胡曉舒，溫一陽，楊金花

0 引言

結(jié)直腸癌是指從齒狀線至直腸乙狀結(jié)腸交界處之間的癌，是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和致死率僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤，成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一[1]。結(jié)直腸癌發(fā)病機制較為復(fù)雜，是遺傳因素和外界環(huán)境共同作用的結(jié)果。探討其發(fā)病機制對于結(jié)直腸癌的診治具有重要價值。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長度大于200 nt、不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，其在表觀遺傳、細(xì)胞周期和細(xì)胞分化調(diào)控等生命活動中發(fā)揮重要作用[2]。PTENP1屬于LncRNAs的一種，與PTEN高度同源，能與PTEN靶標(biāo)miRNA特異性結(jié)合，進而調(diào)節(jié)PTEN蛋白的表達[3]。PTENP1在乳腺癌、腎癌、前列腺癌和肝癌等多種腫瘤組織中異常表達，并與患者臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān)[4-7]。然而，有關(guān)PTENP1在結(jié)直腸癌中的表達和功能，目前報道尚少。本研究探討了PTENP1在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中的表達及其生物學(xué)功能，旨在探討其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的可能機制，為結(jié)直腸癌的分子診斷提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月—2019年3月在鄭州人民醫(yī)院手術(shù)切除的107例結(jié)直腸癌及對應(yīng)的癌旁組織作為研究對象，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)確診。其中男70例，女37例；年齡39～79歲，平均年齡（60.25±9.38）歲；其中結(jié)腸癌69例，直腸癌38例；所有患者均為初治，臨床資料完整。排除良性結(jié)直腸腫瘤患者和嚴(yán)重免疫缺陷疾病患者。癌旁組織經(jīng)病理檢測未出現(xiàn)病理學(xué)改變。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會許可和監(jiān)督，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗材料

HT29結(jié)腸癌細(xì)胞系購自美國ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、青鏈霉素和胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購自南京維森特生物有限公司；CCK8試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司；PTENP1和空載體慢病毒由山東維真生物有限公司構(gòu)建及包裝；PTEN兔多克隆抗體購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自北京Promega公司；miR-21 mimic和對照mimic購自上海吉瑪生物有限公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自北京中山金橋生物有限公司。熒光定量PCR引物由上海生工生物合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建

HT29結(jié)腸癌細(xì)胞系置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入PTENP1和空載體慢病毒，感染12 h，更換含有2 μg/ml嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，存活細(xì)胞即為PTENP1過表達細(xì)胞系和空載體細(xì)胞系，實驗分為兩組：PTENP1組（PTENP1過表達細(xì)胞系）和對照組（空載體細(xì)胞系）。此外，生物信息學(xué)研究顯示PTENP1 3’UTR與miR-21存在堿基配對。為了尋找PTENP1的下游靶基因，分別將野生型PTENP1（PTENP1-WT）、miR-21結(jié)合區(qū)域的突變體PTENP1（PTENP1-Mut）載體轉(zhuǎn)染至mimics對照和miR-21 mimics過表達的細(xì)胞中，以檢測熒光素酶活性。

1.4 熒光定量PCR

收集癌旁組織、結(jié)腸癌組織、對照組和PTENP1組細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，分光光度計測定總RNA濃度，并將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)熒光定量PCR分析。為了計算PTENP1的相對表達水平，根據(jù)PTENP1和miR-21的序列信息，設(shè)計熒光定量PCR引物，其中U6為內(nèi)參，見表1。制備以下反應(yīng)體系：SYBR Green PCR mix 10 μl，上游引物0.6 μl，下游引物 0.6 μl，cDNA模板8.8 μl，總體積20 μl。按照下列條件進行PCR：95℃ 5 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。相對mRNA表達水平采用2-ΔΔCT法表示。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers for fluorescence quantitative PCR

1.5 CCK8實驗

待對照組和PTENP1組細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，胰酶消化后將密度調(diào)整為每毫升1×105個細(xì)胞，96孔板每孔接種100 μl，每組設(shè)置3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時，加入10 μl CCK8溶液，37℃培養(yǎng)2 h，然后采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定細(xì)胞吸光度值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析

對照組和PTENP1組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化，每毫升1×106個細(xì)胞密度收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌一次，細(xì)胞重懸于400 μl Annexin V-FITC結(jié)合液中，并加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育30 min，PBS洗滌未結(jié)合的Annexin V-FITC，重懸于結(jié)合緩沖液，加5 μl碘化丙錠染色液，冰上孵育5 min，采用流式細(xì)胞術(shù)分析兩組細(xì)胞凋亡比例。實驗重復(fù)3次。

1.7 雙熒光素酶報告基因分析

為了進一步確定PTENP1與miR-21是否存在堿基互補關(guān)系，分別將構(gòu)建好的PTENP1-WT、PTENP1-Mut載體轉(zhuǎn)染至mimics對照和miR-21 mimics過表達的細(xì)胞中，48 h后，采用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測

對照組和PTENP1組細(xì)胞收集后，采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白并變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PTEN兔多克隆抗體和Tubulin抗體濃度采用1:300，其中Tubulin為內(nèi)參對照，羊抗兔二抗的濃度為1:5 000，5%脫脂牛奶封閉后進行電化學(xué)發(fā)光自顯影，通過生物圖像處理軟件計算蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織和細(xì)胞系PTENP1表達水平分析

與癌旁組織比較，結(jié)腸癌組織中PTENP1表達水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.01）。與對照組細(xì)胞比較，PTENP1組細(xì)胞PTENP1的表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），表明轉(zhuǎn)染成功，見圖1。

2.2 PTENP1對細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對照組24、48和72 h細(xì)胞吸光度值比較，PTENP1組24、48和72 h吸光度值顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004），見圖2A。與對照組（5.01±1.25）%比較，PTENP1組凋亡細(xì)胞比率（34.12±5.79）%顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.009），見圖2B。

2.3 PTENP1靶基因分析

生物信息學(xué)結(jié)果顯示：PTENP1與miR-21存在堿基互補，見圖3。雙熒光素酶報告基因顯示，野生型PTENP1（PTENP1-WT）轉(zhuǎn)染至miR-21 mimics過表達的細(xì)胞后熒光素酶活性（0.44±0.04）明顯低于轉(zhuǎn)染mimics過表達的細(xì)胞（1.00±0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。而PTENP1（PTENP1-Mut）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至mimics對照（1.02±0.11）和miR-21 mimics過表達的細(xì)胞后熒光素酶活性（0.98±0.09）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.571）。與對照組細(xì)胞miR-21表達水平（0.61±0.06）比較，PTENP1組細(xì)胞miR-21表達水平（0.21±0.04）顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。

2.4 PTENP1對靶蛋白的影響

PTEN是miR-21的靶基因，Western blot分析顯示，與對照組比較，PTENP1組細(xì)胞PTEN蛋白表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.04），見圖4。

3 討論

非編碼RNA是一類不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括長鏈非編碼RNA（LncRNA）和微小RNA（microRNA）等，起初被認(rèn)為是“垃圾RNA”[8]。但是，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化、基因表達調(diào)控等諸多方面發(fā)揮著重要作用。LncRNA作為一種非編碼RNA，以癌基因和抑癌基因角色在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸多LncRNA在腫瘤組織中異常表達，并與臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān)[9-10]。PTENP1是LncRNA家族成員之一，研究顯示其在膀胱癌、乳腺癌和胃癌中起著抑癌基因的作用，其表達紊亂與腫瘤的增殖、侵襲和凋亡密切相關(guān)[11-13]。本研究采用熒光定量PCR分析了癌旁組織和結(jié)腸癌組織中PTENP1表達水平，研究結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中PTENP1表達水平較癌旁組織顯著下降，說明PTENP1在結(jié)直腸癌中異常表達，可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

LncRNA PTENP1被認(rèn)為是腫瘤抑制因子PTEN的假基因[14]，而PTEN編碼一種具有蛋白酪氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞質(zhì)蛋白，并且PTEN在保持染色體完整性和細(xì)胞周期進程中發(fā)揮著重要作用[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的假基因PTENP1可以作為競爭的內(nèi)源RNA，通過競爭性結(jié)合祖先基因共享的miRNA而調(diào)節(jié)PTEN的表達[16]。然而，PTENP1如何調(diào)控PTEN的表達，其作用機制尚不清楚。為了分析PTENP1對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究在結(jié)腸癌細(xì)胞系中建立了PTENP1過表達穩(wěn)定細(xì)胞系，采用CCK8和流式細(xì)胞術(shù)分析了PTENP1對細(xì)胞增殖和凋亡的影響。研究結(jié)果顯示，PTENP1過表達顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，促進結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，說明PTENP1可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在結(jié)直腸癌中起著抑癌基因的作用。這一研究結(jié)果與PTENP1在其他腫瘤中的作用一致。LncRNA對靶基因的調(diào)控主要通過與靶基因相互作用的miRNA競爭性結(jié)合進而發(fā)揮生物學(xué)功能。因此，本研究采用生物信息學(xué)和雙熒光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)PTENP1與miR-21存在堿基互補，PTENP1與miR-21競爭性結(jié)合后，影響miR-21靶基因的表達水平進而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。目前報道顯示miR-21與PTEN 3’非編碼區(qū)存在堿基互補，進而調(diào)控PTEN蛋白表達,PTEN是抑癌基因，其水平下調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞癌基因和抑癌基因平衡被打破，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17-19]。本研究證實，PTENP1過表達細(xì)胞中，miR-21表達水平顯著下調(diào)，導(dǎo)致PTEN蛋白表達水平上調(diào)，進而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進腫瘤細(xì)胞凋亡。

總之，本研究結(jié)果證實，PTENP1在結(jié)腸癌組織中低表達，PTENP1通過miR-21/PTEN軸調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡，本研究為結(jié)直腸癌的早期診斷、開發(fā)新的治療手段奠定良好的實驗基礎(chǔ)。