夏啟勝，鄧婷婷*，徐雅平，劉虹麟，劉浩元

0 引言

白花檵木（Loropetalum chinensis（R.Br.）Oliv）是金縷梅科檵木屬的長青灌木植物，始載于《植物名實圖考》，因具有清熱解毒、通經(jīng)活絡等功效，很早以前就作為藥用植物在民間使用[1]。近年來對其化合物的分離和藥用活性成分鑒定發(fā)現(xiàn)，白花檵木含有揮發(fā)油、鞣質、黃酮、木脂素類等多種具有藥理活性的次生代謝物[2-3]。目前研究集中在治療創(chuàng)傷出血及促傷口愈合方面[4-5]。因白花檵木含有黃酮類化合物，推測其可能具有一定的抗腫瘤作用，但目前尚未見相關報道。本研究以白花檵木粗提物為研究對象、人肺腺癌細胞A549作為研究模型，探討白花檵木體外抑制肺腺癌細胞增殖的功效，為更好地開發(fā)利用白花檵木資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肺癌A549細胞株購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。

1.2 實驗試劑

白花檵木粗提物，為白花檵木葉子醇提物，棕色粉末，由北京白花檵木有限公司提供（批號20190516）。DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma公司。胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所。Annexin V-APC、PI流式細胞凋亡試劑盒購自美國Thermo公司。兔抗人Caspase-3抗體（貨號：19677-1-AP）、鼠抗人GAPDH抗體（貨號：HRP-60004）和兔抗人Bax抗體（貨號：50599-2-Ig）均購自中國Proteintech公司；兔抗人Bcl-2（貨號：CAS7511）購自美國Bioworld公司；兔抗人Fas抗體（貨號：ab133619）、山羊抗兔IgG二抗抗體（貨號：ab6721）和兔抗小鼠IgG二抗抗體（貨號：ab6728）均購自美國Abcam公司。0.22 μm PVDF膜（貨號：ISEQ00010）、DMSO（D2650）均購自德國Merck公司。

1.3 儀器

BD CantoⅡ流式細胞儀購自美國BD公司。Western blot電泳儀和ChemiDoc成像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 試劑配制 稱取0.5 g白花檵木粗提物溶于2 ml DMSO，配制濃度為0.25 g/ml的儲存液，經(jīng)0.22 μm膜過濾，得到250 mg/ml的無菌儲存液。

1.4.2 細胞培養(yǎng) A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞匯合至瓶底面積80%～90%時進行傳代。細胞傳代時，棄去培養(yǎng)基，D-Hanks洗細胞2次，0.1%胰蛋白酶-0.1%EDTA消化細胞。隨后加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，離心收集細胞。以新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞傳至3個新的培養(yǎng)瓶中，加入適量DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期的A549細胞，胰酶消化制備細胞懸液，隨后按2×104細胞/孔的濃度將細胞接種于96孔板，24 h后加入白花檵木粗提物進行后續(xù)處理。實驗共設6組：1.25、1、0.75、0.5、0.25 mg/ml白花檵木粗提物處理組和溶媒對照組（僅含5‰DMSO，不含白花檵木），及不含細胞僅有等體積DMSO完全培養(yǎng)基的空白對照組，以排除培養(yǎng)基干擾。實驗共設置3個檢測時間點：24、48和72 h，每組設置3個復孔。白花檵木粗提物處理24、48和72 h后，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標儀檢測450 nm波長下各孔的光密度（OD）值，計算細胞存活率。

1.4.4 集落形成實驗 取對數(shù)生長期的A549細胞，胰酶消化制備細胞懸液，隨后按2×102個/孔的密度將細胞接種于6孔板，待24 h細胞貼壁后，分別給予不同濃度的白花檵木粗提物并連續(xù)作用14天，白花檵木粗提物的濃度為0、10、20和40 μg/ml，其中0 μg/ml為對照組。每個濃度設置3個復孔，待培養(yǎng)結束后2.5%結晶紫染色，計算集落個數(shù)。

1.4.5 Annexin V-APC/PI法檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的A549細胞，按照2×105個/孔的密度將細胞接種于6孔板，接種24 h后加入白花檵木粗提物。實驗共設4組，白花檵木粗提物濃度分別為0、0.25、0.5和1 mg/ml，其中0 mg/ml為對照組。處理24 h后收集細胞，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，按照試劑盒說明書進行Annexin V-APC/PI染色，隨后上機檢測細胞凋亡情況。

1.4.6 Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達 用0、0.25、0.5和1 mg/ml白花檵木粗提物處理A549細胞24 h后提取細胞總蛋白，其中0 mg/ml為對照組。100℃加熱10 min，蛋白變性后，立即進行蛋白電泳、轉膜。轉膜結束后，PVDF膜以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，隨后分別加入Bax（1:1 000 稀釋）、Bcl-2 (1:1 000稀釋）、Fas（1:1 000稀釋）、活性Caspase3（1:1 000稀釋）、GAPDH（1:10 000稀釋）一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST洗4次，隨后加入HRP標記的二抗（1:20 000稀釋），室溫搖床上孵育2 h，TBST洗4次。根據(jù)ECL化學發(fā)光檢測試劑盒說明書配置發(fā)光液，以Bio-Rad成像儀進行條帶顯色。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白花檵木粗提物對A549肺癌細胞增殖的影響

CCK-8實驗結果顯示，白花檵木粗提物對A549細胞增殖具有抑制作用，作用24、48和72 h后的IC50值分別為1.12、0.48和0.36 mg/ml。隨著白花檵木粗提物濃度的增加，抑制效應逐漸增強，除0.25 mg/ml白花檵木粗提物組外，其余濃度24、48、72 h組與溶媒對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）。隨作用時間延長，抑制效應逐漸增強（P<0.001），見圖1。

2.2 白花檵木粗提物對A549肺癌細胞集落形成的影響

集落形成實驗結果顯示，經(jīng)過14天的集落培養(yǎng)，白花檵木粗提物呈濃度依賴性地抑制A549細胞的集落形成能力。40 μg/ml白花檵木粗提物處理組作用14天未見到任何集落形成，見圖2。

2.3 白花檵木粗提物對A549細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，不同濃度的白花檵木粗提物處理A549細胞24 h后細胞呈現(xiàn)不同程度的凋亡，用0.25、0.5和1 mg/ml的白花檵木粗提物處理后，早期凋亡細胞的比例分別為19.50%、38.90%和55.40%，晚期凋亡細胞的比例分別為2.07%、7.52%和18.50%，早、晚期凋亡率均隨藥物濃度依次遞增，見圖3。

2.4 白花檵木對A549細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響

Western blot結果顯示，不同濃度白花檵木粗提物處理A549細胞24 h后，與對照組（0 μg/ml）相比，各濃度處理組A549細胞中Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax、Fas及活性Caspase3蛋白表達水平升高，見圖4。提示白花檵木粗提物可能通過同時激活線粒體和死亡受體通路促進A549細胞的凋亡。

3 討論

天然產(chǎn)物是人類藥物研發(fā)的寶庫，很多植物來源的天然產(chǎn)物具有抗癌作用已有較多報道[6-7]，已有研究顯示白花檵木含有多種具有抗癌活性的物質，如：檞皮素、沒食子酸等[8]，提示白花檵木可能具有一定的抗癌作用。

本實驗對白花檵木粗提物的抗癌作用進行了初步研究，結果顯示白花檵木粗提物可以顯著抑制人A549肺癌細胞的增殖，并且呈現(xiàn)明顯的劑量和時間依賴性；同時，提示白花檵木粗提物能夠抑制A549細胞的集落形成能力，并且呈濃度依賴性，作用時間較短的時候抑制肺癌細胞生長需要的白花檵木粗提物濃度稍高一些，0.5 mg/ml的藥物作用48 h后，細胞生長率下降50%。但當藥物處理14天時，僅非常低的濃度，如40 μg/ml的濃度就可以完全抑制A549細胞集落形成。這些結果均證實白花檵木粗提物對人肺腺癌細胞增殖具有一定的抑制作用，并且作用時間越長，抑制效果越好。

為進一步了解白花檵木粗提物抑制肺腺癌A549細胞增殖的可能機制，我們進行了流式細胞凋亡檢測和凋亡相關蛋白免疫印跡檢測。細胞凋亡在分子水平受多種凋亡相關基因/基因產(chǎn)物調控。目前認為細胞凋亡主要有兩條調節(jié)途徑[9]：線粒體通路及細胞表面死亡受體通路。前者主要由促凋亡蛋白（如：Bax）和抗凋亡蛋白（如：Bcl-2）共同參與調控細胞程序性死亡。二者的比例決定細胞在收到凋亡信號時是否發(fā)生凋亡，也被作為評判腫瘤細胞對藥物敏感或耐受的指標。后者主要是Fas/FasL途徑。由這些細胞表面的蛋白質與攜帶凋亡信號的特異性配體結合，誘導細胞凋亡。半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase）家族在細胞凋亡的分子機制中發(fā)揮關鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點，尤其是其中的Caspase3[10-12]。通過流式細胞術檢測，我們發(fā)現(xiàn)白花檵木粗提物處理A549細胞24 h后細胞就開始出現(xiàn)不同程度的凋亡，且凋亡率呈劑量依賴性，說明白花檵木粗提物可能通過激活凋亡通路抑制肺腺癌細胞增殖，但還需要進一步的驗證，其機制也有待進一步研究。

在蛋白免疫印跡實驗中，我們進一步檢測了凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Fas、Caspase3及活性Caspase3在白花檵木粗提物作用A549細胞后的表達，結果發(fā)現(xiàn)，隨著白花檵木粗提物濃度的增加，促凋亡基因Bax表達上調，而凋亡抑制基因Bcl-2表達減弱，且Bax/Bcl-2的比例也逐漸增加。此外，F(xiàn)as、活性Caspase3的表達也隨白花檵木粗提物濃度的增加而上調。以上結果提示：白花檵木粗提物的抗癌機制可能與同時激活線粒體和死亡受體凋亡通路有關?？紤]到本實驗中用的是粗提物，產(chǎn)物中的成分相對較多，作用機制也比較復雜，激活線粒體通路和凋亡通路可能是由不同提取物成分引起的，但這一推測還需要進一步驗證。后續(xù)實驗中，還將進一步了解白花檵木粗提物中的關鍵有效成分，明確是哪些成分起到的抗癌作用，為新藥研發(fā)積累數(shù)據(jù)基礎。

總之，本研究首次報道了白花檵木粗提物在肺癌細胞中的體外抗癌作用，并對其抗癌作用的量效關系和作用機制進行了初步的研究，結果顯示白花檵木粗提物對于肺腺癌A549細胞的生長具有一定的抑制作用，其機制可能通過激活線粒體及死亡受體信號通路激活凋亡，抑制A549細胞增殖。提示白花檵木粗提物在肺癌的治療中有一定的應用前景，后續(xù)可以進一步進行體內實驗研究，明確該粗提物在小鼠體內的安全性和有效性。