范秋麗 陳志龍 林澤鈴 張 盛 茅沈麗 蔣守群

(廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農業(yè)農村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州510640)

隨著國內禁止使用促生長類抗生素以來，抗生素替代品在畜牧養(yǎng)殖中的研究也受到越來越廣泛的關注，包括對五倍子提取物的研究。五倍子是蚜蟲寄生在漆樹科鹽膚木屬植物葉柄或葉子上所形成的蟲癭，我國五倍子產量約占世界總產量的95%，產量高且品質優(yōu)，五倍子提取物的主要成分之一為沒食子酸，其占總提取物的2%～4%[1]。前人研究表明，作為一種有機酚酸，沒食子酸具有抑菌、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等生物活性。添加250 μg/mL沒食子酸可降低變形鏈球菌生物活性、減少胞外多糖含量以及微菌落數量[2]；添加300 mg/mL沒食子酸可下調丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白表達水平，減少活性氧(ROS)的產生[3]；添加0.05～0.20 g/kg沒食子酸可減少在4 ℃冷藏了9 d的豬肉糜中硫代巴比妥酸(TBARs)值，抑制羰基化合物的生成和表面疏水性的增加[4]；口服50 mg/kg體重的沒食子酸可消除N-亞硝基-二乙胺對小鼠肝臟的致癌作用[5]。沒食子酸已被證明可提高畜禽產品品質，降低有害氣體排放。22～36日齡肉雞飼糧添加1%的沒食子酸可提高胸肌持水力以及多不飽和脂肪酸花生四稀酸和二十二碳六烯酸含量，同時提高腿肌中亞油酸和二十二碳六烯酸含量[6-7]；飼糧添加1.5%沒食子酸可減少42日齡肉牛甲烷的排放量[8]。近年來，黃羽肉雞年出欄量達40億只，約占肉雞總出欄量的40%[9]。目前，沒食子酸在黃羽肉雞上的應用研究報道很少，且沒食子酸在調節(jié)肉雞免疫功能和改善腸道微生物菌群結構方面尚無報道。因此，本試驗以1～42日齡新廣901肉雞為對象，研究了飼糧添加不同水平五倍子提取物對其生長性能、腸道形態(tài)、免疫功能、抗氧化能力及盲腸菌群結構的影響，為五倍子提取物替代抗生素在黃羽肉雞健康養(yǎng)殖中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1日齡雛雞購自佛山市高明區(qū)新廣農牧有限公司；恩拉霉素(純度98%)購自山東某獸藥有限公司；五倍子提取物購自某生物科技股份有限公司，有效成分含量為4%的沒食子酸(無其他活性成分)，以二氧化硅為載體。

1.2 試驗設計

選擇600只初始體重為(39.75±0.02) g且健康狀況良好的1日齡新廣901肉公雛，根據體重一致原則隨機分為4個組，每組6個重復，每個重復25只。對照組飼喂基礎飼糧，抗生素組在基礎飼糧中添加2 mg/kg恩拉霉素，五倍子1組在基礎飼糧中添加250 mg/kg五倍子提取物，五倍子2組在基礎飼糧中添加500 mg/kg五倍子提取物。試驗分1～21日齡和22～42日齡2個階段飼養(yǎng)，試驗期42 d。

1.3 試驗飼糧

試驗采用玉米-豆粕-雜粕型基礎飼糧，根據《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表》(2019年第30版)和《黃羽肉雞營養(yǎng)需要量》(NY/T 3645—2020)配制，各組營養(yǎng)水平保持一致，恩拉霉素和五倍子提取物按照不同添加水平等重量替代預混料中的統(tǒng)糠。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所內的封閉式雞舍開展，地面鋪放谷殼，試驗雞自由采食顆粒料和飲水，各組飼養(yǎng)管理和環(huán)境條件一致，每天自然光照和通風。按照常規(guī)操作程序和免疫流程進行飼養(yǎng)和免疫，每天06:00、12:00、18:00記錄雞舍溫度和相對濕度。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目Items1～21日齡1 to 21 days of age22～42日齡22 to 42 days of age粗蛋白質 CP21.5019.50賴氨酸 Lys1.291.15蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.930.85鈣 Ca1.000.92總磷 TP0.740.67有效磷 AP 0.470.41

1.5 樣品采集與制備

試驗結束時每個重復選取接近平均重的2只雞頸部放血致死，剖取空腸和回腸，各腸段取中間1 cm處分別固定于4%的多聚甲醛溶液中，備測空腸和回腸形態(tài)指標。剩余空腸和回腸剪取中間部位約1 g裝于滅菌的1.5 mL離心管中，標記后立即置于液氮中保存，備測空腸和回腸生化指標以及相關基因表達量。收集盲腸食糜于滅菌的10 mL離心管中，標記后立即置于液氮保存，備測菌群結構。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 生長性能

試驗各階段結束前1天20：00斷料供水，次日08：00以重復為單位稱重，統(tǒng)計耗料量，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)以及死亡率。

1.6.2 腸道形態(tài)

空腸和回腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度值的具體測定方法參考范秋麗等[10]。

1.6.3 腸道生化指標

分別剪取凍存的空腸和回腸樣品100 mg左右于滅菌的2 mL離心管中(離心管中含有2顆直徑為0.3 mm的鎬珠)，按照組織樣品重量(mg)∶生理鹽水體積(μL)=1∶9的比在研磨儀(JXFSTPRP-CL，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)上勻漿(50 Hz，120 s，4 ℃)，勻漿后的樣品3 000×g離心10 min取上清即為10%空腸、回腸勻漿液，可直接用于測定生化指標。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒測定空腸、回腸總蛋白含量，試劑盒購買于賽默飛世爾科技(上海)有限公司。雙抗夾心法測定空腸、回腸分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)含量，以上免疫指標試劑盒均購買于上海麥莎生物科技有限公司。丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性等抗氧化指標具體測定方法參考范秋麗等[10]所述方法。

以上總蛋白含量以及免疫、抗氧化相關指標的測定均在多功能酶標儀(SYNERGY H1，BioTek公司，美國)上讀數，測定方法和結果計算嚴格按照試劑盒說明書上的步驟操作。

1.6.4 腸道緊密連接和抗氧化相關基因表達

分別剪取100 mg空腸、回腸樣品于2 mL無RNase離心管中，每管加入1 mL Trizol試劑(北京艾德萊生物科技有限公司)提取總RNA，提取方法嚴格按照說明書操作步驟進行。提取的RNA在核酸濃度測定儀(NanoDrop One，Thermo Fisher，美國)上測定各樣品濃度，然后根據cDNA反轉錄試劑盒(TaKaRa，RR047，日本)說明書取用1 μg進行反轉錄。使用Primer Premier 3.0引物設計軟件按照GenBank中雞的基因引物序列(表2)設計所需全部引物。相對熒光定量PCR(RT-qPCR)反應體系由10倍稀釋的cDNA 2 μL，SYBR Green 2×Mix 10 μL，濃度為100 nmol/L的上游引物工作液各1 μL和ddH2O 6 μL組成，總體積為20 μL。體系反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，退火溫度條件下退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性至延伸步驟重復進行40個循環(huán)。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.6.5 腸道菌群

使用糞便基因組DNA提取試劑盒(D3146-02，Magen公司，美國)提取盲腸內容物細菌總DNA，核酸濃度測定儀(ND-1000，NanoDrop公司，美國)測定DNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。用帶Barcode的特異引物341F(5’-CCTACGGGRBGCASCAG-3’)和806 R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)對細菌16S rDNA V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，2%瓊脂肪凝膠電泳檢測擴增產物，AxyprepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司，美國)切膠回收PCR產物，純化后的PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司，美國)進行定量檢測，Illumina PE250文庫構建和測序，本試驗測序由上海凌恩生物科技有限公司完成。

測序得到的PE reads根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，應用Uparse v7.0.1001軟件將有效數據以97%的同源性聚類成操作分類單元(OTUs)，將OTUs序列和Silva 32數據庫比對并用Mothur方法進行物種注釋分析，獲得分類學信息并在屬水平分析各組盲腸微生物菌群結構。

1.7 數據統(tǒng)計分析

試驗數據采用SAS 9.5軟件中的GLM程序進行單因素方差分析，當處理效應差異顯著時進行Duncan氏多重比較，P<0.05為差異顯著性判斷標準，試驗結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示。

2 結 果

2.1 五倍子提取物對1～42日齡黃羽肉雞生長性能的影響

由表3可知，肉雞各階段生長性能已達到該品種正常水平。1～21日齡，與對照組相比，抗生素組、五倍子1組和五倍子2組21日齡體重、平均日增重、平均日采食量、料重比和死亡率均無顯著差異(P>0.05)。22～42日齡，與對照組相比，抗生素組42日齡體重和平均日增重分別顯著升高8.23%和10.67%(P<0.05)，五倍子2組42日齡體重和平均日增重分別升高3.93%和3.52%(P>0.05)。1～42日齡，與對照組相比，抗生素組平均日增重顯著升高8.51%(P<0.05)，五倍子2組平均日增重升高4.05%(P>0.05)。

表3 五倍子提取物對1～42日齡黃羽肉雞生長性能的影響

2.2 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

由表4可知，與對照組相比，抗生素組、五倍子1組和五倍子2組空腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度值均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，五倍子2組回腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度值均顯著升高(P<0.05)；且五倍子2組絨毛高度/隱窩深度值顯著高于抗生素組(P<0.05)。

表4 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道形態(tài)的影響

2.3 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道免疫功能的影響

由表5可知，與對照組相比，五倍子1組和五倍子2組空腸sIgA含量均顯著升高(P<0.05)；且五倍子2組空腸sIgA含量顯著高于抗生素組(P<0.05)。與對照組相比，五倍子1組和五倍子2組空腸IL-8含量均顯著降低(P<0.05)，抗生素組、五倍子1組和五倍子2組空腸TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)；且五倍子2組空腸TNF-α含量顯著低于抗生素組(P<0.05)。與對照組相比，抗生素組、五倍子1組和五倍子2組空腸IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)。各組之間回腸sIgA、IL-1β、IL-8、TNF-α和IFN-γ含量均無顯著差異(P>0.05)。

表5 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道免疫功能的影響

2.4 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道抗氧化能力的影響

由表6可知，各組之間空腸MDA含量、T-AOC及T-SOD和GSH-Px活性均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，抗生素組、五倍子1組和五倍子2組回腸MDA含量顯著降低(P<0.05)，回腸T-SOD活性顯著升高(P<0.05)。各組之間回腸T-AOC和GSH-Px活性均無顯著差異(P>0.05)。

表6 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道抗氧化能力的影響

2.5 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道緊密連接和抗氧化相關基因表達的影響

由表7可知，各組之間空腸閉合小環(huán)蛋白-1(ZO-1)、閉合蛋白1(Claudin1)和核因子E2相關因子2(Nrf2)mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，五倍子2組回腸ZO-1和Nrf2 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)；且五倍子2組回腸ZO-1和Nrf2 mRNA相對表達量顯著高于抗生素組(P<0.05)。

表7 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道緊密連接和抗氧化相關基因表達的影響

2.6 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道菌群的影響

本試驗共對48個肉雞盲腸食糜樣品以97%的序列相似性經16S rRNA進行了測序，共得到2 179 510個有效序列，平均每個樣品有45 406個序列，聚類生成3 119個OTUs。表8為屬水平下相對豐度大于1%的盲腸微生物屬優(yōu)勢菌群，與對照組相比，抗生素組、五倍子1組和五倍子2組盲腸另枝菌屬(Alistipes)相對豐度顯著降低(P<0.05)，且五倍子2組盲腸Alistipes相對豐度顯著低于抗生素組(P<0.05)。與對照組相比，五倍子1組和五倍子2組盲腸芽孢桿菌屬(Bacillus)和毛螺菌屬(Lachnospira)相對豐度均顯著升高(P<0.05)，五倍子2組盲腸瘤胃球菌屬(Ruminococcus)相對豐度顯著升高(P<0.05)，五倍子1組和五倍子2組盲腸理研菌屬(Rikenella)相對豐度顯著降低(P<0.05)。

表8 盲腸微生物屬水平下的優(yōu)勢菌群相對豐度

3 討 論

3.1 五倍子提取物對1～42日齡黃羽肉雞生長性能的影響

酚類化合物和酸化劑已被證明在提高肉雞生長性能方面具有顯著的效果[11-12]。Samuel等[13]研究表明，飼糧添加25～150 mg/kg沒食子酸(純度≥90%)對1～42日齡愛拔益加(AA)肉雞1～21日齡、22～42日齡以及1～42日齡平均日增重和平均日采食量均無顯著影響，但飼糧添加75～100 mg/kg沒食子酸可降低1～21日齡、22～42日齡以及1～42日齡料重比，提高飼料利用效率。Ma?ek等[14]研究表明，飼糧添加5 g/kg沒食子酸(購自Sigma-Aldrich公司，產品信息不明)對1～35日齡羅斯308肉雞體重和平均日增重均無顯著影響，但可降低料重比。本試驗結果顯示，雖然飼糧添加250和500 mg/kg五倍子提取物對黃羽肉雞1～21日齡、22～42日齡以及1～42日齡平均日采食量和料重比均無顯著影響，但飼糧添加500 mg/kg五倍子提取物有提高22～42日齡以及1～42日齡平均日增重的趨勢。這說明五倍子提取物在提高1～42日齡黃羽肉雞生長性能方面具有一定的開發(fā)潛力，不同研究結果可能與產提取工藝和純度不同有關。

3.2 五倍子提取物對42日齡黃羽肉雞腸道形態(tài)和屏障功能的影響

空腸和回腸是養(yǎng)分吸收的主要區(qū)域，其絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度/隱窩深度值可用來作為間接衡量飼料轉化效率的指標[15]。絨毛高度增加、隱窩深度降低、絨毛高度/隱窩深度值增加說明腸道可更好地吸收營養(yǎng)物質[16]。本試驗結果顯示，飼糧添加500 mg/kg五倍子提取物可顯著增加回腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值，且絨毛高度/隱窩深度值顯著高于抗生素組。Samuel等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加50～100 mg/kg沒食子酸提高了1～42日齡AA肉雞空腸絨毛高度/隱窩深度值，飼糧添加25～150 mg/kg沒食子酸對空腸絨毛高度無顯著影響，與本試驗結果一致。外周胞漿蛋白ZO-1和Claudin1參與家禽腸道緊密連接的形成，在腸道機械屏障中發(fā)揮著關鍵的作用[17]。研究表明，酚酸類化合物的添加可顯著上調腸道緊密連接相關基因ZO-1和Claudin1的mRNA相對表達量，從而改善屏障功能[18-19]。本研究結果顯示，飼糧添加500 mg/kg五倍子提取物可顯著上調回腸ZO-1 mRNA相對表達量，且顯著高于抗生素組。以上結果說明，飼糧添加500 mg/kg五倍子提取物可改善42日齡黃羽肉雞腸道形態(tài)和屏障功能。

3.3 五倍子提取物對42日齡肉雞免疫功能的影響

沒食子酸對免疫功能的調節(jié)主要體現(xiàn)在抗炎方面，Tanaka等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸不僅可抑制脂肪細胞和巨噬細胞相互作用引起的脂肪細胞肥大和炎癥反應，還可抑制肝細胞和巨噬相互作用引起的肝脂質積聚、細胞凋亡和炎癥反應。Zhu等[22]研究表明，沒食子酸可通過抑制核因子-κB(NF-κB)信號通路在潰瘍性結腸炎中發(fā)揮抗炎作用。腸道sIgA含量以及促炎和抗炎等細胞因子含量可在一定程度上反映機體免疫功能高低，sIgA和IFN-γ含量升高，IL-1β、IL-8和TNF-α等促炎因子含量降低，說明機體免疫功能增強[23-24]。本研究結果顯示，飼糧添加250和500 mg/kg五倍子提取物可顯著提高空腸sIgA和IFN-γ含量，同時顯著降低空腸IL-1β和IL-8含量。此結果與黃麗華等[25]應用沒食子酸降低脂多糖(LPS)應激巨噬細胞胞內IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子含量的結果相似。這說明飼糧添加250和500 mg/kg五倍子提取物可通過提高免疫球蛋白含量和降促低炎癥細胞因子含量提高42日齡黃羽肉雞免疫功能。

3.4 五倍子提取物對42日齡肉雞抗氧化能力的影響

沒食子酸因分子結構中具有芳香環(huán)和羥基，可有效地通過提高電子轉移效率下調活性氧代謝，同時酚羥基與自由基發(fā)生抽氫反應達到抗氧化的作用[26]。血液和腸道MDA含量、T-AOC以及T-SOD、GSH-Px活性是用來衡量機體抗氧化能力強弱的常用指標。Samuel等[13]研究表明，飼糧添加100 mg/kg沒食子酸可顯著降低42日齡AA肉雞血漿中MDA含量。本研究結果顯示，飼糧添加250和500 mg/kg五倍子提取物可顯著降低42日齡肉雞回腸MDA含量，此結果與前人研究結果一致。本研究結果還顯示，飼糧添加250和500 mg/kg五倍子提取物可顯著提高回腸T-SOD活性，此結果與Pazhanivel等[27]使用酚類化合物姜黃素在提高肉雞血清中T-SOD活性的結果相似。這說明沒食子酸的添加可通過降低脂質過氧化物含量和提高抗氧化酶活性達到提高42日齡黃羽肉雞抗氧化能力的目的。Nrf2是機體中重要的內源性保護分子，是抗氧化應激最重要的轉錄因子之一。姜春暉等[28]研究表明，酚類化合物姜黃素可通過增加奶牛乳腺上皮細胞Nrf2的表達，激活下游抗氧化分子的轉錄而緩解過氧化氫(H2O2)誘導的氧化應激。本研究結果顯示，飼糧添加500 mg/kg五倍子提取物可顯著上調回腸Nrf2 mRNA相對表達量，說明沒食子酸可通過激活Nrf2信號通路提高肉雞抗氧化能力，具體信號通路相關分子的研究將在后續(xù)試驗驗證。

3.5 五倍子提取物對42日齡肉雞腸道菌群的影響

腸道微生物可參與宿主體內碳水化合物和脂肪等營養(yǎng)素的吸收和代謝、不可消化膳食纖維的發(fā)酵、某些維生素的合成等生理過程，同時，腸道微生物還可通過與宿主胃腸道內壁相互作用而調節(jié)免疫功能[29-30]。因此，研究腸道微生物的組成和平衡對保持機體的健康至關重要。Alistipes是擬桿菌門細菌中的一種，其與腸道炎癥和膿腫相關[31]；Bacillus類細菌可產生抵抗不利環(huán)境條件的特殊芽孢[32]；Lachnospira是毛螺菌科細菌中的一種，可參與機體內碳水化合物的發(fā)酵，為機體提供能量[33]；Ruminococcus是降解纖維素的優(yōu)勢菌屬，可降解纖維素為機體提供能量[34]；腸道內Rikenella類細菌的升高可能與抑郁密切相關[35]。本研究結果顯示，飼糧添加250和500 mg/kg五倍子提取物可顯著降低盲腸Alistipes和Rikenella相對豐度，顯著提高盲腸Bacillus和Lachnospira相對豐度，同時，飼糧添加500 mg/kg五倍子提取物可顯著提高盲腸Ruminococcus相對豐度。此結果與王一冰[36]應用300 mg/kg酚酸類化合物原兒茶酸降低52日齡黃羽肉雞盲腸內容物中有害微生物擬桿菌門和變形菌門相對豐度，同時升高有益微生物厚壁菌門相對豐度的研究結果相似。這說明沒食子酸可通過降低有害微生物和升高有益微生物水平改善腸道健康。

4 結 論

在本試驗條件下，飼糧添加500 mg/kg五倍子提取物可提高1～42日齡黃羽肉雞生長性能、免疫功能和抗氧化能力，同時改善腸道形態(tài)結構、屏障功能和微生物菌群結構，可作為肉雞抗生素的潛在替代品。