張 歡 朱鴻福 閆艷紅 張桂杰*

(1.寧夏大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系，銀川750021；2.寧夏草牧業(yè)工程技術(shù)研究中心，銀川750021；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都611130)

檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)是一類廣泛種植于干旱和半干旱地區(qū)的防風(fēng)固沙類豆科灌木，由于大量人工種植的檸條錦雞兒與其他植物競(jìng)爭(zhēng)土壤養(yǎng)分，從而導(dǎo)致植物物種多樣性降低[1-2]。截止2018年，寧夏鹽池縣檸條面積達(dá)1.73萬(wàn)hm2，生物貯量為59.7萬(wàn)t[3]。不及時(shí)平茬更新使檸條錦雞兒老化和退化現(xiàn)象嚴(yán)重[4]，造成大量資源浪費(fèi)。因此，合理有效利用檸條錦雞兒可減少物種競(jìng)爭(zhēng)，提高生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性。

檸條錦雞兒富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素和動(dòng)物生長(zhǎng)所需氨基酸[5]，是良好的非常規(guī)飼料資源。木質(zhì)化程度高是制約檸條錦雞兒作為飼料資源開(kāi)發(fā)的重要因素，適宜的加工方式有利于降低其纖維含量。研究表明，花期收獲的檸條錦雞兒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，采用揉碎的加工方式可提高其適口性[5-6]。此外，青貯能有效保存檸條錦雞兒營(yíng)養(yǎng)成分，軟化托葉刺[7]，是保存灌木飼料和緩解干旱地區(qū)飼料短缺的貯存方法之一。豆科植物發(fā)酵品質(zhì)不佳主要原因?yàn)楦街樗峋鷶?shù)量少、可溶性碳水化合物含量低和緩沖能值高等自身特性[8]。因此，添加乳酸菌制劑和富含可溶性碳水化合物的農(nóng)副產(chǎn)物是解決灌木青貯飼料發(fā)酵不良的有效途徑之一。

通常情況下，優(yōu)質(zhì)青貯飼料要求飼草表面附著乳酸菌數(shù)量達(dá)到或超過(guò)105CFU/g(鮮重)，外源性添加乳酸菌制劑能滿足豆科飼草青貯初期發(fā)酵所需乳酸菌數(shù)量。目前，外源性添加乳酸菌制劑已成為改善發(fā)酵品質(zhì)方法之一[9]。Yan等[10]從我國(guó)南方高水分玉米青貯飼料中分離得到植物乳桿菌LP694，該菌株抗逆性強(qiáng)，產(chǎn)乳酸效率高，可降低意大利黑麥草青貯飼料纖維含量。米糠(rice bran，RB)是稻谷加工副產(chǎn)品，年產(chǎn)量約為2 000萬(wàn)t，其中約70%用作動(dòng)物飼料[11-12]。有研究表明，米糠作為碳源可促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)，提高青貯飼料乳酸含量[13-14]?；诖?，我們推測(cè)米糠通過(guò)促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)繁殖從而抑制青貯飼料中不良微生物活動(dòng)來(lái)提高青貯質(zhì)量。因此，本試驗(yàn)以花期刈割的揉絲檸條錦雞兒為原料，以米糠、商業(yè)植物乳桿菌和植物乳桿菌LP694為青貯飼料添加劑，旨在比較米糠和不同乳酸菌制劑對(duì)檸條錦雞兒青貯的發(fā)酵品質(zhì)及微生物多樣性的影響，以期為開(kāi)發(fā)非常規(guī)飼料資源檸條錦雞兒提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取種植年限為5年的檸條錦雞兒，2019年5月4日盛花期收獲于寧夏鹽池人工檸條林，立即揉絲，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。同時(shí)，采取300 g檸條錦雞兒樣品裝入液氮罐以備測(cè)定其營(yíng)養(yǎng)成分及微生物多樣性。米糠購(gòu)于寧夏某科技實(shí)業(yè)有限公司，商業(yè)植物乳桿菌制劑購(gòu)于天津某有限公司，植物乳桿菌LP694(保藏編號(hào)為CGMCC No.15073)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。檸條錦雞兒和米糠的營(yíng)養(yǎng)成分如表1所示。

表1 檸條錦雞兒和米糠的營(yíng)養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以花期檸條錦雞兒為青貯原料，共設(shè)4個(gè)處理，分別為無(wú)添加(對(duì)照組)、添加5%米糠(RB組)、添加5%米糠+105CFU/g商業(yè)植物乳桿菌(RB+LP組)和添加5%米糠+105CFU/g植物乳桿菌LP694(RB+LP694組)。

檸條錦雞兒水分含量采用Aurora型手持式近紅外光譜儀測(cè)定，通過(guò)添加水將其水分含量調(diào)制為60%左右時(shí)按照上述進(jìn)行處理。通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定商業(yè)乳桿菌和植物乳桿菌LP694活菌數(shù)量，將2種乳酸菌制劑稀釋至105CFU/g。每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)稱取500 g左右調(diào)制好的樣品裝入青貯袋(30 cm×20 cm)中，真空封口機(jī)封口，置于室溫貯存60 d。青貯60 d后測(cè)定營(yíng)養(yǎng)成分、發(fā)酵特性及微生物多樣性。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵特性測(cè)定

取200 g檸條錦雞兒原料及其青貯飼料樣品于105 ℃殺青30 min，65 ℃烘箱烘48 h至恒重，測(cè)定干物質(zhì)(dry matter，DM)含量，粉碎后過(guò)2 mm篩進(jìn)行化學(xué)分析。中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)和總氮(total nitrogen，TN)含量測(cè)定參照張麗英[15]，可溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate，WSC)含量測(cè)定參照李富國(guó)[16]。

取10 g檸條錦雞兒青貯樣品于90 mL蒸餾水中勻漿1 min，經(jīng)4層紗布和雙層濾紙過(guò)濾后獲得青貯飼料浸提液，-20 ℃保存。分別用pH計(jì)(雷磁PHS-3G，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、苯酚-次氯酸鈉比色法[17]、乳酸測(cè)試盒(A019-2-1型，乳酸脫氫酶法，南京建成生物工程研究所)和氣相色譜儀(GC-2010，日本島津公司)測(cè)定pH及氨態(tài)氮(NH3-N)、乳酸、乙酸含量。

1.3.2 微生物多樣性測(cè)定

使用FastDNA?Spin Kit for Soil(MP Biomedicals公司，美國(guó))試劑盒提取樣品中細(xì)菌總DNA。選用細(xì)菌16S rRNA的V3～V4可變區(qū)338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對(duì)所提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)(Illumina公司，美國(guó))進(jìn)行測(cè)序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用JMP軟件通過(guò)擬合最小二乘法進(jìn)行方差分析，組間差異利用Tukey HSD法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。使用Uparse軟件對(duì)有效序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類(相似度97%以上)，利用RDP classifier比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU132)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。采用Mothur軟件平臺(tái)進(jìn)行Alpha多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸條錦雞兒青貯營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵特性分析

如表2所示，與對(duì)照組相比，RB、RB+LP和RB+LP694組青貯飼料中NDF和ADF含量均顯著降低(P<0.05)，RB和RB+LP694組青貯飼料中pH顯著降低(P<0.05)，RB+LP694組青貯飼料中NH3-N/TN顯著降低(P<0.05)，RB、RB+LP和RB+LP694組青貯飼料中乳酸含量及乳酸/乙酸均顯著提高(P<0.05)，RB和RB+LP694組青貯飼料中乙酸含量顯著降低(P<0.05)，RB和RB+LP組青貯飼料中丙酸含量顯著提高(P<0.05)。各組之間青貯飼料中干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 檸條錦雞兒青貯營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵特性(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 檸條錦雞兒青貯微生物Alpha多樣性分析

如表3所示，各組Coverage指數(shù)均在0.99以上，表明測(cè)序結(jié)果足以反映樣本中絕大部分微生物物種信息。RB+LP組Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照、RB和RB+LP694組(P<0.05)，而RB+LP694組Chao1指數(shù)顯著低于RB組(P<0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明不同添加劑處理影響了檸條錦雞兒青貯微生物群落多樣性。

表3 Alpha多樣性指數(shù)

2.3 檸條錦雞兒青貯微生物Beta多樣性分析

檸條錦雞兒青貯主坐標(biāo)分析(PCoA)如圖1所示，檸條錦雞兒原料及其青貯飼料在圖中有明顯分離，不同添加劑處理的青貯飼料之間亦有明顯分離，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)解釋度分別占總方差的64.13%和16.76%。

FM：檸條錦雞兒原料 Caragana korshinskii raw material；Con：對(duì)照組 control group；RB：RB組 RB group；RB+LP：RB+LP組 RB+LP group；RB+LP694：RB+LP694組 RB+LP694 group。圖2同 the same as Fig.2。

2.4 檸條錦雞兒青貯微生物相對(duì)豐度分析

基于門水平下檸條錦雞兒青貯前后微生物組成如圖2-A所示，檸條錦雞兒青貯原料中優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(Proteobacteria，54.50%)、放線菌門(Actinobacteria，30.06%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，9.57%)和厚壁菌門(Firmicutes，3.26%)。青貯60 d后，各組青貯飼料中優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門，其次為變形菌門。對(duì)照、RB、RB+LP和RB+LP694組厚壁菌門相對(duì)豐度分別為73.02%、94.80%、68.81%和98.99%，變形菌門相對(duì)豐度分別為26.90%、4.82%、28.74%和0.96%。其中，RB+LP組中還含有相對(duì)豐度分別為1.45%和0.66%的放線菌門和擬桿菌門。

圖2 基于門水平(A)和屬水平(B)的檸條錦雞兒青貯微生物相對(duì)豐度

基于屬水平下檸條錦雞兒青貯前后微生物組成如圖2-B所示，檸條錦雞兒青貯原料中優(yōu)勢(shì)菌屬為紅球菌屬(Rhodococcus，13.73%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，12.70%)、泛菌屬(Pantoea，7.09%)、薄層菌屬(Hymenobacter，7.06%)、伯克氏菌屬(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，2.37%)和大量其他菌屬(56.23%)。青貯60 d后，各組青貯飼料中優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬(Lactobacillus)。對(duì)照組中相對(duì)豐度較高的菌屬為乳桿菌屬(71.85%)、腸桿菌屬(Enteobacter，19.62%)及未分類腸桿菌科(unclassfied_f_Enterobacteriaceae，6.98%)；RB組中相對(duì)豐度較高的菌屬為乳桿菌屬(91.81%)、醋桿菌屬(Acetobacter，1.84%)、伯克氏菌屬(1.18%)及片球菌屬(Pediococcus，1.23%)；RB+LP組中微生物種類較多，乳桿菌屬相對(duì)豐度僅占38.61%；RB+LP694組中乳桿菌相對(duì)豐度高達(dá)98.88%。

2.5 檸條錦雞兒青貯微生物群落與發(fā)酵品質(zhì)之間的相關(guān)性分析

如圖3所示，醋桿菌屬相對(duì)豐度與中性洗滌纖維(r=-0.68)和酸性洗滌纖維含量(r=-0.73)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，伯克氏菌屬相對(duì)豐度與中性洗滌纖維(r=-0.66)和酸性洗滌纖維相對(duì)豐度(r=-0.66)也呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。pH與乳桿菌屬相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.75，P<0.01)，與腸球菌屬(Enterococcus，r=0.78)、腸桿菌屬(r=0.85)和未分類腸桿菌科相對(duì)豐度(r=0.80)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。乙酸含量與腸桿菌屬(r=0.65)和未分類腸桿菌科相對(duì)豐度(r=0.68)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

LA：乳酸 lactic acid；PA：丙酸 propionic acid；NDF：中性洗滌纖維 neutral detergent fiber；ADF：酸性洗滌纖維 acid detergent fiber；AA：乙酸 acetic acid；NH3-N：氨態(tài)氮 ammonia nitrogen。

3 討 論

3.1 不同添加劑處理對(duì)檸條錦雞兒青貯營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵特性的影響

青貯原料特性是影響青貯發(fā)酵質(zhì)量的重要因素。因檸條錦雞兒為豆科灌木，具有WSC含量低、CP含量和緩沖能高的特性，因而單獨(dú)青貯較難成功。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，RB、RB+LP和RB+LP694組青貯飼料中NDF和ADF含量均顯著降低。RB+LP和RB+LP694組中纖維含量較低的原因可能是青貯發(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生纖維溶解酶所致[10]。低pH有利于抑制青貯飼料中蛋白酶活性，從而降低NH3-N含量和蛋白質(zhì)分解程度[18]。本試驗(yàn)中，CON和RB+LP組青貯飼料中pH較高，故NH3-N含量較高。而RB和RB+LP694組青貯飼料中pH較低，抑制了青貯飼料在發(fā)酵過(guò)程中的蛋白質(zhì)降解，故NH3-N含量較低。乳酸/乙酸能反映青貯同型發(fā)酵程度，同型發(fā)酵程度越高越有利于降低青貯飼料pH。RB和RB+LP694組青貯飼料中乙酸含量低，乳酸含量和乳酸/乙酸高，同型發(fā)酵程度較高。張?jiān)鲂赖萚19]通過(guò)研究丙酸對(duì)多花黑麥草青貯動(dòng)態(tài)發(fā)酵影響得出，丙酸會(huì)通過(guò)抑制青貯初期某些不耐酸的乳酸菌來(lái)促進(jìn)某些耐酸性的乳酸菌生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，RB+LP組青貯飼料中丙酸含量較高，表明丙酸對(duì)該組中添加的商業(yè)植物乳桿菌具有抑制作用，從而導(dǎo)致青貯pH較高。綜合營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵特性來(lái)看，RB+LP694組青貯飼料具有較好的發(fā)酵品質(zhì)。

3.2 不同添加劑處理對(duì)檸條錦雞兒青貯微生物多樣性的影響

Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別反映樣品微生物多樣性和豐富度[10]。Shannon指數(shù)越大表明微生物多樣性越高，Chao指數(shù)越大表明微生物豐富度越高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加米糠可降低檸條錦雞兒青貯微生物多樣性，并增加乳桿菌屬相對(duì)豐度。這是因?yàn)槊卓肪哂邢鄬?duì)豐富的WSC含量，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，抑制不良微生物增殖[20]。RB+LP694組檸條錦雞兒青貯微生物多樣性和豐富度降低是因?yàn)橥庠葱蕴砑拥闹参锶闂U菌LP694成為優(yōu)勢(shì)菌屬，抑制了其他微生物生長(zhǎng)繁殖。RB+LP組檸條錦雞兒青貯微生物多樣性和豐富度提高，可能是因?yàn)樯虡I(yè)乳桿菌未能在青貯初期快速降低青貯飼料pH，較高pH環(huán)境下適宜大量微生物生長(zhǎng)繁殖。通過(guò)PCoA可知，檸條錦雞兒原料及其青貯飼料之間微生物群落具有差異性，不同添加劑使得微生物群落發(fā)生了變化。

3.3 檸條錦雞兒青貯微生物群落與發(fā)酵品質(zhì)之間的相關(guān)性

有研究表明，厭氧環(huán)境導(dǎo)致青貯微生物群落由變形菌門演替為厚壁菌門[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，變形菌門是檸條錦雞兒原料微生物群落的優(yōu)勢(shì)菌門，而青貯后微生物群落的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門。變形菌門微生物為革蘭氏陰性菌，與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)利用WSC，導(dǎo)致青貯飼料中NH3-N含量增加[22]。厚壁菌門是革蘭氏陽(yáng)性菌，可以降解淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素等許多大分子化合物[23]。青貯發(fā)酵后變形菌門相對(duì)豐度的減少和厚壁菌門相對(duì)豐度的增加可能是導(dǎo)致RB和RB+LP694組青貯飼料中NDF、ADF和NH3-N含量減少的原因。

醋桿菌屬微生物產(chǎn)乙酸，能夠引發(fā)青貯有氧劣化[24]。醋酸菌(Acetobacteraceti)適宜生長(zhǎng)于pH約為7.0的環(huán)境條件下，抑制乳酸菌生長(zhǎng)后主導(dǎo)青貯發(fā)酵，從而形成富含醋酸菌的青貯飼料[25]，這可能是導(dǎo)致RB+LP組pH較高的原因之一。然而，Wang[26]等認(rèn)為醋桿菌屬微生物并不會(huì)影響青貯飼料pH，可能與微生物種類有關(guān)。因此，關(guān)注種水平下醋桿菌尤為重要。眾所周知，乳桿菌屬微生物在青貯過(guò)程中占主導(dǎo)地位，對(duì)青貯飼料pH的降低起著重要作用[27]。乳桿菌屬是檸條錦雞兒青貯中優(yōu)勢(shì)菌屬，RB+LP694和RB組中的乳桿菌屬相對(duì)豐度較高，其中，RB+LP694組中乳桿菌屬為檸條錦雞兒青貯中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。這表明米糠可為檸條錦雞兒青貯中乳酸菌繁殖提供發(fā)酵基質(zhì)，使外源添加的植物乳桿菌LP694更適宜在檸條錦雞兒青貯中生長(zhǎng)。然而，RB+LP組中乳桿菌屬相對(duì)豐度較低，且含有醋桿菌屬和未分類腸桿菌科，表明商業(yè)乳桿菌不適宜做檸條錦雞兒青貯添加劑。對(duì)于青貯飼料而言，原料中附生微生物不僅在青貯飼料自然發(fā)酵中發(fā)揮重要作用，而且由于微生物生態(tài)系統(tǒng)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)或相互作用，將影響外源接種劑的有效性。

通過(guò)Spearman相關(guān)性分析可知，腸桿菌屬及未分類腸桿菌科相對(duì)豐度與pH和乙酸含量呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中，對(duì)照組中含有較高相對(duì)豐度的腸桿菌屬和未分類腸桿菌科，RB+LP組中含有較高相對(duì)豐度的未分類腸桿菌科，因而二者發(fā)酵品質(zhì)不佳。這是因?yàn)椴涣嘉⑸锬c桿菌在青貯飼料中雖然是非致病菌，但其在發(fā)酵初期與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)WSC，青貯pH降低緩慢，產(chǎn)生NH3-N和乙酸等產(chǎn)物[28-29]。本研究結(jié)果表明，乳桿菌屬相對(duì)豐度與pH呈負(fù)相關(guān)，這與趙嫚等[30]研究結(jié)果一致。RB+LP694組中乳桿菌屬占絕對(duì)主導(dǎo)地位，因而青貯pH最低，發(fā)酵品質(zhì)相對(duì)更好。此外，醋桿菌屬、伯克氏菌屬相對(duì)豐度與中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明這2種菌屬的微生物在檸條錦雞兒青貯發(fā)酵過(guò)程中在降低纖維含量方面可能發(fā)揮了重要的作用，在后續(xù)研究中應(yīng)予以重視。

4 結(jié) 論

① 從發(fā)酵品質(zhì)來(lái)看，添加5%米糠+105CFU/g植物乳桿菌LP694比添加5%米糠在降低檸條錦雞兒青貯的pH和NH3-N含量、提高乳酸含量和乳酸/乙酸方面效果更佳，添加5%米糠+105CFU/g商業(yè)植物乳桿菌對(duì)發(fā)酵品質(zhì)改善效果較差。

② 不同添加劑改變了檸條錦雞兒青貯的微生物組成，添加5%米糠和5%米糠+105CFU/g植物乳桿菌LP694增加了厚壁菌門和乳桿菌屬相對(duì)豐度，并降低了變形菌門和腸桿菌屬相對(duì)豐度，而添加5%米糠+105CFU/g商業(yè)植物乳桿菌則降低了乳桿菌屬相對(duì)豐度。

③ 本試驗(yàn)中，綜合發(fā)酵品質(zhì)和微生物組成，檸條錦雞兒青貯時(shí)添加5%米糠+105CFU/g植物乳桿菌LP694效果最好。