張 臨，盧 芳，付恒峰，姜西迪，魏祺靈，漆彩麗，高海俠，李 琳

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

沙門菌(Salmonella)作為公共衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域重要的人獸共患病原菌之一，廣泛存在于自然界中，通過污染食物、水源等致人獸食物中毒和感染性腹瀉[1-2]。沙門菌是導(dǎo)致我國人獸食源性細(xì)菌中毒的首要致病菌[3]，目前已發(fā)現(xiàn)超過2 600種血清型[4]，每年可造成全球至少9 300萬人感染[5]。氟喹諾酮類(FQs)藥物因其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、交叉耐藥率低等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是防治沙門菌感染的首選抗菌藥物之一[6]。然而隨著臨床上濫用抗菌藥物以及耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，沙門菌多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，威脅到畜牧養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)和公共衛(wèi)生健康，因此研究沙門菌的耐藥機(jī)制，尋找抗菌藥物新靶點(diǎn)，成為亟待解決的問題。

雙組分系統(tǒng)(two component system，TCS)是細(xì)菌感應(yīng)、傳導(dǎo)外界信號(hào)，調(diào)節(jié)多種生命活動(dòng)的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)[7]。BaeSR由組氨酸蛋白激酶感受元件BaeS和應(yīng)答調(diào)控元件BaeR組成[8]，在環(huán)境壓力下，活化的BaeS導(dǎo)致BaeR磷酸化，從而激活靶基因轉(zhuǎn)錄，達(dá)到調(diào)控細(xì)菌耐藥性或毒力的目的。BaeSR是鼠傷寒沙門菌中重要的雙組分系統(tǒng)，最初在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)[9]，與細(xì)菌毒力、耐藥性密切相關(guān)。有研究表明，BaeSR可通過上調(diào)多重耐藥泵 AcrD和 MdtABC的表達(dá)量來調(diào)控沙門菌的多重耐藥[10]。BaeR通過降低大腸桿菌acrB缺失株外膜蛋白的表達(dá)水平來降低菌株對(duì)頭孢菌素的敏感性[11]。目前有很多關(guān)于BaeSR對(duì)細(xì)菌耐藥性調(diào)控機(jī)制的研究，然而BaeSR對(duì)鼠傷寒沙門菌耐藥性調(diào)控的分子機(jī)制尚未完全清楚，因此擬探索鼠傷寒沙門菌BaeSR對(duì)耐藥性的調(diào)控機(jī)制，尋找BaeR的潛在靶基因，豐富其調(diào)控通路。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌體外誘導(dǎo)環(huán)丙沙星耐藥株(CR)，并在CR基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了baeSR和acrB基因雙缺失株(CR△baeSR△acrB)、baeR過表達(dá)株(CRpbaeR△baeSR△acrB)及baeR回補(bǔ)株(CRcbaeR△baeSR△acrB)，通過菌株生物學(xué)特性測定以及對(duì)采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選與耐藥相關(guān)的差異表達(dá)基因的分析，發(fā)現(xiàn)BaeSR和AcrB外排泵影響耐藥基因的表達(dá)。因此，本研究對(duì) BaeR進(jìn)行表達(dá)、純化與驗(yàn)證，并結(jié)合LacZ報(bào)告基因融合試驗(yàn)及凝膠阻滯試驗(yàn)(EMSA)，旨在尋找BaeR的潛在靶基因，為深入闡明BaeSR對(duì)鼠傷寒沙門菌的耐藥調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠傷寒沙門菌體外誘導(dǎo)環(huán)丙沙星耐藥株CR由本實(shí)驗(yàn)室保存，baeSR和acrB基因雙缺失株(CR△baeSR△acrB)及baeR基因過表達(dá)株(CRpbaeR△baeSR△acrB)均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 主要試劑

LB肉湯培養(yǎng)基購自生工生物工程(上海)股份有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司，β-半乳糖甘酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司，山羊抗兔IgG H&L(HRP)購自英國Abcam公司。

1.3 BaeR蛋白的表達(dá)、純化與驗(yàn)證

1.3.1 BaeR蛋白的表達(dá) 根據(jù)NCBI公布的鼠傷寒沙門菌ATCC13311中baeR的基因組序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以CR為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化目的基因，用質(zhì)粒提取試劑盒提取pCold I質(zhì)粒。將純化后的baeR與pCold I載體進(jìn)行雙酶切(限制性核酸內(nèi)切酶為BamHⅠ和HindⅢ)、回收純化與連接，將連接產(chǎn)物命名為pCold I-baeR，并轉(zhuǎn)入E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，并送生工生物工程股份有限公司測序。

將轉(zhuǎn)化后的菌液按1∶100比例接種于LB(Amp50 μg·mL-1/氯霉素20 μg·mL-1/Tet5 ng·mL-1)培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)至OD600 nm=0.4～0.6。取部分菌液作為未誘導(dǎo)對(duì)照，另一部分菌液中加入終濃度為0.1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)劑，15 ℃ 180 r·min-1誘導(dǎo)24 h，離心收集沉淀，用PBS重懸后超聲破碎，離心，取超聲后的上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.3.2 BaeR蛋白的純化 取上述收集的蛋白與Ni-binding buffer按照1∶5混合后，上Ni-His resin柱進(jìn)行親和純化，收集洗脫的目的蛋白，用透析袋除去高濃度的咪唑和鹽，用PBS透析置換洗脫液，最后目的蛋白溶解于PBS中。

1.3.3 Western blot驗(yàn)證 將純化后的BaeR蛋白進(jìn)行BCA蛋白濃度測定后再進(jìn)行SDS-PAGE。將PAGE膠與PVDF膜根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參的分子量大小裁剪，并使大小一致。采用濕轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，將膜于300 mA恒流轉(zhuǎn)印35～40 min。完成后用0.5‰TBST沖洗，4 ℃封閉過夜。孵育一抗：使用封閉液將抗His標(biāo)簽抗體(Abcam，兔多抗)稀釋至1∶4 000，4 ℃靜止孵育過夜；用TBST 洗滌5次，置于水平搖床上劇烈洗滌3 min·次-1。孵育二抗：使用封閉液將HRP標(biāo)記二抗(山羊抗兔IgG抗體)稀釋至1∶8 000，常溫孵育1～2 h；洗滌條件同上。最后進(jìn)行顯色檢測。

1.4 LacZ報(bào)告基因融合試驗(yàn)

采用BPROM 程序預(yù)測sodB、tolC、spy、mdtD、ompW和marR基因的啟動(dòng)子區(qū)，設(shè)計(jì)引物(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max DNA polymerase 25 μL，上下游引物(各基因引物見表1)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL，共50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,62 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。將上述PCR產(chǎn)物與pACYC184-LacZ質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定、純化與連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC184-LacZ-spy、pACYC184-LacZ-ompW、pACYC184-LacZ-tolC、pACYC184-LacZ-marR、pACYC184-LacZ-mdtD和pACYC184-LacZ-sodB，用引物lacZ-BF/BR進(jìn)行PCR鑒定(方法同上)。將鑒定后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入CR△baeSR△acrB和CRpbaeR△baeSR△acrB中得到LacZ菌株，用引物lacZ-BF/BR進(jìn)行PCR鑒定(方法同上)后送至生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。將測序正確的LacZ菌株培養(yǎng)至OD600nm≈1后，離心收集菌體，超聲破碎，按照β-半乳糖苷酶試劑盒說明書操作，對(duì)各菌株進(jìn)行酶活性檢測。

表1 引物種類和序列

1.5 EMSA

根據(jù)LacZ報(bào)告基因融合試驗(yàn)中預(yù)測的ompW、mdtD、tolC、sodB、spy和marR的啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)探針，探針由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司合成，序列見表2。合成帶有生物素標(biāo)記的雙鏈探針并稀釋。配制6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，預(yù)電泳10 min。探針與純化蛋白進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，然后依次進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、紫外交聯(lián)與發(fā)光檢測。為了驗(yàn)證EMSA試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，同時(shí)進(jìn)行競爭性EMSA試驗(yàn)。

表2 各探針序列

2 結(jié) 果

2.1 BaeR蛋白的表達(dá)、純化及驗(yàn)證

2.1.1baeR基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到1條750 bp的條帶(圖1)，符合預(yù)期目的片段的大小。

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～4.baeR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.1.2 重組質(zhì)粒pCold I-baeR的檢測 對(duì)重組質(zhì)粒pCold I-baeR及其酶切產(chǎn)物進(jìn)行10 g·L-1瓊脂糖凝膠得到約750 bp(目的基因)和約4 200 bp(pCold I)的條帶，符合預(yù)期目的片段的大小(圖2)。重組質(zhì)粒測序結(jié)果正確，未出現(xiàn)缺失或突變。

M.DL12000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.重組質(zhì)粒pCold I-baeR; 2.pCold I-baeR經(jīng)BamH I和HindⅢ雙酶切

2.1.3 BaeR蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 取誘導(dǎo)前對(duì)照、誘導(dǎo)后全菌、誘導(dǎo)后上清和誘導(dǎo)后沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。誘導(dǎo)后全菌、誘導(dǎo)后上清和誘導(dǎo)后沉淀在28 ku處出現(xiàn)1條特異性條帶，且條帶大小和位置符合預(yù)期，誘導(dǎo)前對(duì)照未出現(xiàn)該條帶，說明BaeR蛋白成功表達(dá)，且在上清和沉淀中均有分布(圖3)。

2.1.4 BaeR蛋白的純化 取上清中的目的蛋白經(jīng)Ni-His resin柱親和層析，進(jìn)行SDS-PAGE分析，在28 ku處得到單一、清晰的蛋白條帶，表明成功獲得純化后BaeR蛋白(圖4)。

2.1.5 BaeR蛋白的Western blot驗(yàn)證 表達(dá)的重組蛋白分別用兔多抗和山羊抗兔IgG抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，在28 ku處出現(xiàn)目的條帶(圖5)。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.純化前上清; 2.純化后BaeR; 3.未誘導(dǎo)對(duì)照

2.2 LacZ報(bào)告基因融合試驗(yàn)

2.2.1 啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增 根據(jù)鼠傷寒沙門菌ATCC13311的基因組序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增ompW、sodB、tolC、mdtD、marR和spy基因的啟動(dòng)子區(qū)，擴(kuò)增片段大小分別約為410、360、370、480、440、390 bp(圖6)。

M.DL500 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.ompW; 2.sodB; 3.tolC; 4.mdtD; 5.marR; 6.spy

2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 將純化后的基因分別與pACYC184-LacZ質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC184-LacZ-spy、pACYC184-LacZ-ompW、pACYC184-LacZ-tolC、pACYC184-LacZ-marR、pACYC184-LacZ-mdtD和pACYC184-LacZ-sodB，用引物lacZ-BF/BR對(duì)各基因進(jìn)行PCR鑒定，片段分別約為790、810、770、840、880、760 bp(圖7)。

M.DL10000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.spy; 2.ompW; 3.tolC; 4.marR; 5.mdtD; 6.sodB

2.2.3 LacZ菌株的構(gòu)建及檢測 通過電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pACYC184-LacZ-spy、pACYC184-LacZ-tolC、pACYC184-LacZ-ompW、pACYC184-LacZ-marR、pACYC184-LacZ-sodB和pACYC184-LacZ-mdtD分別轉(zhuǎn)入CR △baeSR△acrB與CRpbaeR△baeSR△acrB感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建LacZ菌株，用引物lacZ-BF/BR進(jìn)行PCR鑒定，片段分別約為790、770、810、840、760、880 bp(圖8)，測序鑒定結(jié)果正確。

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1、2.spy; 3、4.tolC; 5、6.ompW; 7、8.marR; 9、10.sodB; 11、12.mdtD;1、3、5、7、9、11.CR△baeSR△acrB株; 2、4、6、8、10、12.CRpbaeR△baeSR△acrB株

2.2.4 β-半乳糖苷酶活性檢測 按照β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒說明書操作，檢測各菌株的β-半乳糖苷酶活性，由圖9可知，與雙缺失株CR△baeSR△acrB相比，過表達(dá)株CRpbaeR△baeSR△acrB的LacZ菌株的β-半乳糖苷酶活性極顯著升高(P<0.01)，表明baeR對(duì)spy、tolC、ompW、marR、sodB和mdtD具有正調(diào)控作用。

通過檢測各菌株的β-半乳糖苷酶活性評(píng)估baeR基因過表達(dá)對(duì) pACYC184-LacZ-spy、pACYC184-LacZ-tolC、pACYC184-LacZ-ompW、pACYC184-LacZ-marR、pACYC184-LacZ-sodB 和pACYC184-LacZ-mdtD的影響；**表示與CR△baeSR△acrB相比差異極顯著(P<0.01)

2.3 EMSA結(jié)果

2.3.1 BaeR蛋白可以調(diào)控marR基因的表達(dá) 為了尋找BaeR調(diào)控的靶基因，根據(jù)預(yù)測到的ompW、mdtD、tolC、sodB、spy和marR的啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)含有生物素標(biāo)記的探針，探明BaeR蛋白能否與生物素標(biāo)記探針的DNA片段結(jié)合。根據(jù)遷移快慢情況分析，BaeR蛋白與marR有明顯結(jié)合的遷移阻滯條帶，與ompW、mdtD、tolC、sodB和spy無明顯結(jié)合的遷移阻滯條帶(圖10)。結(jié)果表明：BaeR蛋白可以直接調(diào)控marR基因的表達(dá)，間接調(diào)控ompW、mdtD、tolC、sodB和spy的表達(dá)。

1.mdtD探針; 2.mdtD探針+BaeR蛋白; 3.ompW探針; 4.ompW探針+BaeR蛋白; 5.tolC探針; 6.tolC探針+BaeR蛋白; 7、14.對(duì)照; 8.marR探針; 9.marR探針+BaeR蛋白; 10.spy探針; 11.spy探針+BaeR蛋白; 12.sodB探針; 13.sodB探針+BaeR蛋白

2.3.2 競爭性EMSA 為了驗(yàn)證EMSA結(jié)果的可靠性以及蛋白與非競爭性探針的結(jié)合情況，將試驗(yàn)中可以與蛋白結(jié)合的探針marR，設(shè)計(jì)了不加生物素標(biāo)記的競爭性探針，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著非競爭性探針濃度的增加，結(jié)合的遷移阻滯條帶越明顯。當(dāng)競爭性探針為50倍時(shí)，僅僅競爭掉部分標(biāo)記探針，當(dāng)競爭性探針為100倍時(shí)，可以競爭掉全部的標(biāo)記探針(圖11)。

1.對(duì)照; 2.1 μmol·L-1 marR探針+BaeR蛋白; 3.2 μmol·L-1 marR探針+BaeR蛋白; 4.4 μmol·L-1 marR探針+BaeR蛋白; 5.8 μmol·L-1 marR探針+BaeR蛋白; 6.50倍競爭性探針+ marR標(biāo)記探針+BaeR蛋白; 7.100倍競爭性探針+ marR標(biāo)記探針+BaeR蛋白

3 討 論

沙門菌是常見的食源性致病菌之一[12]，通過多種途徑直接或間接感染人和動(dòng)物[13]，臨床常用FQs防治沙門菌病。近年來，由于FQs的不合理使用，臨床耐藥菌株快速增長，耐藥機(jī)制主要包括靶點(diǎn)突變、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、外排泵過表達(dá)、細(xì)胞膜通透性改變及生物膜的形成等，這些機(jī)制常協(xié)同發(fā)揮作用。在實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)，在鼠傷寒沙門菌中，BaeSR和AcrB外排泵與菌株對(duì)FQs的耐藥性密切相關(guān)且BaeR過表達(dá)后可通過調(diào)節(jié)外排泵、生物膜和鞭毛等相關(guān)基因的表達(dá)來影響細(xì)菌的耐藥性。為闡明鼠傷寒沙門菌的耐藥調(diào)控機(jī)制，本研究進(jìn)一步探索BaeR對(duì)潛在靶基因的調(diào)控作用。

自1969年首次分離到LacZ報(bào)告基因后，該基因被廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控的研究之中[14]。LacZ報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物是β-半乳糖苷酶，該酶存在于多種生物體內(nèi)，是由4條相同肽鏈構(gòu)成的四聚體，具有高生產(chǎn)率和低成本的優(yōu)點(diǎn)[15]，常用于啟動(dòng)子的篩選、驗(yàn)證或效能測定中[16]，它可將鄰硝基苯基-β-半乳糖苷(ONPG)水解為半乳糖和黃色的鄰硝基苯酚[17-18]，因?yàn)楹笳叩漠a(chǎn)生量與β-半乳糖苷酶的濃度成正比，所以可以通過黃色產(chǎn)生量間接確定LacZ表達(dá)水平。通過分光光度計(jì)(A420nm)的黃色出現(xiàn)率可以測量酶活性[19]。仇越等[20]研究發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌aphA缺失株的β-半乳糖苷酶活性顯著低于野生株，表明AphA可正向調(diào)控exsA和exsD的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。EMSA是體外檢測RNA與特定目標(biāo)蛋白結(jié)合的有效方法[21]，具有高靈敏度、高分辨率以及快速準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[22]。Yu等[23]通過EMSA證明BasR可以直接與emrD啟動(dòng)子結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，降低了大腸桿菌對(duì)多種抗菌劑的敏感性。此外，Yu等[24]還指出McbR可以結(jié)合到acrAB、acrD、acrR、emrD和mdtD的啟動(dòng)子區(qū)，直接激活這些外排泵基因的轉(zhuǎn)錄從而在細(xì)菌耐藥性調(diào)節(jié)中起重要作用。為了探究BaeSR在沙門菌耐藥性中發(fā)揮的作用，作者進(jìn)行BaeR蛋白的表達(dá)與純化，并應(yīng)用LacZ報(bào)告基因融合技術(shù)和EMSA去尋找BaeR調(diào)控的潛在靶基因。從轉(zhuǎn)錄組篩選到的耐藥相關(guān)基因中，選取外膜蛋白相關(guān)基因ompW、tolC，生物膜相關(guān)基因sodB、spy，外排泵相關(guān)基因mdtD和marR作為BaeR的潛在靶基因。研究發(fā)現(xiàn)在鼠傷寒沙門菌baeR過表達(dá)株中，ompW、sodB、tolC、mdtD、marR和spy的β-半乳糖苷酶活性明顯高于雙缺失株。這表明BaeR可以正向調(diào)控ompW、sodB、tolC、mdtD、marR和spy的表達(dá)。BaeR可以結(jié)合到marR的啟動(dòng)子區(qū)，直接調(diào)控其表達(dá)，不能或間接調(diào)控ompW、sodB、tolC、mdtD和spy的表達(dá)。

革蘭陰性菌存在一層阻礙外界有毒化學(xué)物質(zhì)滲入胞內(nèi)的外膜屏障，孔蛋白是與細(xì)菌滲透性和抗生素耐藥性調(diào)節(jié)息息相關(guān)的外膜蛋白。BaeR過表達(dá)使外膜通道tolC基因表達(dá)增加，這是MdtABC和AcrD多藥輸出系統(tǒng)功能所必需的[25]。阪崎腸桿菌ompW缺失株受硫酸新霉素的脅迫后，生物膜形成能力顯著增強(qiáng)[26]，提示外膜蛋白OmpW可能與氨基糖苷類抗生素耐藥性有關(guān)。sodB基因的缺失會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌的生物膜形成能力[27]。外排泵與細(xì)菌多重耐藥性密切相關(guān)，本試驗(yàn)篩選的外排泵相關(guān)基因主要有marR、mdtD與spy。mdtD屬于MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是MdtABCD-baeSR操縱子的一部分，受到baeR的調(diào)控[28]。Spy是一種小周質(zhì)蛋白，spy啟動(dòng)子上游具有BaeR結(jié)合位點(diǎn)，BaeR可以直接與spy的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合調(diào)控其表達(dá)。當(dāng)baeR基因缺失后，spy的表達(dá)量下降[29]。MarR是一種阻遏因子，屬于marRAB操縱子，與MarO結(jié)合后抑制自身及構(gòu)成操縱子的其它基因表達(dá)來阻礙marRAB操縱子的轉(zhuǎn)錄。MarA和MarR同屬marRAB操縱子，MarA是一種全局調(diào)控蛋白，胞內(nèi)水平受MarR調(diào)控，高水平的MarA可以與AcrAB基因上游的marbox結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也可與TolC附近特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)TolC的表達(dá)量，從而引起細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥[30-31]。沙門菌中，marR基因突變與FQs耐藥性及Mar表型相關(guān)[32]。在本試驗(yàn)中，BaeR可以直接與marR的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)，由此推測BaeR與marR結(jié)合后使marR與marO結(jié)合體解離，從而激活MarRAB轉(zhuǎn)錄，MarA表達(dá)量上升，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，這一發(fā)現(xiàn)為沙門菌耐藥調(diào)控機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，為藥物靶點(diǎn)的開發(fā)提供了思路。

4 結(jié) 論

成功表達(dá)BaeR蛋白，同時(shí)對(duì)LacZ報(bào)告基因融合試驗(yàn)及EMSA的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BaeR可正向調(diào)控ompW、mdtD、tolC、sodB、spy和marR的表達(dá)，并直接調(diào)控marR的表達(dá)，表明BaeSR可能通過調(diào)控這些靶基因的表達(dá)來影響鼠傷寒沙門菌對(duì)FQs的耐藥性，為深入闡明BaeSR對(duì)鼠傷寒沙門菌的耐藥調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。