李 貞 彭思嘉 左淑賢 王月君 羅海玲* 張英俊 王占軍

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100193；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院，銀川750002)

我國自2000年以來為保護生態(tài)植被實行劃區(qū)輪牧、休牧和禁牧封育的政策，在一定程度上限制了放牧家畜的規(guī)模[1]。消費市場規(guī)模的擴大以及草原牧區(qū)放牧受限，促使肉羊養(yǎng)殖逐漸由傳統(tǒng)放牧向規(guī)?；犸曓D(zhuǎn)變。灘羊作為寧夏地方品種，因其肉質(zhì)鮮嫩、膻味輕且具有獨特的風(fēng)味和口感而多次入選國宴。隨著寧夏禁牧決策的實施，灘羊的生產(chǎn)方式由傳統(tǒng)的天然草場放牧轉(zhuǎn)為舍飼或者人工草場放牧[2]，大量研究表明，飼養(yǎng)模式會影響羊肉品質(zhì)[3-4]。肌內(nèi)脂肪沉積是肉品質(zhì)的影響因素，而脂肪沉積與機體脂類代謝相關(guān)。脂類是反芻動物體內(nèi)重要的能源物質(zhì)，飼糧脂類攝入后經(jīng)瘤胃分解氫化，進入小腸消化吸收，產(chǎn)物通過血液循環(huán)運輸至肝臟代謝轉(zhuǎn)化，再進入循環(huán)系統(tǒng)被各組織利用，最后沉積在肌肉、脂肪等組織中。肌內(nèi)脂肪沉積是動物機體脂質(zhì)代謝動態(tài)平衡的最終結(jié)果，一定程度上受脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和酶的調(diào)控[5]。飼糧脂質(zhì)約20%在空腸上部被吸收，約60%在空腸中后部吸收，即食糜到達回腸時基本完成吸收過程；脂肪酶在膽鹽激活下，主要在空腸發(fā)揮作用[6]。而肝臟作為機體脂質(zhì)代謝的主要場所，對來自脂肪分解產(chǎn)生的游離脂肪酸、瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸以及飼糧來源的長鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化和分配[7]。

本試驗前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不同飼養(yǎng)模式下羔羊肌肉脂肪酸含量存在顯著差異，放牧和放牧補飼模式均可增加羊肉中n-3多不飽和脂肪酸的含量，降低飽和脂肪酸的含量，改善羊肉脂肪酸組成[8]；另外，舍飼灘羊肌內(nèi)脂肪含量及各部位體脂沉積均顯著高于放牧灘羊[9]?，F(xiàn)有研究多集中于不同飼養(yǎng)模式對羔羊生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)的影響，但對于羔羊機體內(nèi)部脂質(zhì)代謝過程的關(guān)注較少。小腸和肝臟作為動物攝入飼糧脂質(zhì)后消化代謝的重要場所，飼養(yǎng)模式的改變可能會導(dǎo)致小腸脂肪的消化吸收和肝臟脂質(zhì)代謝的過程產(chǎn)生差異，從而引起不同飼養(yǎng)模式下羊肉脂肪酸沉積的差異。鑒于此，本試驗旨在研究不同飼養(yǎng)模式對羔羊小腸脂肪消化吸收和肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響，為解釋肌肉脂肪沉積和脂肪酸含量及組成的差異提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗于2019年7月至10月在寧夏回族自治區(qū)固原市原州區(qū)頭營鎮(zhèn)馬園村(東經(jīng)106°26′，北緯36°14′，平均海拔1 600 m)進行。試驗所用人工草地分為4個放牧小區(qū)，每個小區(qū)面積為516 m2，草地為15%苜蓿(alfalfa)、35%草地早熟禾(Poapratensis)和50%草地雀麥(Bromusriparius)的混播組合，畝播量為4.5 kg。

選用體重[(19.69±0.29) kg]相近的3月齡斷奶灘羊公羔33只，隨機分為舍飼組(H組)、人工草場放牧補飼組(GH組)和人工草場放牧組(G組)，每組11只。H組每天07：30和17:30進行飼喂，保證1～2 h活動時間；GH組每天07:00—11:00進行放牧，歸牧后進行補飼；G組每天07:00—19:00進行放牧，不單獨補飼。每天將羊在4個放牧小區(qū)中輪流放牧，放牧結(jié)束后，所有羊歸圈。試驗期間自由飲水，預(yù)試期7 d，正試期90 d。其中，H組和GH組灘羊單欄飼養(yǎng)，采用顆粒料、玉米秸稈和苜蓿干草按75%、15%和10%比例充分混合后飼喂。通過預(yù)試期調(diào)整飼喂量，保證每次飼喂剩料量為總量的5%～15%。試驗飼糧參考NRC(2007)肉用綿羊的營養(yǎng)需要，按照試驗羊體重30 kg，日增重200 g的營養(yǎng)需要量進行配制，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。人工草場牧草主要營養(yǎng)成分見表2。本試驗前期已測得G組平均每天采食牧草干物質(zhì)0.514 kg，GH組平均每天采食牧草干物質(zhì)0.530 kg，采食混合飼糧干物質(zhì)0.657 kg；H組平均每天采食混合飼糧干物質(zhì)1.189 kg[9]。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表2 人工草場牧草主要營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

試驗結(jié)束后，測得各組宰前活重(H組34.97 kg，GH組33.33 kg，G組23.53 kg)[9]，所有羔羊宰前禁食12 h，自由飲水。采用清真屠宰法，在羔羊頸部放血處死后立即打開腹腔，分離肝臟，記錄稱重。分離小腸，排盡小腸內(nèi)容物后用生理鹽水沖洗干凈，記錄稱重；其中小腸指數(shù)(%)=(小腸重量/宰前活重)×100。收集小腸(十二指腸、空腸、回腸)組織，用4%多聚甲醛固定后常溫保存；取肝臟組織樣品、小腸食糜保存于-80 ℃冰箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 小腸組織形態(tài)指標(biāo)測定

剪取十二指腸、空腸和回腸各腸段約2 cm，生理鹽水沖洗干凈后置于4%多聚甲醛溶液中保存。制作石蠟切片，并經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色后，對染色后的切片進行拍照采集相關(guān)圖像，使用Pannoramic Viewer軟件測量腸道形態(tài)指標(biāo)。

1.3.2 小腸食糜上清液脂肪酶活性測定

取-80 ℃保存的小腸食糜樣品，4 ℃自然解凍，用SIGMA 3K15臺式高速冷凍離心機(希格瑪，德國)在4 ℃條件下26 515×g離心10 min，取上清液與4 ℃ 0.4 mol/mL KCl溶液按體積比1∶4進行稀釋，使用南京建成生物工程研究所的脂肪酶測定試劑盒(微板法，貨號A054-2-1)測定脂肪酶活性，試驗步驟按照說明書進行，采用Thermo MK3酶標(biāo)儀(賽默飛，美國)進行測定。

1.3.3 總RNA提取及cDNA合成

選用北京艾德萊生物科技有限公司的EASYspin Plus組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒(貨號RN2802)提取肝臟總RNA，使用Biospec-nano生命科學(xué)紫外可見分光光度計(SHIMADZU，日本)檢測樣本的RNA濃度和純度。對提取的總RNA選用北京艾德萊生物科技有限公司的TRUEscript RT Kit(+gDNA Eraser)試劑盒(貨號PC5402)，建立20 μL 500 ng體系反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，于-20 ℃保存。

1.3.4 肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的引物設(shè)計及實時熒光定量PCR檢測

根據(jù)NCBI查找綿羊(Ovisaries)的相應(yīng)基因序列，設(shè)計脂質(zhì)代謝重要調(diào)控基因[過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、固醇調(diào)控元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBF1)]、脂肪酸氧化過程相關(guān)基因[長鏈?；o酶A合酶1(ASCL1)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2(CPT2)]和乙酰輔酶A代謝過程相關(guān)基因[β-羥基-β-甲基戊二酸單酰輔酶A合酶1(HMGCS1)、β-羥基-β-甲基戊二酸單酰輔酶A裂解酶(HMGCL)、β-羥基-β-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)]的特異性PCR引物，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，引物序列信息見表3，委托北京擎科生物科技有限公司進行引物合成。

表3 引物序列

使用LineGene 964 BIOER熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(杭州博日科技有限公司)進行實時熒光定量PCR試驗，選用北京艾德萊生物科技有限公司的2×Sybr Green Qpcr Mix(貨號PC3302)，建立20 μL反應(yīng)體系，包括：12.5 μL 2×SuperReal PreMix Plus，0.5 μL正向, 0.5 μL反向引物，1 μL cDNA 模板，RNase free ddH2O補齊至20 μL。采用兩步法進行擴增，PCR反應(yīng)程序為：1)恒溫段，95 ℃預(yù)變性2 min；2)循環(huán)段，95 ℃變性15 s，60 ℃退火34 s，共40個循環(huán)，收集熒光信號；3)熔解段，對熔解曲線進行分析，曲線為單一峰則為特異性擴增，無非特異性擴增或引物二聚體。

試驗中每個樣品的每個基因做3個技術(shù)重復(fù)，結(jié)果取平均值，采用2-△△Ct法計算目的基因在樣本中的相對表達量，其中：

△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)；
△△Ct=(△Ct試驗組-△Ct對照組)。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2016進行原始數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和整理，導(dǎo)入SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較檢驗，當(dāng)P<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同飼養(yǎng)模式對羔羊小腸重量及指數(shù)的影響

由表4可知，G組的小腸重量顯著高于H組(P<0.05)；3組間小腸指數(shù)存在顯著差異(P<0.05)，其中G組最高，H組最低。

表4 不同飼養(yǎng)模式對羔羊小腸重量及指數(shù)的影響

2.2 不同飼養(yǎng)模式對羔羊小腸形態(tài)的影響

十二指腸、空腸和回腸組織形態(tài)分別如圖1所示。

標(biāo)尺代表1 000 μm。H：舍飼組；GH：人工草場放牧補飼組；G：人工草場放牧組。下圖同。

由表5可知，H組和GH組十二指腸、回腸的絨毛高度及絨毛高度/隱窩深度均顯著高于G組(P<0.05)，G組空腸的隱窩深度顯著高于H組和GH組(P<0.05)，G組和GH組空腸的肌層厚度顯著高于H組(P<0.05)。

表5 不同飼養(yǎng)模式對羔羊小腸形態(tài)差異的影響

續(xù)表5項目 Items組別 GroupsHGHGSEMP值P-value回腸Ileum絨毛高度 Villus height/μm514.81a490.61a393.31b10.944<0.001隱窩深度 Crypt depth/μm191.10176.97174.725.5130.440絨毛高度/隱窩深度 V/C2.81a2.84a2.27b0.1010.046肌層厚度 Muscle layer thickness/μm320.31389.89383.0514.3080.112

2.3 不同飼養(yǎng)模式對羔羊小腸脂肪酶活性的影響

由圖2可知，不同飼養(yǎng)模式下，H組的羔羊空腸食糜上清脂肪酶活性顯著高于G組(P<0.05)；各組間羔羊十二指腸和回腸食糜上清脂肪酶活性無顯著差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示顯著差異(P<0.05)。下圖同。

2.4 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟代謝相關(guān)基因表達的影響

2.4.1 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟脂質(zhì)代謝重要調(diào)控基因表達的影響

由圖3可知，不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟PPARα、PPARγ、SREBF1基因相對表達量均無顯著影響(P>0.05)。

圖3 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟脂質(zhì)代謝重要調(diào)控基因表達的影響

2.4.2 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟脂肪酸氧化過程相關(guān)基因表達的影響

由圖4可知，H組羔羊的肝臟CPT1基因相對表達量顯著高于G組(P<0.05)；3組間肝臟ACSL1、CPT2基因相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟脂肪酸氧化過程相關(guān)基因表達的影響

2.4.3 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟乙酰輔酶A代謝過程相關(guān)基因表達的影響

由圖5可知，H組羔羊的肝臟HMGCL、HMGCR基因相對表達量顯著高于G組(P<0.05)，3組間肝臟HMGCS1基因相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 不同飼養(yǎng)模式對羔羊小腸重量及指數(shù)的影響

在羔羊出生時小腸尚未發(fā)育完全，隨著年齡增長、飼糧類型的改變逐漸完善其功能直至成熟，因此，飼糧的變化會對小腸發(fā)育產(chǎn)生重要影響[10]。研究表明，在斷奶階段，羔羊從采食母乳轉(zhuǎn)為固體飼料，這極大刺激了消化器官形態(tài)的發(fā)育，小腸重量在120～160日齡快速增長，到200日齡時逐漸趨于成熟[11]。本研究試驗動物為3月齡灘羊羔羊，在試驗期內(nèi)正處于120～160日齡快速增長的時間段，G組羔羊小腸重量顯著高于H組，這可能是因為放牧模式下羔羊采食的新鮮牧草比舍飼模式下飼喂的飼糧粗纖維比例更高，能刺激腸道促進其發(fā)育；同時也可能是在營養(yǎng)水平較低的情況下機體優(yōu)先保證腸道發(fā)育，讓小腸有更大表面積發(fā)揮消化吸收功能[12]。此外，G組小腸指數(shù)最高，其原因是在小腸重量更高的情況下，G組宰前活重更低，從而導(dǎo)致小腸指數(shù)提高[9]。

3.2 不同飼養(yǎng)模式對羔羊小腸形態(tài)的影響

小腸的消化功能與腸道形態(tài)密切相關(guān)[13]，小腸絨毛的高度增加表明小腸吸收表面積增大，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收增強；隱窩深度反映細(xì)胞生成率，其增加表明成熟細(xì)胞比例低，細(xì)胞分泌功能較弱，影響吸收功能的發(fā)揮。而絨毛高度/隱窩深度可以綜合反映小腸的消化吸收功能及健康程度，比值升高時，腸道上皮細(xì)胞數(shù)量增加，腸道吸收面積增大，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率；反之則可能存在腸道病變?nèi)琊つな軗p，影響腸道功能[14-15]。本試驗中，G組十二指腸及回腸的絨毛高度、十二指腸的絨毛高度/隱窩深度顯著低于其他2組，而其空腸的隱窩深度顯著高于其他2組，這與孫娟[10]的研究結(jié)果一致，可能是因為飼糧的營養(yǎng)物質(zhì)水平不同，GH組和H組飼糧的能量和蛋白質(zhì)水平更高引起的。但劉學(xué)良等[16]的研究結(jié)果表明，放牧較舍飼飼糧中粗飼料比例更高，灘羊十二指腸絨毛高度更高，這可能與具體采食牧草種類、飼糧精粗比及品種等有關(guān)。另外，腸道肌層可以節(jié)律性收縮，其厚度增加利于小腸食糜與消化酶充分接觸[17]?？漳c是小腸消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要部位，GH組和G組空腸肌層厚度顯著高于H組，說明其小腸的蠕動能力增強，更利于食糜與消化酶的充分接觸。但也有研究認(rèn)為，較薄的胃腸道壁是動物提高營養(yǎng)物質(zhì)通過率的一種適應(yīng)性機制[18-19]，因此H組的空腸肌層厚度低也可能代表其營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力更強。綜上所述，舍飼和人工草場放牧補飼模式下的羔羊可能因為飼糧營養(yǎng)水平更高，促進了小腸的形態(tài)發(fā)育，有利于小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

3.3 不同飼養(yǎng)模式對羔羊小腸脂肪酶活性的影響

消化酶的分泌和活性可直接影響小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，消化酶活性主要與品種、日齡、飼糧和環(huán)境有關(guān)[20]。脂肪酶主要是將甘油三酯水解為甘油和脂肪酸，反芻動物小腸內(nèi)脂肪酶主要來源于胰腺，生成后隨胰液排入小腸[21]。羔羊小腸不同部位的pH不同，會影響消化酶功能的發(fā)揮。十二指腸內(nèi)pH較低會影響脂肪酶活性，空腸脂肪酶活性顯著高于十二指腸和回腸，因此脂肪酶主要在空腸中發(fā)揮作用[6]。孫娟[10]研究發(fā)現(xiàn)，動物攝入飼糧脂肪更多，脂肪酶活性更高，放牧補飼比自然放牧可以顯著提高羔羊空腸脂肪酶活性，這與本試驗的結(jié)果一致，舍飼模式羔羊空腸的脂肪酶活性高于人工草場放牧模式，利于脂肪消化。

3.4 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟代謝相關(guān)基因表達的影響

3.4.1 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟脂質(zhì)代謝重要調(diào)控基因表達的影響

肝臟在脂類的代謝過程中起重要作用，因此研究肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達有助于進一步了解不同飼養(yǎng)模式下機體脂質(zhì)代謝的差異。PPARα在肝臟中高度表達，主要是調(diào)控脂肪酸氧化過程涉及的基因表達[22]。PPARγ是動物脂肪生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠直接調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂類代謝相關(guān)基因的表達[23-24]。SREBF1是脂質(zhì)代謝的重要參與者，能調(diào)控脂肪酸合成和攝取過程相關(guān)基因的表達[25]。本試驗中，不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟PPARα、PPARγ、SREBF1基因相對表達量有一定影響，但并未達到顯著水平，說明飼養(yǎng)模式的改變可能通過調(diào)節(jié)其他基因表達影響機體脂質(zhì)代謝。

3.4.2 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟脂肪酸氧化過程相關(guān)基因表達的影響

ACSL1是PPARα的靶基因，研究發(fā)現(xiàn)小鼠注射PPARα激動劑時肝臟ACSL1基因相對表達量顯著上調(diào)[26]。本試驗中3組間ACSL1基因相對表達量無顯著差異，這可能與ACSL1基因表達受多途徑調(diào)控相關(guān)，但其中具體機制尚不清楚。CPT1和CPT2是一對移位酶，也是脂肪酸β氧化過程的限速酶。本試驗中，舍飼模式下肝臟CPT1基因相對表達量顯著高于人工草場放牧模式，CPT1基因表達上調(diào)說明脂肪動員作用加強，機體需要脂肪酸供能，可以促進脂肪酸的轉(zhuǎn)運，肝臟線粒體脂肪酸的氧化作用增強。有研究表明，隨著烏金豬飼糧能量或者蛋白質(zhì)水平的變化，CPT1基因相對表達量也受到影響[27-28]，這說明H組飼糧的能量或蛋白質(zhì)水平可能與G組存在顯著差異。雖然CPT1和CPT2都是PPARα調(diào)控的靶基因，但是在本試驗中各組肝臟CPT2基因相對表達量差異不顯著，表現(xiàn)出H組高于G組的相對變化趨勢，這與PPARα基因相對表達量結(jié)果相似，而CPT1基因相對表達量有顯著差異可能是由于CPT1基因表達還受其他通路或基因的調(diào)控，但還需要進一步研究。

3.4.3 不同飼養(yǎng)模式對羔羊肝臟乙酰輔酶A代謝過程相關(guān)基因表達的影響

HMGCL催化乙酰乙酸的生成，是該過程的限速酶[29]。在本試驗中，H組肝臟HMGCL基因相對表達量顯著高于G組，說明H組羔羊機體肝臟乙酰乙酸合成作用更強。HMGCR是乙酰輔酶A合成膽固醇的限速酶，該酶控制20多個后續(xù)的酶反應(yīng)[30]。研究發(fā)現(xiàn)HMGCR的磷酸化會抑制其活性，在肝臟中，HMGCR主要被腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)磷酸化。因此抑制AMPK活性能激活HMGCR，增加膽固醇合成[31]。本試驗中，H組肝臟中HMGCR基因相對表達量顯著高于G組，說明H組羔羊膽固醇合成更為活躍。

4 結(jié) 論

綜上所述，在本試驗條件下，與放牧模式相比，舍飼和人工草場放牧補飼模式提高了羔羊小腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，且降低了隱窩深度，有利于小腸形態(tài)發(fā)育；在舍飼模式下空腸脂肪酶活性更高，這有利于脂肪在小腸的消化、吸收；在舍飼模式下羔羊肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因CPT1、HMGCL、HMGCR的相對表達量顯著上調(diào)，從而利于體脂沉積。