。但是，高劑量硼對人和動物機體可產(chǎn)生不良影響，甚至具有一定毒性作用。有研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充640 mg/L硼導致大鼠抗氧化能力明顯下降，機體膽固醇、脂類、糖類及離子代謝發(fā)生紊亂[13]。

以上研究表明，不同劑量硼可對動物機體多種生理功能產(chǎn)生不同影響，但其作用機制尚不清楚。肝臟是動物機體最大的消化腺，在維持營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和代謝、有毒物質(zhì)降解及免疫調(diào)節(jié)等方面起著至關重要的作用，肝臟顯微結構和生理功能改變可直接影響動物機體消化功能和免疫功能。然而，不同劑量硼對哺乳動物肝臟顯微結構、抗氧化功能和細胞增殖和凋亡產(chǎn)生何種影響并不清楚。因此，本研究以大鼠為試驗動物，研究不同劑量硼對肝臟顯微結構、肝糖原含量、抗氧化功能及細胞增殖和凋亡相關基因表達的影響，為揭示硼影響動物生理功能的作用機制及其在人和動物生活生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

1.1.1 試驗材料

SD大鼠購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證號：SCXK(蘇)2017-001。硼酸(H3BO3)購自國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120524，分析純，純度≥99.5%，硼含量≥17.4%。

1.1.2 試驗設計

選用清潔級剛斷乳的(22±2)日齡健康雄性SD大鼠100只，適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為10組，每組10只。對照組飲用蒸餾水(硼含量為0)，試驗組(Ⅰ～Ⅸ組)分別飲用硼含量為5、10、20、40、80、160、320、480、640 mg/L的蒸餾水。試驗期60 d。所有試驗大鼠均飼喂普通大鼠基礎飼糧，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。動物使用由安徽科技學院試驗動物倫理委員會審查和批準，所有試驗程序均嚴格按照安徽省《試驗動物的護理和使用指南》進行。動物飼養(yǎng)在安徽科技學院試驗動物房大鼠獨立通氣籠盒(individually ventilated cages，IVC)內(nèi)，室溫控制在22～25 ℃，相對濕度控制在50%～60%，給予14 h光照10 h黑暗光照周期，自由采食和飲水。動物飼養(yǎng)前所有籠子、蓋子和水瓶均進行消毒處理。

1.2 樣品采集

試驗結束時，大鼠禁食不禁水過夜，稱重，右心房采血并放血處死，迅速分離肝臟，一部分固定于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，一部分固定于卡諾(Carnoy)固定液中用于肝糖原過碘酸希夫反應(periodic acid-Schiff，PAS)染色，另一部分經(jīng)液氮冷凍后于-80 ℃保存用于抗氧化指標測定及總RNA提取。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 肝臟組織學觀察

大鼠肝臟經(jīng)4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液充分固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、石蠟輪轉切片機切片(厚6 μm)，每10張切片取1片用于HE染色，方法參照Jin等[14]。染色結果使用全自動數(shù)字切片掃描與應用系統(tǒng)[VM1，麥克奧迪(廈門)醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司]進行觀察并拍照。

1.3.2 PAS染色分析

大鼠肝臟經(jīng)卡諾固定液充分固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、石蠟輪轉切片機切片(厚6 μm)，每10張切片取1片用于PAS染色。肝臟切片脫蠟至水，在1%過碘酸水溶液中氯化5 min，流水沖洗5 min，再用蒸餾水漂洗，加入Schiff試劑中反應15 min，亞硫酸鈉溶液洗滌3次(每次2 min)，流水沖洗10 min，蘇木精對細胞核進行染色后進行脫水透明，中性樹膠封片。使用全自動數(shù)字切片掃描與應用系統(tǒng)進行觀察并拍照。每個肝臟組織取5張肝臟切片進行PAS染色，每張PAS染色切片按照上、下、左、右、中的順序選取5個視野拍照，然后用Image Pro Plus 6.0測定PAS染色的積分光密度值(integral optical density value)。

1.3.3 抗氧化功能測定

采用試劑盒測定肝臟組織勻漿中MDA含量和SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性以及總抗氧化能力(T-AOC)，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 實時熒光定量PCR測定

參考屈勝勝[15]報道方法進行大鼠肝臟組織總RNA提取。用NanoDrop One超微量核酸蛋白測定儀(Thermo公司，美國)檢測提取的肝臟總RNA的濃度和質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。然后按照反轉錄試劑盒(Thermo公司，美國)操作說明合成第1條cDNA鏈。實時熒光定量PCR測定方法參考Liu等[16]的報道，并按照實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)操作說明進行核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、依賴還原型輔酶Ⅰ(Ⅱ)醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1，NQO1]、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、Caspase-3、B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia-2-associated X protein，Bax)和B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)mRNA相對表達量測定，每個樣品測定3次，測定儀器為480Ⅱ實時熒光定量PCR儀(Roche公司，瑞士)。引物序列如表2所示，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參基因，測定結果采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

表2 引物序列

續(xù)表2基因Genes登錄號Accession number引物序列Primer sequence (5'—3')產(chǎn)物長度Product length/bp退火溫度Tm/℃依賴還原型輔酶Ⅰ(Ⅱ)醌氧化還原酶1NQO1NM_017000.3F:GCTTGTAGCAGGATTCGCCTR:ATGACGTTCATGTCCCCGTG144593-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDHNM_017008.4F:GGCAAGTTCAACGGCACAGR:CCCGTAGTCGCCTTCCCCG23260

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

測定數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，不同試驗組之間差異顯著性采用Duncan氏法進行檢驗。數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)表示，P<0.05為顯著差異，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟顯微結構的影響

由圖1可知，對照組大鼠肝臟顯微結構正常，肝小葉輪廓清晰，肝細胞索排列整齊，肝血竇寬窄適當，肝細胞結構清晰，肝枯否氏細胞數(shù)量適中(圖1-A)。與對照組相比，試驗Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組大鼠肝臟顯微結構明顯改善，肝細胞索排列更加整齊，肝血竇變窄，肝細胞增大，雙核肝細胞數(shù)量增多，枯否氏細胞數(shù)量有所增多，其中試驗Ⅲ組肝臟中靠近中央靜脈周圍的肝細胞中出現(xiàn)少量的脂滴(圖1-B、圖1-C和圖1-D)。試驗Ⅳ組大鼠肝細胞索排列稍顯紊亂，肝血竇變窄，肝細胞核染色較深，肝枯否氏細胞增多，中央靜脈周圍的肝細胞中脂滴增多(圖1-E)。試驗Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組大鼠肝臟顯微結構有所損傷，肝小葉輪廓不清，肝細胞索排列紊亂，肝血竇增寬，雙核肝細胞數(shù)量逐漸減少，肝細胞染色逐漸加深，肝枯否氏細胞逐漸增加，含有脂滴的肝細胞數(shù)量和分布明顯增加(圖1-F、圖1-G和圖1-H)。試驗Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟明顯受損，肝小葉輪廓模糊，肝細胞索排列非常紊亂，肝血竇顯著增寬，肝細胞核出現(xiàn)固縮，部分肝細胞出現(xiàn)溶解，肝枯否氏細胞顯著增加，并在局部出現(xiàn)聚集，肝細胞中脂滴數(shù)量顯著增加，部分肝細胞中出現(xiàn)較大的空泡樣結構(圖1-I和圖1-J)。

A：對照組；B：試驗Ⅰ組；C：試驗Ⅱ組；D：試驗Ⅲ組；E：試驗Ⅳ組；F：試驗Ⅴ組；G：試驗Ⅵ組；H：試驗Ⅶ組；I：試驗Ⅷ組；J：試驗Ⅸ組。圖2同。

2.2 飲水補充同劑量硼對大鼠肝臟中肝糖原分布和含量的影響

由圖2可知，大鼠肝臟中肝糖原PAS染色陽性細胞中可見粉紅色或者淡紅色顆粒，主要分布在中央靜脈周圍。對照組肝臟中可見少量的PAS染色陽性細胞，主要分布在中央靜脈周圍(圖2-A)。與對照組相比，試驗Ⅰ組大鼠肝臟中PAS染色陽性細胞數(shù)量增多，分布增加，主要分布在中央靜脈周圍及部分肝小葉邊緣(圖2-B)。試驗Ⅱ組大鼠肝臟中PAS染色陽性細胞數(shù)量明顯增多，PAS陽性反應增強，分布區(qū)域明顯增大，中央靜脈和肝肝小葉邊緣均分布有較多的PAS染色陽性細胞(圖2-C)。試驗Ⅲ和Ⅳ組大鼠肝臟PAS染色陽性細胞數(shù)量和分布無明顯差異(圖2-D和2-E)。然而，試驗Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟中PAS染色陽性細胞數(shù)量明顯減少，陽性染色較淡，幾乎看不見PAS染色陽性細胞(圖2-F、圖2-G、圖2-H、圖2-I和圖2-J)。

圖2 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟PAS染色的影響

由圖3可知，與對照組相比，試驗Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟中肝糖原含量分別極顯著增加了20.21%和37.52%(P<0.01)，而試驗Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟中肝糖原含量分別極顯著降低了17.99%、22.53%、15.47%、55.42%和64.41%(P<0.01)，但試驗Ⅲ和Ⅳ組大鼠肝臟中肝糖原含量無顯著變化(P>0.05)。

與對照組相比，數(shù)據(jù)柱標*表示差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)柱標**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.3 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟抗氧化功能的影響

由圖4可知，與對照組相比，試驗Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟SOD活性分別顯著或極顯著提高了48.20%和64.66%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟SOD活性差異不顯著(P>0.05)；試驗Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟T-AOC分別顯著提高了24.86%和28.03%(P<0.05)，試驗Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟T-AOC分別顯著或極顯著下降了27.14%和58.08%(P<0.05或P<0.01)，試驗Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組大鼠肝臟T-AOC差異不顯著(P>0.05)；試驗Ⅰ組大鼠肝臟GSH-Px活性極顯著提高了39.60%(P<0.01)，其余各組大鼠肝臟GSH-Px活性差異不顯著(P>0.05)；試驗Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟MDA含量顯著或極顯著提高了49.30%和73.06%(P<0.05或P<0.01)，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組大鼠肝臟MDA含量差異不顯著(P>0.05)。

圖4 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟抗氧化功能的影響

由圖5可知，與對照組相比，試驗Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟Nrf2 mRNA相對表達量分別顯著提高了32.00%和26.67%(P<0.05)，而試驗Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟Nrf2 mRNA相對表達量分別顯著或極顯著降低了34.67%和50.67%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟Nrf2 mRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)；試驗Ⅰ組大鼠肝臟NQO1 mRNA相對表達量顯著提高了26.87%(P<0.05)，而試驗Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟NQO1 mRNA相對表達量分別顯著或極顯著降低了38.81%和53.73%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟NQO1 mRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)。

圖5 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟Nrf2(A)和NQO1(B)mRNA相對表達量的影響

2.4 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟細胞增殖和凋亡相關基因表達的影響

由圖6可知，與對照組相比，試驗Ⅰ和Ⅱ組大鼠肝臟PCNAmRNA相對表達量分別極顯著提高了25.16%和35.04%(P<0.01)，而試驗Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟PCNAmRNA相對表達量分別極顯著降低了29.52%、42.23%、57.45%、57.00%、61.17%和63.29%(P<0.01)，試驗Ⅲ組大鼠肝臟PCNAmRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)；試驗Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟Caspase-3 mRNA相對表達量分別顯著或極顯著提高了44.51%、39.86%、57.57%和65.82%(P<0.05或P<0.01)，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組大鼠肝臟Caspase-3 mRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)；試驗Ⅱ組大鼠肝臟BaxmRNA相對表達量顯著降低了12.07%(P<0.05)，而試驗Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟BaxmRNA相對表達量分別顯著或極顯著提高了16.72%、22.29%、30.65%和31.58%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟BaxmRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)；試驗Ⅱ組大鼠肝臟Bcl-2 mRNA相對表達量顯著提高了14.48%(P<0.05)，而試驗Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組大鼠肝臟Bcl-2 mRNA相對表達量分別顯著或極顯著降低了14.47%、22.56%、14.76%、32.31%和34.54%(P<0.05或P<0.01)，其余各組大鼠肝臟Bcl-2 mRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)。

圖6 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟PCNA(A)、Caspase-3(B)、Bax(C)和Bcl-2(D)mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟顯微結構和肝糖原含量的影響

肝臟作為動物機體重要的消化器官，具有消化營養(yǎng)物質(zhì)的功能，還負責營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和利用以及合成機體必需的大分子物質(zhì)。更重要的是，肝臟還具有解毒、參與免疫及造血作用，是動物機體非常重要的多功能器官之一。肝臟多種功能的發(fā)揮與其組織結構密切相關，肝臟組織結構是肝臟功能正常發(fā)揮的基礎，肝臟顯微結構的改變直接影響肝臟的功能狀況。研究發(fā)現(xiàn)，補充不同劑量硼能夠對動物許多器官的顯微結構產(chǎn)生影響[17-18]。王為等[19]對非洲鴕鳥研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充80 mg/L硼有利于肝臟發(fā)育，可改善肝臟組織結構，使肝血竇內(nèi)枯否氏細胞增多，肝血竇增大，而飲水補充320和640 mg/L硼則對非洲雛鴕鳥肝臟發(fā)育產(chǎn)生損傷影響，導致肝臟組織出現(xiàn)明顯病理學變化，肝板排列混亂，細胞與細胞間分界模糊，細胞核出現(xiàn)碎裂或固縮，肝血竇狹小。諸亞平等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充100 mg/L硼對固始雞發(fā)育后期(3～6周齡)肝臟組織結構有明顯改善和促進作用，而飲水補充大于200 mg/L硼則對固始雞肝臟組織結構發(fā)育有明顯不良影響。本研究也發(fā)現(xiàn)，飲水補充5～20 mg/L硼可明顯改善大鼠肝臟顯微結構，肝小葉輪廓更加清晰，肝細胞索排列更加整齊，肝血竇變窄，雙核肝細胞數(shù)量增多，肝枯否氏細胞數(shù)量增加，表明飲水補充適量硼對哺乳動物肝臟顯微結構可產(chǎn)生明顯改善作用，進而促進肝臟發(fā)育，增強肝臟功能。然而，飲水補充480和640 mg/L硼則導致大鼠肝臟顯微結構受損，出現(xiàn)明顯的脂肪沉淀、炎性細胞浸潤以及肝細胞溶解，進而損傷肝細胞功能。其原因可能是適量的補充硼可以促進腸道組織結構的發(fā)育，從而增強胃腸吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力，為肝細胞生長提供充足的營養(yǎng)需要。然而，補充高劑量的硼則損害腸道顯微結構，嚴重影響腸道消化吸收功能[18]，進而影響大鼠肝臟的發(fā)育。

糖原是動物機體重要的能量來源，主要分為肝糖原和肌糖原，動物消化器官吸收的糖類營養(yǎng)物質(zhì)被利用后，多余的分別被肝細胞和肌細胞合成為肝糖原和肌糖原。肝臟是肝糖原的主要儲藏庫，用于維持動物機體的血糖水平。肝糖原含量的變化可以直接反映肝臟功能，肝糖原含量降低則可能導致動物機體出現(xiàn)低血糖癥狀[21]。研究表明，補充不同劑量硼可對動物肝糖原含量產(chǎn)生明顯影響。哈西卜哈利克[22]研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充80 mg/L硼能夠顯著增加非洲鴕鳥肝臟中肝糖原含量，而飲水補充640 mg/L硼則顯著降低肝糖原含量。有研究報道，補充20和40 mg/L硼可使肥胖大鼠肝細胞內(nèi)肝糖原含量明顯增多，而補充80 mg/L硼導致肥胖大鼠肝臟PAS染色陽性細胞數(shù)量明顯減少[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充5和10 mg/L硼可顯著增加PAS染色陽性細胞的數(shù)量和分布，增強PAS染色，而飲水補充480和640 mg/L硼則導致PAS染色陽性細胞數(shù)量顯著減少。這表明適量補充硼能夠適當促進肝糖原合成儲存，而補充高劑量硼則導致肝糖原含量顯著減少，分析原因可能包括以下2方面：一方面，高劑量硼導致大鼠肝臟內(nèi)硼含量增多，造成肝細胞出現(xiàn)硼中毒，進而引起肝細胞結構受損，肝糖原合成儲存功能受到抑制；另一方面，高劑量硼引起動物機體發(fā)生應激反應，加快了機體對肝臟中肝糖原的利用，進而導致肝糖原含量減少[22]。另外，Javed等[24]研究發(fā)現(xiàn)，金屬中毒后導致動物糖原儲備減少，而硼兼具有金屬性質(zhì)，很可能過多的硼在動物肝臟內(nèi)積累會產(chǎn)生同樣效果。

3.2 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟抗氧化功能的影響

氧自由基是動物機體有氧呼吸過程中產(chǎn)生的物質(zhì)，當機體處于正常狀態(tài)時，氧自由基產(chǎn)生與消除呈現(xiàn)一種動態(tài)平衡，而當機體健康狀況出現(xiàn)異常時，這種平衡被打破，大量氧自由基產(chǎn)生不能被消除，進而損害細胞結構。動物機體清除氧自由基主要由抗氧化系統(tǒng)來完成。機體抗氧化系統(tǒng)主要由抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)組成[25]。其中，SOD和GSH-Px是動物體內(nèi)2種重要的抗氧化酶[26]，SOD和GSH-Px活性高低可以間接反映機體清除自由基能力[27]。T-AOC是反映器官組織整個抗氧化能力的一個重要指標[28]，而MDA含量是機體氧化反應中主要代謝產(chǎn)物，對細胞膜可產(chǎn)生損傷作用，其含量間接反映器官組織氧化程度[29]。此外，Nrf2在機體清除氧自由基的復雜系統(tǒng)中起著重要作用，其可通過調(diào)控部分抗氧化酶基因表達而發(fā)揮抗氧化作用。NQO1是Nrf2基因調(diào)控的下游基因之一，NQO1通過維持泛醌和α-生育酚醌的還原形式，在保護內(nèi)源性抗氧化劑中起關鍵作用[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充40 mg/L硼可提高脾臟抗氧化能力，改善脾臟組織結構；而飲水補充大于80 mg/L硼可降低脾臟抗氧化能力，破壞脾臟組織結構[17]。也有研究顯示，飲水補充10和20 mg/L硼可增加大鼠胸腺GSH-Px活性，顯著提高胸腺SOD活性和T-AOC，降低胸腺MDA含量，而飲水補充480和640 mg/L硼則對大鼠胸腺中這4個指標產(chǎn)生了相反影響[31]。Yamada等[32]研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L硼酸處理可以激活DU-145前列腺癌細胞Nrf2基因并增加NQO1基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飲水補充5 mg/L硼可增加大鼠肝臟SOD、GSH-Px活性和T-AOC，提高Nrf2和NQO1 mRNA相對表達量；飲水補充10 mg/L硼也能增加大鼠肝臟SOD活性和T-AOC，提高Nrf2 mRNA相對表達量。這表明飲水中添加5和10 mg/L硼可提升大鼠肝臟抗氧化酶活性，提高大鼠肝臟抗氧化功能。然而，飲水補充480和640 mg/L硼則降低大鼠肝臟SOD、GSH-Px活性和T-AOC，并降低Nrf2和NQO1 mRNA相對表達量，從而降低機體清除自由基的能力，使MDA含量增加。分析硼影響抗氧化功能的原因可能是：硼可以通過硼酸核受體介導，刺激轉錄因子激活，調(diào)節(jié)活性氧清除相關基因的表達，進而發(fā)揮抗氧化作用[33]；也可能是硼對機體氧化應激的抑制作用和對酶活性的抑制作用[34]。硼的抗氧化作用與微量元素硒的抗氧化功能有所不同，硒的抗氧化功能主要體現(xiàn)在硒以硒半胱氨酸和硒蛋氨酸2種形式存在于硒蛋白中，而硒蛋白參與動物機體抗氧化體系的組成，調(diào)節(jié)動物機體的自由基代謝和抗氧化酶活性，進而影響機體抗氧化功能[35]。另外，飲水補充40～320 mg/L硼引起大鼠肝臟SOD和GSH-Px活性增加，這提示機體可能通過代償機制增強肝臟SOD和GSH-Px活性以清除多余的自由基。

3.3 飲水補充不同劑量硼對大鼠肝臟細胞增殖和凋亡相關基因表達的影響

細胞增殖和凋亡是細胞正常生長過程中2個重要的細胞內(nèi)事件，細胞通過增殖和凋亡的動態(tài)平衡實現(xiàn)細胞功能的正常發(fā)揮。PCNA是細胞DNA聚合酶δ的輔助蛋白，其表達變化與細胞增殖狀態(tài)密切相關，可作為評價細胞增殖狀態(tài)的關鍵指標之一[36]。在細胞凋亡過程中，調(diào)控細胞凋亡的相關基因通過接受細胞凋亡信號，表達和合成細胞凋亡相關的各種酶，誘導產(chǎn)生聯(lián)級反應進而完成凋亡事件。Caspase-3是執(zhí)行細胞凋亡最后程序的關鍵酶，其基因表達變化可以在一定程度上反映細胞凋亡狀態(tài)[37]，Bcl-2蛋白家族是一類在細胞凋亡中起重要作用的蛋白，它們主要參與線粒體介導的內(nèi)源性凋亡途徑，其成員Bax與Bcl-2這一對相互拮抗的基因共同調(diào)控細胞凋亡事件，它們的表達變化可以反映細胞的凋亡狀態(tài)[38]。有研究報道，在培養(yǎng)液中加入0.4 mmol/L的硼可以促進脾淋巴細胞的增殖和Bcl-2 mRNA表達，而加入40 mmol/L的硼則可以促進脾淋巴細胞的凋亡和BaxmRNA表達[39]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充80 mg/L硼可使非洲鴕鳥腸細胞凋亡顯著減少，而飲水補充320和640 mg/L硼可使非洲鴕鳥腸細胞凋亡顯著增加[40]。本研究也發(fā)現(xiàn)，飲水補充5和10 mg/L硼可增加大鼠肝臟PCNA和Bcl-2 mRNA相對表達量，降低Caspase-3和BaxmRNA相對表達量；而飲水補充480和640 mg/L硼則降低大鼠肝臟PCNA和Bcl-2 mRNA相對表達量，增加Caspase-3和BaxmRNA相對表達量。這可能是由于適量補充硼可能通過減少含重復凋亡結構桿狀病毒抑制劑(BIRC)2/3表達，進而促進受體相互作用蛋白1(RIP1)泛素化，減少琥珀酸脫氫酶形成，從而抑制細胞死亡，而高濃度硼產(chǎn)生了相反作用[10]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充5和10 mg/L硼就能夠明顯促進大鼠肝臟PCNAmRNA表達，抑制Caspase-3 mRNA表達，其主要原因可能是不同器官對硼的敏感程度不一致，肝臟對硼生物學作用更加敏感。

4 結 論

飲水補充5和10 mg/L硼可改善大鼠肝臟顯微結構，增加肝糖原含量，提高肝臟SOD、GSH-Px活性和T-AOC，降低肝臟MDA含量，促進肝臟Nrf2和PCNAmRNA表達；而飲水補充480和640 mg/L硼則產(chǎn)生相反作用。