崔浩然 白天天 趙林波 陳顏旭 郭雪峰,2* 金 巍

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300；2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾843300；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京210032)

新疆是我國(guó)的畜牧大省，有著豐富的物種資源，擁有超過(guò)3 000萬(wàn)只的本地品種羊資源，主要有策勒黑羊、和田羊、卡拉庫(kù)爾羊、哈薩克羊、多浪羊等品種，這些本地品種羊有著耐粗飼和對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。近幾年新疆響應(yīng)國(guó)家號(hào)召大力發(fā)展畜牧業(yè)，從國(guó)內(nèi)外引進(jìn)了大量的優(yōu)秀品種來(lái)擴(kuò)大繁育，湖羊因其生長(zhǎng)發(fā)育快、多胎性等特點(diǎn)成為了新疆引種擴(kuò)繁的重點(diǎn)[3-4]。瘤胃是反芻動(dòng)物重要的消化器官，內(nèi)部有豐富的瘤胃微生物，瘤胃菌群的結(jié)構(gòu)處于相對(duì)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡，該平衡對(duì)于維持動(dòng)物機(jī)體健康、瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收及提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能等起著重要的作用[5-7]。瘤胃菌群結(jié)構(gòu)主要受動(dòng)物品種、日齡、地區(qū)、飼糧結(jié)構(gòu)等多種因素的影響[8-10]。不同品種之間的瘤胃菌群結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，但其菌群組成和相對(duì)豐度存在一定差異。King等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在相同的飼養(yǎng)條件下，娟姍牛和荷斯坦牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)相似度很高，但娟姍牛瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷短桿菌的相對(duì)豐度顯著高于荷斯坦牛。韓帥[12]在比較呼倫貝爾羔羊和呼倫貝爾羊與杜泊羊雜一代(呼杜雜一代)羔羊瘤胃微生物動(dòng)態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)呼杜雜一代羔羊在產(chǎn)甲烷菌、脂解厭氧弧桿菌、反芻月形單胞菌、牛鏈球菌的相對(duì)豐度上高于呼倫貝爾羔羊。以上研究表明不同品種間由于動(dòng)物品種遺傳學(xué)差異會(huì)引起瘤胃內(nèi)部分菌落相對(duì)豐度的差異。本試驗(yàn)以新疆地方品種羊卡拉庫(kù)爾羊和引入品種湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象，在飼喂相同飼糧的條件下分析湖羊與卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的差異性，揭示卡拉庫(kù)爾羊較湖羊耐受高粗飼料飼糧的瘤胃微生物機(jī)制，為南疆地區(qū)不同品種羊的飼養(yǎng)管理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選取體重[(35±2) kg]相近的健康卡拉庫(kù)爾羊羯羊和湖羊羯羊各6只，飼喂相同飼糧。參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)[13]配制基礎(chǔ)飼糧(維持需要)，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示，分別于每日08：00與20：00分2次限量飼喂1.2 kg，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

試驗(yàn)預(yù)試期為30 d，正試期為3 d。在正試期第1～3天于晨飼前通過(guò)口腔采集瘤胃液，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，每天收集每組混合瘤胃液約50 mL，立即放入液氮中，后于-80 ℃冰箱保存，以備送檢。

1.3 樣品送檢

將瘤胃液樣品送至百邁客生物有限公司用PacBio測(cè)序方法對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 測(cè)序及生物信息分析

提取樣品總DNA后，利用細(xì)菌16S rRNA基因全長(zhǎng)引物序列合成帶有Barcode的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)(SMRT Bell)，建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用PacBio Sequel進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)smrtlink分析軟件導(dǎo)出CCS文件，根據(jù)Barcode序列識(shí)別不同樣品的數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)化為fastq格式數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)預(yù)處理：將PacBio下機(jī)的數(shù)據(jù)導(dǎo)出為CCS文件(CCS序列使用Pacbio提供的smrtlink工具獲取)后，主要有如下3個(gè)步驟：1)CCS識(shí)別。使用lima v1.7.0軟件，通過(guò)Barcode對(duì)CCS進(jìn)行識(shí)別，得到的Raw-CCS序列數(shù)據(jù)。2)CCS過(guò)濾。使用cutadapt 1.9.1軟件進(jìn)行引物序列的識(shí)別與去除并且進(jìn)行長(zhǎng)度過(guò)濾，得到不包含引物序列的Clean-CCS序列。3)去除嵌合體。使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到Effective-CCS序列。后續(xù)進(jìn)行多樣性分析、差異分析、相關(guān)性分析及功能預(yù)測(cè)等。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖羊與卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群Alpha多樣性分析

由表2可知，樣品的覆蓋度(Coverage)均約等于1，說(shuō)明本次測(cè)序結(jié)果能夠反映樣本的真實(shí)情況；卡拉庫(kù)爾羊的操作分類單元(OTUs)數(shù)目、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均極顯著高于湖羊(P<0.01)，說(shuō)明在飼喂相同飼糧條件下卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群的多樣性和豐富度均高于湖羊。

表2 湖羊與卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群Alpha多樣性指數(shù)

2.2 湖羊與卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群組成特異性分析

如圖1所示，本試驗(yàn)所有樣本共得到626個(gè)OTUs，其中278個(gè)OTUs為2個(gè)品種羊共有的，占OTUs總數(shù)的44.4%。湖羊特有OTUs 109個(gè)，占17.4%；卡拉庫(kù)爾羊特有OTUs 239個(gè)，占38.2%，上述結(jié)果說(shuō)明湖羊和卡拉庫(kù)爾羊的瘤胃菌群結(jié)構(gòu)存在差異性。

圖1 維恩圖

2.3 湖羊與卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析

湖羊和卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群在門(mén)水平上的組成和相對(duì)豐度如表3所示。本試驗(yàn)共獲得20個(gè)細(xì)菌門(mén)，其中在至少1個(gè)品種羊上的相對(duì)豐度大于1%的菌門(mén)有厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)、Kiritimatiellaeota、軟壁菌門(mén)(Tenericutes)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、髕骨細(xì)菌門(mén)(Patescibacteria)和互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)。湖羊的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)(86.25%)、擬桿菌門(mén)(4.3%)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)(3.12%)；卡拉庫(kù)爾羊的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)(59.57%)、擬桿菌門(mén)(21.34%)和Kiritimatiellaeota(9.75%)。湖羊厚壁菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著高于卡拉庫(kù)爾羊(P<0.05)，髕骨細(xì)菌門(mén)和互養(yǎng)菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著低于卡拉庫(kù)爾羊(P<0.05)，擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、Kiritimatiellaeota和軟壁菌門(mén)的相對(duì)豐度極顯著低于卡拉庫(kù)爾羊(P<0.01)。

表3 湖羊與卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群在門(mén)水平上的組成和相對(duì)豐度

湖羊和卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群在屬水平上的組成和相對(duì)豐度如表4所示。本試驗(yàn)在屬水平上共鑒定出130個(gè)細(xì)菌屬，在至少1個(gè)品種羊中相對(duì)豐度大于1%的菌屬有10個(gè)。湖羊的優(yōu)勢(shì)菌屬有為奎恩氏菌屬(46.43%)、丁酸弧菌屬(6.34%)和克里斯滕森菌科_R-7_群(5.72%)；卡拉庫(kù)爾羊的優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃氏菌屬_1(18.20%)、克里斯滕森菌科_R-7_群(17.09%)和奎恩氏菌屬(6.97%)。湖羊奎恩氏菌屬的相對(duì)豐度極顯著高于卡拉庫(kù)爾羊(P<0.01)，丁酸弧菌屬的相對(duì)豐度顯著高于卡拉庫(kù)爾羊(P<0.05)；卡拉庫(kù)爾羊克里斯滕森菌科_R-7_群、普雷沃氏菌屬_1、瘤胃球菌科_NK4A214、Uncultured_bacterium_o_WCHB1-41、Uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39的相對(duì)豐度極顯著高于湖羊(P<0.01)，毛螺旋菌科_XPB1014_群、解琥珀酸菌屬、瘤胃球菌科_UCG-014的相對(duì)豐度顯著高于湖羊(P<0.05)。

表4 湖羊與卡拉庫(kù)爾羊瘤胃細(xì)菌菌群在屬水平上的相對(duì)豐度

2.4 湖羊與卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群代謝途徑和功能預(yù)測(cè)

湖羊在細(xì)胞過(guò)程和環(huán)境信息處理2個(gè)生物代謝通路的富集高于卡拉庫(kù)爾羊(圖2)；卡拉庫(kù)爾羊在生物系統(tǒng)和遺傳信息處理2個(gè)生物代謝通路的富集高于湖羊。進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)基因二級(jí)功能層進(jìn)行分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)湖羊在傳染病(細(xì)菌)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、輔因子和維生素的代謝、能量代謝以及折疊、修飾和降解等生物代謝通路的富集高于卡拉庫(kù)爾羊；而卡拉庫(kù)爾羊在核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、復(fù)制和修復(fù)、氨基酸代謝、其他次生代謝物的生物合成、碳水化合物代謝、翻譯、老化、膜運(yùn)輸?shù)确矫嫔锎x通路的富集高于湖羊。

Organismal systems：生物系統(tǒng)；Cellular processes：細(xì)胞過(guò)程；Environmental information processing：環(huán)境信息處理；Human diseases：人類疾?。籊enetic information processing：遺傳信息處理。

Circulatory system：循環(huán)系統(tǒng)；Drug resistance: antimicrobial：耐藥性(抗菌)；Nucleotide metabolism：核苷酸代謝；Lipid metabolism：脂質(zhì)代謝；Infectious diseases: bacterial：傳染病(細(xì)菌)；Replication and repair：復(fù)制和修復(fù)；Signaling molecules and interaction：信號(hào)分子和相互作用；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)：Cell motility；輔因子和維生素的代謝：Metabolism of cofactors and vitamins；Immune diseases：免疫疾病；Energy metabolism：能量代謝；Amino acid metabolism：氨基酸代謝；Biosynthesis of other secondary metabolites：其他次生代謝物的生物合成；Nervous system：神經(jīng)系統(tǒng)；Cancers: specific types：癌癥：特定類型；Neurodegenerative diseases：神經(jīng)退行性疾??；Transcription：轉(zhuǎn)錄；Carbohydrate metabolism：碳水化合物代謝；Excretory system：排泄系統(tǒng)；Translation：翻譯；Folding, sorting and degradation：折疊、分類和降解；Infectious diseases: parasitic：傳染病(寄生蟲(chóng))；Aging：老化；Global and overview maps：全局和概覽圖；Environmental adaptation：環(huán)境適應(yīng)；Metabolism of terpenoids and polyketides：萜類化合物和聚酮化合物的代謝；Cardiovascular diseases：心血管疾??；Membrane transport：膜運(yùn)輸。

3 討 論

瘤胃微生物對(duì)反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收有著重要的意義。動(dòng)物品種被證明是影響反芻動(dòng)物瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的重要因素[14]。Chang等[15]研究表明，藏綿羊的瘤胃菌群豐富度和多樣性均顯著高于小尾寒羊和杜波羊。Huang等[16]報(bào)道，西藏綿羊比甘肅高山細(xì)毛羊更能適應(yīng)高原惡劣環(huán)境的原因可能是西藏綿羊瘤胃菌群組成更多樣性。本研究中卡拉庫(kù)爾羊的瘤胃菌群豐富度和多樣性均高于湖羊，暗示卡拉庫(kù)爾羊?qū)Νh(huán)境擁有更好的適應(yīng)能力。

在本研究中湖羊與卡拉庫(kù)爾羊的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，且厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度高于擬桿菌門(mén)。這與眾多研究描述的瘤胃內(nèi)厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度高于擬桿菌門(mén)的結(jié)果[17-18]相一致，但與一些研究描述的擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度高于厚壁菌門(mén)的報(bào)道[19-20]不同。這可能與羊的品種、飼糧結(jié)構(gòu)及飼養(yǎng)環(huán)境的差異有關(guān)。厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)被報(bào)道是瘤胃內(nèi)最豐富的菌門(mén)[21]，其中厚壁菌門(mén)主要與瘤胃內(nèi)纖維的降解和脂肪的沉積有關(guān)[22-23]，而擬桿菌門(mén)主要參與淀粉的降解過(guò)程[21]。Fernando等[24]研究發(fā)現(xiàn)，牛瘤胃菌群中厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比值隨著飼糧結(jié)構(gòu)中粗飼料占比的增加而增加。本研究中湖羊與卡拉庫(kù)爾羊優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度更高，這與本試驗(yàn)采用的是高粗飼料占比的飼糧結(jié)構(gòu)相一致。

在本試驗(yàn)中湖羊的優(yōu)勢(shì)菌屬是奎恩氏菌屬、丁酸弧菌屬和克里斯滕森菌屬_R-7_群；卡拉庫(kù)爾羊的優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃氏菌屬_1、克里斯滕森菌屬_R-7_群和奎恩氏菌屬。奎恩氏菌屬被報(bào)道主要參與瘤胃內(nèi)碳水化合物的降解過(guò)程[25]，本試驗(yàn)中湖羊奎恩氏菌屬的相對(duì)豐度極顯著高于卡拉庫(kù)爾羊，表明湖羊可能在消化富含非纖維碳水化合物的飼糧時(shí)更具優(yōu)勢(shì)。克里斯滕森菌科_R-7_群是參與蛋白質(zhì)降解過(guò)程的主要菌屬[26]。普雷沃氏菌和丁酸弧菌被證明與瘤胃內(nèi)纖維的降解過(guò)程相關(guān)[27-29]。其中普雷沃氏菌屬于擬桿菌門(mén)，是瘤胃內(nèi)最活躍的菌屬，不僅參與纖維素的降解過(guò)程，還與瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)、可溶性碳水化合物和半纖維素的降解相關(guān)[30-31]。提高飼糧中精料的占比會(huì)引起普雷沃氏菌相對(duì)豐度的增加[32]，而當(dāng)飼糧結(jié)構(gòu)中粗飼料占比高時(shí)也會(huì)引起普雷沃氏菌的大量增殖[33]。其原因可能是普雷沃氏菌既參與蛋白質(zhì)和碳水化合物的降解和過(guò)程，又是瘤胃內(nèi)主要的纖維素菌?？ɡ瓗?kù)爾羊的普雷沃氏菌屬_1的相對(duì)豐度極顯著高于湖羊，這或許是卡拉庫(kù)爾羊具有更強(qiáng)適應(yīng)性的原因。本試驗(yàn)未能開(kāi)展更多品種和飼糧結(jié)構(gòu)對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃菌群影響的綜合研究，具有一定的局限性，因此，后期需要綜合研究品種和飼糧結(jié)構(gòu)對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃菌群的影響作用。

KEGG代謝途徑常用來(lái)分析微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異，是研究群落樣本為適應(yīng)環(huán)境變化發(fā)生的代謝功能改變的有效手段[34]。在本試驗(yàn)中，湖羊在傳染病(細(xì)菌)、免疫疾病、能量代謝以及折疊、分類和降解等生物代謝通路的富集高于卡拉庫(kù)爾羊；而卡拉庫(kù)爾羊則在核苷酸代謝、復(fù)制和修復(fù)、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸?shù)壬锎x通路的富集更高。其中微生物的復(fù)制和修復(fù)、核苷酸代謝通路被證明與細(xì)菌增長(zhǎng)密切相關(guān)[35]。本試驗(yàn)中卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群的多樣性和豐富度均高于湖羊組，說(shuō)明卡拉庫(kù)爾羊良好的適應(yīng)性可能與其瘤胃微生物的復(fù)制和修復(fù)、核苷酸代謝通路的表達(dá)有關(guān)。李勇[36]研究表明，瘤胃內(nèi)許多微生物能夠共享代謝通路，瘤胃微生物的差異性并不會(huì)改變瘤胃微生物的功能。因此，造成瘤胃菌群代謝途徑差異的原因尚需要更加深入的研究。

4 結(jié) 論

湖羊與卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)和瘤胃微生物的代謝通路具有一定的相似性，但卡拉庫(kù)爾羊瘤胃菌群的多樣性和豐富度均高于湖羊，一些特異性菌屬相對(duì)豐度和生物代謝通路富集的差異可能與卡拉庫(kù)爾羊適應(yīng)高粗飼料飼糧的特性有關(guān)。