李 衡 曹 慧 楊國(guó)坤,2 常緒路,2 張艷敏,2 張建新,2 胡文攀 朱振祥 李克克 孟曉林,2*

(1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007；2.河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，新鄉(xiāng)453007；3.河南金百合生物科技股份有限公司，安陽(yáng)456150)

隨著科技的進(jìn)步，高密度、集約化養(yǎng)殖模式在提升經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也引發(fā)了抗生素濫用及魚病頻發(fā)等諸多問(wèn)題[1]。雖然藥物在預(yù)防和治療水生動(dòng)物疾病方面具有顯著效果，但長(zhǎng)期或過(guò)量使用會(huì)破壞機(jī)體免疫力，增強(qiáng)病原菌耐藥性，增加機(jī)體藥物殘留[2]。2020年7月1日，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第149號(hào)令已明確禁止在飼料中添加抗生素。因此，尋找抗生素替代物已成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。

中草藥富含蛋白質(zhì)、多糖、生物堿、氨基酸、皂苷、維生素、有機(jī)酸等多種生物活性物質(zhì)，具有純天然、毒副作用小和藥食同源的優(yōu)點(diǎn)，可發(fā)揮增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)生長(zhǎng)、抑菌殺菌、保肝利膽等作用。在現(xiàn)代魚類養(yǎng)殖中，中草藥已作為替代抗生素的新型飼料添加劑被廣泛使用[3]。“懷山藥”產(chǎn)自河南焦作，又名薯蕷(DioscoreaoppositeThunb.)，為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)植物。目前，山藥在畜禽動(dòng)物中的應(yīng)用研究已十分廣泛，如在斷奶仔豬、肉雞等動(dòng)物上的研究發(fā)現(xiàn)，山藥籽實(shí)具有提高采食量、降低飼料系數(shù)、提高機(jī)體免疫力的功效[4-5]。在水產(chǎn)動(dòng)物上的研究表明，山藥飼喂黃河鯉可顯著提高其肌肉中必需氨基酸的含量，以及血清中白蛋白和球蛋白含量[6]。此外，山藥可重構(gòu)小鼠腸道菌群組成，增加短鏈脂肪酸的含量，保護(hù)腸道屏障[7]。

鯉(CyprinuscarpioL.)是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，根據(jù)《2020中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》報(bào)道，我國(guó)鯉養(yǎng)殖量在2019年達(dá)288.53萬(wàn)t，占全國(guó)淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的9.57%[8]，但目前懷山藥在鯉免疫及腸道微生態(tài)方面的研究還鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探究懷山藥籽實(shí)作為飼料添加劑對(duì)鯉免疫及腸道菌群的調(diào)控機(jī)理，以初步明確其作為添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的可行性，為山藥在水產(chǎn)領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)用鯉購(gòu)自新鄉(xiāng)市延津縣漁場(chǎng)，暫養(yǎng)于河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。以商品飼糧(購(gòu)自河南某農(nóng)牧科技有限公司)暫養(yǎng)2周，選擇健康狀況良好的180尾鯉[(75.25±1.45) g]，隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)進(jìn)行8周，每天08:30、11:30、14:30、17:30投喂4次，記錄食物攝入和死亡數(shù)量，每2周調(diào)整1次投飼量。水質(zhì)控制指標(biāo)：溶解氧含量>6 mg/L，氨態(tài)氮含量<0.01 mg/L，水溫(25±1) ℃，光照周期12L∶12D。

試驗(yàn)用懷山藥籽實(shí)產(chǎn)自河南省武陟縣，經(jīng)超微粉碎過(guò)60目篩，60 ℃烘干制成懷山藥粉。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0(對(duì)照組)、1%(LCY組)和2%(HCY組)的懷山藥粉。其他飼糧原材料粉碎過(guò)篩(60目)，按配方比重混勻，用飼料顆粒機(jī)制成粒徑2.5 mm的顆粒飼料，晾干后于-20 ℃保存?zhèn)溆??；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.2 生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定

每天記錄試驗(yàn)魚的死亡率及投喂量，計(jì)算增重率(WGR)、特定生長(zhǎng)率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)。

增重率(%)=100×(末體重-初體重)/初體重；
特定生長(zhǎng)率(%/d)=100×(ln末體重-
ln初體重)/飼喂天數(shù)；
飼料系數(shù)=每個(gè)重復(fù)飼料總消耗量/
(末體重+死亡魚重-初體重)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 腸道酶活性測(cè)定

每桶隨機(jī)取3尾魚，每組9尾，冰上分離出全腸于2 mL無(wú)菌無(wú)酶離心管中，液氮速凍后-80 ℃超低溫冰箱保存。樣品勻漿后，測(cè)定丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和溶菌酶(LZM)活性，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 中腸組織形態(tài)學(xué)觀察

每桶隨機(jī)取3尾魚，每尾分離出2份中腸組織樣品。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，一份使用10%福爾馬林溶液固定，用于蘇木精-伊紅(HE)染色。另一份樣品用2.5%戊二醛溶液固定，用于掃描電子顯微鏡觀察。

HE染色：固定后的中腸組織樣品，梯度乙醇脫水24 h后，用石蠟包埋切片機(jī)將蠟塊切成4 μm厚，染色后在光學(xué)顯微鏡下分別放大100、200和400倍，觀察腸道肌層厚度和腸絨毛高度。

掃描電子顯微鏡：將固定好的樣品在30%、50%、70%、80%、90%和100%的梯度乙醇中脫水15 min。隨后在叔丁醇中浸泡15 min，4 ℃下冷凍。在掃描電子顯微鏡(JEOL，日本)下觀察。

1.5 基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

每桶隨機(jī)取3尾魚，每組9尾，分離中腸組織于1.5 mL無(wú)菌無(wú)酶離心管中，放入液氮速凍后-80 ℃超低溫冰箱保存。樣品提取RNA后使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa，大連)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA作為模板，18S rRNA基因作為內(nèi)參。熒光定量PCR反應(yīng)體系：5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa，大連)，0.3 μL正向引物(10 μmol/L)，0.3 μL反向引物(10 μmol/L)，1.0 μL cDNA模板，3.4 μL無(wú)菌水。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，每樣品設(shè)3個(gè)平行(RocheLightCycler?480，瑞士)。熒光定量PCR引物由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2，基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 腸道菌群測(cè)序分析

每桶選取12尾魚，酒精棉擦拭魚體表，在超凈工作臺(tái)下用滅菌的剪刀從鯉瀉泄殖孔處剪開(kāi)，將取出的腸道用一次性培養(yǎng)皿盛放。用PBS洗外腸道，鑷子夾除腸系膜、脂肪等物質(zhì)后，用無(wú)菌鉗輕輕擠壓中腸，小心地取腸內(nèi)容物，2個(gè)樣品混合為1個(gè)樣品，共6個(gè)樣品，于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。腸內(nèi)容物一部分用于微生物基因組DNA提取，另一部分用于腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量測(cè)定。使用基因組DNA提取試劑盒(QIAamp，德國(guó))提取腸內(nèi)容物樣品基因組DNA。使用NanoDrop 2000測(cè)量DNA濃度，并通過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA完整性。所得合格的總DNA樣品用于16S rRNA的高通量測(cè)序。用條形碼引物V338F (5’-ACTCCTACGGGAGAGGCAGCA-3’)和V806R (5’-ATGCAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)。從1%瓊脂糖凝膠中提取擴(kuò)增子，通過(guò)AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen, 美國(guó))純化，并根據(jù)制造商的規(guī)程使用QuantiFluorTM-ST(Promega, 美國(guó))進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增子通過(guò)Illumina Miseq PE 300進(jìn)行配對(duì)末端測(cè)序。

使用FLASH(Version 1.2.11)對(duì)測(cè)序得到的PE reads進(jìn)行組裝，并使用QIIME(V.1.9.1)進(jìn)行分析。通過(guò)使用與UPARSE(Version 7.1，http://drive5.com/uparse/)的97%相似性截止值，對(duì)可操作分類單元(OTU)進(jìn)行了聚類，并使用UCHIME鑒定并去除了嵌合序列。通過(guò)RDP分類器算法(http://rdp.cme.msu.edu/)針對(duì)Silva(SSU123)16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，按照70%的置信度閾值分析每個(gè)16S rRNA基因序列的分類。根據(jù)物種注釋，標(biāo)記每個(gè)樣本中對(duì)應(yīng)于每個(gè)分類級(jí)別的序列數(shù)?；贠TU，進(jìn)行了Shannon、Simpson等多樣性指數(shù)的分析，比較各組間腸道微生物的多樣性和豐富度，統(tǒng)計(jì)樣品的α多樣性。

1.7 腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量測(cè)定

稱取1.6中所取的新鮮腸道內(nèi)容物樣品2 g，以1.0∶2.5(w/v)的比例添加超純水并混合研磨2 min，12 000 r/min離心30 min。將上清液移入新的2 mL離心管，調(diào)上清pH至2～3，0.45 μm過(guò)濾制得樣品液。短鏈脂肪酸含量采用氣相色譜儀(Agilent Technologies 7890B，美國(guó))測(cè)定，測(cè)定條件為：流速8 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；機(jī)器入口溫度保持在240 ℃。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用軟件SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行one-way ANOVA單因素方差分析和Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。利用http://www.i-sanger.com美吉測(cè)序平臺(tái)對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷山藥對(duì)鯉生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)及存活率無(wú)顯著差異(P>0.05)。但隨著懷山藥添加量增加，增重率和特定生長(zhǎng)率有所升高，飼料系數(shù)有一定程度的降低。

表3 懷山藥對(duì)鯉生長(zhǎng)性能的影響

2.2 懷山藥對(duì)鯉腸道酶活性的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，LCY和HCY組腸道超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、溶菌酶活性均顯著升高(P<0.05)，但MDA含量在各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 懷山藥對(duì)鯉腸道酶活性的影響

2.3 懷山藥對(duì)鯉腸道組織形態(tài)的影響

HE切片結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加懷山藥后鯉腸微絨毛密度增大，微絨毛結(jié)構(gòu)更完整，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加(圖1-A、圖1-B)。掃描電鏡結(jié)果顯示，試驗(yàn)組腸道黏膜褶皺數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增多(P<0.05)，且在HCY組尤為明顯(圖1-C)。此外，與對(duì)照組相比，LCY組腸絨毛高度顯著增加(P<0.05)，而試驗(yàn)組腸道肌層厚度與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2)。

A：HE染色100倍；B：HE染色400倍；C：腸黏膜組織掃描電鏡150倍。MD：機(jī)械損傷；MV：微絨毛；SH：分泌孔；V：腸絨毛；M：基層；G：杯狀細(xì)胞。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.4 懷山藥對(duì)鯉腸道免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，LCY組中腸道白細(xì)胞介素-10(IL-10)和緊密連接蛋白-1(ZO-1)基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、Toll樣受體4(TLR4)和閉合蛋白(Occludin)基因相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。在HCY組中，僅有IL-10基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)，其余基因表達(dá)量與對(duì)照組相比有升高趨勢(shì)，但差異均不顯著(P>0.05)。

IL-1β:白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β；IL-10:白細(xì)胞介素-10 interleukin-10；TNF-α:腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；TGF-β:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β transforming growth factor-β；TLR4:Toll樣受體4 Toll-like receptors 4；NF-κB:核因子-κB nuclear factor kappa-B；ZO-1:緊密連接蛋白 zonulaoccludens-1；Occludin:閉合蛋白。

2.5 懷山藥對(duì)鯉腸道微生物的影響

由表5可知，覆蓋度在各組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，與對(duì)照組相比，LCY組Ace指數(shù)和Chao指數(shù)顯著升高(P<0.05)。Shannon指數(shù)代表了微生物群落的多樣性，Simpson指數(shù)代表了微生物群落的均勻度，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LCY組和HCY組腸道Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。

表5 懷山藥對(duì)鯉腸道微生物多樣性的影響

由圖4可知，各組腸道菌群在門水平上均主要由梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)組成。其中梭桿菌門相對(duì)豐度最高，分別占總數(shù)的54.29%(對(duì)照組)、83.83%(LCY組)和86.97%(HCY組)。與對(duì)照組相比，LCY和HCY組梭桿菌門相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，而變形菌門相對(duì)豐度則顯著降低(P<0.05)。此外，與對(duì)照組相比，懷山藥添加組擬桿菌門相對(duì)豐度升高，厚壁菌門相對(duì)豐度降低，厚壁菌門/擬桿菌門比值下降。

Fusobacteria：梭桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Others：其他。

由圖5-A可知，在屬水平上相對(duì)豐度較高的菌群有鯨桿菌屬(Cetobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和腸桿菌屬(Enterobacter)。與對(duì)照組相比，LCY和HCY組鯨桿菌屬相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)(圖5-B)，而氣單胞菌屬相對(duì)豐度顯著性降低(P<0.05)(圖5-C)。希瓦氏菌屬、腸桿菌屬相對(duì)豐度與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化(P>0.05)(圖5-D、圖5-E)。

圖5 屬水平鯉腸道內(nèi)容物微生物群落組成(A)、鯨桿菌屬的相對(duì)豐度(B)、氣單胞菌屬相對(duì)豐度(C)、

2.6 懷山藥對(duì)鯉腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響

由圖6可知，與對(duì)照組相比，LCY組和HCY組鯉腸內(nèi)容物乙酸含量顯著升高(P<0.01)，而丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸和異戊酸的含量與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。圖7顯示了各組鯉腸道總短鏈脂肪酸的含量，可以發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05)。

圖6 懷山藥對(duì)鯉腸道內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響

圖7 懷山藥對(duì)鯉腸內(nèi)容物總短鏈脂肪酸含量的影響

3 討 論

3.1 懷山藥對(duì)鯉生長(zhǎng)性能及腸道組織形態(tài)的影響

中草藥飼料添加劑可改善動(dòng)物飼料質(zhì)量，解決傳統(tǒng)抗生素飼料添加劑的藥物殘留問(wèn)題[9]。鄧華富[10]在基礎(chǔ)飼糧中添加1%山藥粉，研究對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響。結(jié)果表明，山藥能顯著提高斷奶仔豬的平均日增重和平均日采食量。楊仕群等[11]在山地烏骨雞飼糧中添加1%、2%和4%的山藥，顯著提高了平均日增重和飼料攝入量。陸克文等[4]研究發(fā)現(xiàn)了添加1%山藥粉可顯著提高1～21日齡和14～21日齡仔豬的平均日增重。上述研究表明，山藥作為飼料添加劑在畜禽動(dòng)物生長(zhǎng)性能方面可以起到很好的促進(jìn)作用。在水產(chǎn)動(dòng)物研究中，喬志剛等[6]在黃河鯉基礎(chǔ)飼料中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的懷山藥，可提高黃河鯉特定生長(zhǎng)率、增重率，但差異不顯著，這與本研究結(jié)果相似。在本研究中，飼料系數(shù)在添加懷山藥后雖然下降，但保持較高的值，分析原因可能是魚的初體重偏高，相比幼魚來(lái)說(shuō)，它對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收有一定差異。水產(chǎn)動(dòng)物在不同的生長(zhǎng)階段投餌次數(shù)應(yīng)不同，投餌次數(shù)過(guò)多，飼料在腸道內(nèi)的蠕動(dòng)速度就越快，若超出對(duì)飼料的消化速度就會(huì)導(dǎo)致一定數(shù)量的飼料無(wú)法被充分消化吸收，造成飼料浪費(fèi)，提高飼料系數(shù)。

腸吸收能力的增強(qiáng)可能是促進(jìn)鯉生長(zhǎng)的原因。腸道是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收的主要場(chǎng)所，腸道健康依賴于正常的生理結(jié)構(gòu)，而腸絨毛長(zhǎng)度、肌層厚度則是評(píng)價(jià)腸道消化吸收能力的重要依據(jù)[12]。絨毛的長(zhǎng)度與腸上皮細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，腸絨毛長(zhǎng)度增加，腸上皮細(xì)胞數(shù)增多，消化吸收能力增強(qiáng)，生長(zhǎng)發(fā)育加快。黏膜的上皮細(xì)胞由單層的柱狀上皮細(xì)胞組成，它們散布在許多杯狀細(xì)胞中，杯狀細(xì)胞分泌消化酶和黏液，從而保護(hù)上皮細(xì)胞并潤(rùn)滑腸道。在本研究中，試驗(yàn)組腸絨毛長(zhǎng)度及完整性、肌層厚度和杯狀細(xì)胞的數(shù)量相較于對(duì)照組，有一定程度的增加，并且腸黏膜褶皺顯著增多，這表明吸收表面積增大，消化和吸收能力增強(qiáng)。這與前述增重率相比于對(duì)照組有升高趨勢(shì)的結(jié)果相一致，說(shuō)明添加懷山藥能在一定程度上增強(qiáng)鯉腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)鯉生長(zhǎng)。

3.2 懷山藥對(duì)鯉腸道酶活性和腸道免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

抗氧化劑系統(tǒng)是脊椎動(dòng)物中最重要的免疫防御系統(tǒng)[13]，酶的活性通常間接表明宿主清除活性氧(ROS)的能力。其中抗氧化酶中的氧化氫酶和超氧化物歧化酶通常被用作評(píng)估免疫潛能的功能參數(shù)[14]，其可通過(guò)清除自由基降低氧化應(yīng)激，預(yù)防、阻止或減少氧化損傷，保護(hù)機(jī)體免受疾病的侵襲。在本研究中，飼料中添加山藥粉后，鯉腸道中的氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性顯著增加，這表明抗氧化能力的提升。這一結(jié)果與草魚飼料中添加條斑紫菜多糖[15]和凡納濱對(duì)蝦飼料中添加白芍多糖[16]的研究結(jié)果相吻合。溶菌酶是一種具有抗菌活性的蛋白酶，可通過(guò)降解革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中多糖從而產(chǎn)生抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在鯉飼料中添加多糖[17]和尼羅羅非魚飼料中添加丹參[18]會(huì)誘導(dǎo)溶菌酶的活性或表達(dá)量增加。在本試驗(yàn)中，飼料中添加懷山藥，溶菌酶活性顯著升高，這與山藥中的山藥多糖等生物活性成分密切相關(guān)，此外可能由于活性物質(zhì)經(jīng)由腸道菌群介導(dǎo)，促進(jìn)了腸道中溶菌酶的分泌。

在宿主防御反應(yīng)中，一類抗炎癥因子能下調(diào)細(xì)胞炎性反應(yīng)、維持機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子平衡[19]，如IL-10、TGF-β等。IL-10和TGF-β作為重要的抗炎細(xì)胞因子，響應(yīng)于炎癥刺激，參與多項(xiàng)免疫調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞因子的過(guò)度釋放，具有減輕炎性損傷的作用[20]。本試驗(yàn)添加山藥粉后中腸IL-10和TGF-β基因相對(duì)表達(dá)量顯著增加，與鯉添加棕櫚果實(shí)提取物的結(jié)果[21]一致。促炎性細(xì)胞因子要有IL-1β和TNF-α等。IL-1β和TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌的，是引起炎癥反應(yīng)，抵抗病原入侵的第1介質(zhì)[22]，在魚類早期感染和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，可通過(guò)炎性反應(yīng)提高機(jī)體抗感染能力，通常被認(rèn)為是預(yù)測(cè)炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)志物[23]。TNF-α在機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí)，能促進(jìn)IL-1β的分泌，并與之發(fā)生協(xié)同作用[24-25]。一些研究表明，多糖作為有效的免疫刺激劑，可以誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β基因相對(duì)表達(dá)量，積極調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，從而提高魚體的免疫應(yīng)答和抗病性。Watanuki等[26]報(bào)道，在鯉魚飼料中添加螺旋藻上調(diào)了IL-1β和TNF-α基因表達(dá)。Wang等[27]的研究中，熟地黃同樣能上調(diào)IL-1β和TNF-α的表達(dá)，提高鯉的免疫能力。Toll樣受體是與免疫相關(guān)的模式識(shí)別受體，是連接特異性和非特異性免疫的媒介，能通過(guò)提升對(duì)細(xì)胞因子合成與釋放而控制促發(fā)炎癥反應(yīng)。其中TLR4可以識(shí)別并結(jié)合革蘭氏陰性菌脂多糖，激活核因子-κB(NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)[28]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，多糖作為一種有效的免疫刺激物，直接參與巨噬細(xì)胞的活化[29]，通過(guò)TLR4/NF-κB通路促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生(促炎因子和抗炎因子)，從而刺激免疫反應(yīng)。在哺乳動(dòng)物中，Li等[30]研究表明，山藥中的非淀粉多糖通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)IL-6和TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量。Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)，大黃多糖(Rhubarbpolysaccharides)能激活巨噬細(xì)胞表面TLR4復(fù)合物并轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外信號(hào)到胞內(nèi)，誘導(dǎo)NF-κBp65的表達(dá)。本研究的試驗(yàn)結(jié)果表明，山藥多糖可能通過(guò)TLR4/NF-κB通路激活鯉腸上皮巨噬細(xì)胞，引起機(jī)體的免疫應(yīng)答，提升能免疫力。

緊密連接蛋白是組成腸黏膜機(jī)械屏障的重要部分[32]，緊密連接蛋白Occludin與ZO-1可以形成穩(wěn)定的連接，對(duì)維系腸黏膜屏障的完整性意義重大。已有研究報(bào)道了黃芪多糖[33]和白芨多糖[34]對(duì)ZO-1和Occludin基因相對(duì)表達(dá)量的增強(qiáng)作用。此外，一些研究表明，酚類化合物影響這些蛋白的緊密結(jié)合能力，增強(qiáng)屏障完整性[35]。在本研究中，飼料中補(bǔ)充山藥增加了Occludin和ZO-1在腸道中基因相對(duì)表達(dá)量，說(shuō)明懷山藥可提升腸道屏障保護(hù)作用，這與腸道組織形態(tài)觀察結(jié)果是一致的。

3.3 懷山藥對(duì)鯉腸道微生物和短鏈脂肪酸含量的影響

腸道菌群被稱為機(jī)體的第二器官，與機(jī)體的代謝、免疫等功能密切相關(guān)。本試驗(yàn)分別從門、屬2個(gè)水平對(duì)添加懷山藥后鯉腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的變化進(jìn)行了分析。在門水平上，鯉腸道的優(yōu)勢(shì)群落主要由梭桿菌門、變形桿菌門和擬桿菌門組成，且超過(guò)50%的微生物類群屬于梭桿菌門，這與Van Kessel等[36]對(duì)鯉的腸道菌群研究結(jié)果一致。目前在魚類腸道樣本中檢測(cè)到的梭桿菌幾乎都屬于鯨桿菌屬，是一種常見(jiàn)的淡水魚腸道中廣泛分布的菌種。有研究顯示，魚類腸道中大量定植的鯨桿菌屬可產(chǎn)生維生素B12，與機(jī)體代謝密切相關(guān)[37]。在殼聚糖-銀納米復(fù)合材料(CAgNCs)添加飼喂的斑馬魚腸道中鯨桿菌屬豐度顯著升高，并促進(jìn)了維生素的產(chǎn)生[38]。因此，本研究添加山藥粉后，鯉腸道菌群中鯨桿菌屬相對(duì)豐度的顯著升高可能會(huì)促進(jìn)維生素B12的產(chǎn)生，供給機(jī)體營(yíng)養(yǎng)需要，促進(jìn)機(jī)體健康。變形菌門是包括魚類在內(nèi)的大多數(shù)物種腸道菌群的重要組成部分[39]，它包含許多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等，其與腸道的屏障作用有關(guān)，變形菌門的高豐度會(huì)導(dǎo)致緊密連接蛋白表達(dá)降低，從而引起腸道損傷的發(fā)生[40]。在鯉腸道中存在的變形菌大部分屬于氣單胞菌屬，是一種條件致病菌。本研究表明，與對(duì)照組相比，飼料中補(bǔ)充懷山藥可以顯著降低鯉腸道中氣單胞菌屬的相對(duì)豐度，說(shuō)明山藥可能對(duì)減少致病性腸道菌群的數(shù)量，增強(qiáng)宿主的抗病能力有積極的影響。厚壁菌門和擬桿菌門可以編碼多種與糖相關(guān)的酶，在非消化多糖的利用中發(fā)揮重要作用[41]。在人類及哺乳動(dòng)物研究中表明，厚壁菌門/擬桿菌門比值的降低表征著脂質(zhì)代謝的改善[42]。本研究證明，懷山藥可以通過(guò)調(diào)節(jié)厚壁菌和擬桿菌的相對(duì)豐度來(lái)減少宿主對(duì)食物中多余脂類物質(zhì)的吸收，從而防止攝入過(guò)多的能量來(lái)維持正常體重。此外，腸桿菌屬和希瓦氏菌屬被認(rèn)為是引起多種疾病的主要條件性致病菌，而希瓦氏菌屬隸屬于弧菌科，是人類和水產(chǎn)動(dòng)物的潛在病原。但Ray等[43]研究顯示，從印度鯉魚(Indian carp，Cyprinidae)消化道分離出的腸桿菌可以產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶，在鯉魚腸道食物消化過(guò)程中發(fā)揮積極的作用。Dailey等[44]研究發(fā)現(xiàn)希瓦氏菌屬可以產(chǎn)生利于機(jī)體腸道健康的脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加懷山藥對(duì)鯉腸道中腸桿菌屬和希瓦氏菌屬的相對(duì)豐度無(wú)顯著影響。具體其發(fā)揮的功能還需要進(jìn)一步在種的水平上開(kāi)展研究。短鏈脂肪酸是腸道微生物消化膳食成分發(fā)酵后的產(chǎn)物，可降低腸道內(nèi)pH，抑制病原微生物的增殖，同時(shí)改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸道屏障完整性，參與免疫調(diào)節(jié)，有效預(yù)防腸道炎癥[45]。本研究中，飼料中添加懷山藥可調(diào)節(jié)鯉腸內(nèi)短鏈脂肪酸的含量，尤其是乙酸、丙酸、丁酸和總酸的含量，這可能與山藥中的富含的山藥多糖密切相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，多糖具有促進(jìn)產(chǎn)短鏈脂肪酸細(xì)菌增殖的潛力[46]，如擬桿菌和梭桿菌。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼料中添加懷山藥對(duì)鯉的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，但可以顯著提升鯉的腸道屏障功能，改善鯉的腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高短鏈脂肪酸含量，有望作為潛在的鯉飼料添加劑。