羅躍軍，任永軍，白 鑫，陳 浩，蒲家艷，鄭若愚，肖 潔，楊光友*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130；2.四川省畜牧科學研究院，成都 610066；3.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066)

斯氏艾美耳球蟲(Eimeriastiedae)是危害家兔的優(yōu)勢蟲種之一，主要危害斷奶后至3月齡的幼兔，常引起嚴重的肝病變和功能障礙，甚至造成死亡，給養(yǎng)兔業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[1-4]。目前，兔球蟲病的防治主要依賴抗球蟲藥物，但球蟲耐藥性、藥物在兔產(chǎn)品中的殘留以及藥物的環(huán)境污染等問題日趨嚴重，因此迫切需要開展防控技術(shù)研究。

兔球蟲疫苗研究主要集中在活蟲苗，尤其是早熟弱毒苗上，已成功選育多種兔球蟲的早熟株，在此基礎(chǔ)上開展了多種早熟株混合免疫的研究[5-8]，但目前尚無商業(yè)化生產(chǎn)的兔球蟲疫苗。相比于活蟲苗，基因重組亞單位疫苗具有安全穩(wěn)定、易于大規(guī)模生產(chǎn)及成本相對較低等優(yōu)勢。球蟲生活史復雜，不同發(fā)育階段抗原構(gòu)成和分布不一致，其內(nèi)生發(fā)育早期比后期有性繁殖階段具有更強的免疫原性[9-12]。艾美耳球蟲表面抗原家族(surface antigens，SAGs)位于侵襲期蟲體表面，結(jié)構(gòu)特點明顯且家族龐大。在雞球蟲基因重組亞單位疫苗的研究中，原核表達的艾美耳球蟲SAGs能夠有效減輕腸道病變，降低體重損失，顯示出一定的免疫保護效果[13-15]。

本研究通過結(jié)合斯氏艾美耳球蟲表面抗原SAGs不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平和生物信息學分析，篩選出裂殖生殖階段特異性表達的SAGs，然后進行原核表達，并研究重組蛋白的免疫保護效果，為兔斯氏艾美耳球蟲基因重組亞單位疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與蟲株

4只2月齡及40只45日齡無球蟲新西蘭幼兔由四川農(nóng)業(yè)大學動物寄生蟲病研究中心繁殖提供。兔籠、食具等經(jīng)烘烤，飼料經(jīng)高溫干燥，飲水中加入抗球蟲藥。未添加抗球蟲藥的飼料委托某兔料廠專門生產(chǎn)提供，人工感染前3 d開始使用。

試驗所用蟲株為斯氏艾美耳球蟲四川分離株，由四川農(nóng)業(yè)大學動物寄生蟲病研究中心保存。

1.2 主要試劑與儀器

RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR預混液、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ 和EcoRⅠ)、T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；2×Taq PCR Master Mix、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pMD19-T Vector、質(zhì)粒小提試劑盒、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、BL21(DE3)感受態(tài)細胞均購自天根生化科技(北京)有限公司；HRP標記羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；原核表達載體pET32a(+)購自Invitrogen公司；Quil A(皂素)購自 Sigma 公司；引物合成和菌液測序由上海生工生物工程有限公司進行。

PCR儀：Mastercycler Gradient，eppendorf，美國；熒光定量PCR儀：LightCycler? 96，Roche，瑞士；中高壓層析系統(tǒng)：NGCTM10，Bio-Rad，美國；McMaster計數(shù)板，某日本株式會社。

1.3 主要生物信息學數(shù)據(jù)庫

NCBI(GenBank)數(shù)據(jù)庫：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；信號肽及跨膜區(qū)預測：http://www.cbs.dtu.dk/Services；GPI錨定位點預測：http://gpcr.biocomp.unibo.it/predgpi/；B細胞線性表位預測：http://tools.immuneepitope.org/bcell/。

1.4 斯氏艾美耳球蟲SAGs生物信息學分析及不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平分析

1.4.1 斯氏艾美耳球蟲SAGs生物信息學分析 利用BLAST檢測和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出斯氏艾美耳球蟲的SAG基因序列共計8條。利用生物信息學軟件對Es-SAGs氨基酸序列進行分析，用TMHMM-2.0預測是否含有跨膜區(qū)，SignalP預測是否含有信號肽，PredGPI預測是否含GPI錨定位點，IEDB預測B細胞抗原表位。

1.4.2 斯氏艾美耳球蟲四階段蟲體收集、總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 參考李祥瑞和汪志楷[16]的報道，以8×104個卵囊·只-1的劑量經(jīng)口感染2月齡無球蟲幼兔4只，分別于感染后10 d收集裂殖生殖階段蟲體，感染后13 d收集配子生殖階段蟲體，感染后28 d收集未孢子化卵囊，于液氮中保存。同時將收集的部分未孢子化卵囊孢子化培養(yǎng)，置于4 ℃保存。取適量各階段蟲體用RNA抽提試劑盒進行RNA抽提，產(chǎn)物保存于-80 ℃超低溫冰箱；取適量各階段蟲體總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物cDNA于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4.3 qRT-PCR引物設(shè)計和反應 根據(jù)Es-SAGs基因序列設(shè)計特異性qRT-PCR引物并參考GenBank中公布的Es-18S rRNA(HQ173837.1)基因序列結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的Es-β-Actin、Es-GAPDH的基因序列設(shè)計內(nèi)參基因的特異性qRT-PCR引物如表1所示。目的基因相對表達量采用 2-△△Ct方法計算[17]。

表1 qRT-PCR引物

1.5 Es-SAG13、Es-SAG14原核表達、純化和免疫印跡分析

1.5.1 rEs-SAG13和rEs-SAG14的表達與純化 結(jié)合熒光定量PCR的結(jié)果篩選出Es-SAG13、Es-SAG14，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計含限制性酶切位點的引物(SAG13上游5′-CGGGATCCATGAACGCGGCTCGAGCC-3′，BamHⅠ；下游5′-CGGGATCCATGAACGCGGCTCGAGCC-3′,EcoRⅠ；SAG14上游5′-CGGGATCCATGGGAGAGGAATCCGG-3′,BamHⅠ；下游5′-CGGAATTCCTAAAATCCGCCCTGGT-3′,EcoRⅠ)進行PCR擴增。將目的條帶與pMD19-T載體連接，以測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒為模板再次進行PCR擴增，產(chǎn)物和pET32a(+)質(zhì)粒共同雙酶切、T4連接后轉(zhuǎn)入表達感受態(tài)BL21(DE3)中，培養(yǎng)陽性菌至菌液OD590 nm至0.6后，加入1.0 mmol·L-1IPTG，37 ℃誘導表達8 h(110 r·min-1)；菌液7 000 r·min-1離心10 min后，于菌體沉淀中加入裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH=8.0)重懸菌體，反復凍融3次后超聲破碎。取上清和尿素溶解的沉淀進行SDS-PAGE判斷原核表達重組蛋白的可溶性。用鎳離子親和層析的方法純化重組蛋白，并將純化后的重組蛋白用PBS進行透析，SDS-PAGE分析效果。

1.5.2 rEs-SAG13和rEs-SAG14的反應原性分析 以1∶200稀釋的斯氏艾美耳球蟲陽性兔血清為一抗，1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，按常規(guī)方法進行免疫印跡分析。

1.6 斯氏艾美耳球蟲rEs-SAG13、rEs-SAG14免疫保護效果觀察

1.6.1 分組及免疫 40只45日齡的無肝球蟲幼兔分組和免疫程序見表2。

表2 試驗動物分組和免疫程序

1.6.2 評價指標 具體如下。

安全性觀察：初次免疫、二次免疫和攻蟲時稱量體重，免疫后觀察所有試驗兔的健康狀況。

感染后觀察各組精神狀態(tài)、飲食欲、腹圍、肝區(qū)敏感度、眼結(jié)膜色澤等；若出現(xiàn)死亡，記錄死亡時間并剖檢；每隔7 d記錄一次體重，于感染后第21天剖殺所有試驗兔，觀察肝病變并記分，測定肝指數(shù)、相對增重率、料肉比等。參考最新公布的動物球蟲病診斷技術(shù)國家標準(GB/T 18647—2020)，剖檢時收集適量直腸糞樣進行卵囊排出量的定量檢查，統(tǒng)計各組平均每克糞便卵囊數(shù)(oocyst per gram，OPG)，并計算卵囊減少率。

肝指數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；相對增重率=試驗組平均增重/對照組平均增重×100%；料肉比=(飼喂前飼料總量-剖殺后剩余飼料總量)/感染后增重總量；卵囊減少率=(攻蟲對照組OPG-免疫組OPG)/攻蟲對照組OPG×100%。

病變記分參考Peeters和Geeroms[18]提出的5分制：0分為無病變；1分表示表面有1～10個粟粒狀結(jié)節(jié)；2分表示表面有11～50個豆狀結(jié)節(jié)或部分融合為泡狀的大結(jié)節(jié)；3分表示表面有50～100個泡狀大結(jié)節(jié)；4分表示肝高度腫脹，表面有許多融合的泡狀大結(jié)節(jié)；5分表示表面泡狀結(jié)節(jié)融合為團塊狀。

1.6.3 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 22.0進行方差分析，對肝指數(shù)、平均增重、料肉比、肝病變記分進行組間差異的顯著性檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Es-SAGs的基因擴增、克隆測序和生物信息學分析及其在蟲體不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平分析

克隆測序得到的8條Es-SAGs序列，經(jīng)生物信息學分析發(fā)現(xiàn)：Es-SAGs均含有C端GPI錨定位點，均無跨膜區(qū)，且除SAG9和SAG12外均無信號肽；另抗原表位預測發(fā)現(xiàn)Es-SAGs均有較多B細胞線性表位(表3)。

表3 Es-SAGs生物信息學分析和表位預測

以E.stiedae未孢子化卵囊、孢子化卵囊、裂殖生殖階段蟲體和配子生殖階段蟲體的cDNA為模板，對8個Es-SAG基因進行qRT-PCR擴增，用Es-18S rRNA、Es-β-Actin、Es-GAPDH作為內(nèi)參基因進行綜合分析發(fā)現(xiàn)Es-SAG基因的轉(zhuǎn)錄水平在各個階段存在差異，其中Es-SAG13、Es-SAG14在裂殖生殖階段表達高于其他階段，且差異極其顯著(P<0.001)(圖1)。

W.未孢子化卵囊；B.孢子化卵囊；M.裂殖生殖階段蟲體；G.配子生殖階段蟲體；****.P<0.001

2.2 Es-SAG13、Es-SAG14的原核表達、純化和免疫印跡分析

用含限制性酶切位點的引物擴增出Es-SAG13、Es-SAG14(圖2)。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1.Es-SAG13；2.Es-SAG14

兩個重組蛋白在誘導劑IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1，37 ℃誘導表達8 h(110 r·min-1)的條件下成功表達(rEs-SAG13、rEs-SAG14大小分別在51和37 ku左右)，且大部分表達在上清，呈可溶性表達(圖3)。兩重組蛋白經(jīng)鎳離子親和層析后的純化效果良好，無明顯雜條帶(圖4A、B)。同時rEs-SAG13和rEs-SAG14均能識別斯氏艾美耳球蟲陽性兔血清(圖4C)，具有良好的免疫反應性。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1、2.rEs-SAG13上清；3.rEs-SAG13包涵體；4、5.rEs-SAG14上清；6.rEs-SAG14包涵體

A、B.rEs-SAG13、rEs-SAG14的純化效果；C.免疫印跡分析；M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.rEs-SAG13；2.rEs-SAG14

2.3 rEs-SAG13、rEs-SAG14的免疫保護效果

2.3.1 臨床癥狀 初次免疫、二次加強免疫后各組并未出現(xiàn)明顯不良反應，說明重組蛋白具有良好的安全性。在經(jīng)口感染1×104個·只-1孢子化卵囊后攻蟲對照組出現(xiàn)兔肝球蟲病典型癥狀：感染后前兩周癥狀不明顯，感染后第3周表現(xiàn)為食欲減退，精神沉郁，喜臥；消瘦，腹瀉偶有便秘；可視黏膜黃染，腹圍增大，肝區(qū)觸診敏感；而rEs-SAG13免疫組和rEs-SAG14免疫組兔肝球蟲病臨床癥狀不明顯，感染后第3周偶有食欲稍減退，可視黏膜輕度黃染，腹圍略有增大。經(jīng)口感染后各組均未出現(xiàn)死亡。

2.3.2 卵囊排出量 感染后21 d進行卵囊排出量的檢查，空白對照組的糞便樣本中未檢查到斯氏艾美耳球蟲卵囊；攻蟲對照組平均OPG達1.83×106，而rEs-SAG13免疫組和rEs-SAG14免疫組的平均OPG與攻蟲對照組相比均顯著減少，分別為3.15×105(P<0.01)和8.84×105(P<0.05)(表4)。rEs-SAG13免疫組和rEs-SAG14免疫組的卵囊減少率分別達82.8%和51.9%。

2.3.3 相對增重、料肉比和肝指數(shù) 初次免疫、二次免疫和攻蟲時各組體重無明顯差異。感染21 d后攻蟲對照組平均體重為2 461.2 g±450.0 g，與空白對照組平均體重2 642.5 g±182.0 g、rEs-SAG13免疫組平均體重2 488.5 g±168.0 g、rEs-SAG14免疫組平均體重2 401.2 g±411.0 g均無明顯差異(P>0.05)；但攻蟲對照組的平均增重顯著低于免疫組和空白對照組(P<0.05)，相對增重率僅為空白對照的39.08%，感染后14～21 d個別試驗兔體重出現(xiàn)負增長；rEs-SAG13免疫組平均增重與空白對照無顯著差異(P>0.05)，相對增重率達88.77%；rEs-SAG14免疫組平均增重與空白對照差異明顯(P<0.05)，相對增重率為67.48%(表4)。

攻蟲對照組自感染起到感染后21 d的料肉比達9.67∶1，而空白對照組料肉比為3.78∶1，rEs-SAG13免疫組料肉比為4.26∶1，rEs-SAG14免疫組料肉比為5.60∶1。各組肝指數(shù)均有明顯差異，攻蟲對照組的平均肝指數(shù)達6.66，而空白對照組平均肝指數(shù)為3.44，rEs-SAG13免疫組平均肝指數(shù)為4.52較攻蟲對照組差異顯著(P<0.05)，rEs-SAG14免疫組平均肝指數(shù)為5.27(表4)。

表4 免疫保護評價指標統(tǒng)計結(jié)果

2.3.4 解剖病變與病變記分 剖檢發(fā)現(xiàn)空白對照組肝無病變，而攻蟲對照組出現(xiàn)兔肝球蟲病典型病理變化：肝高度腫脹，充滿整個前腹部，表面布滿黃白色融合豆狀甚至融合的泡狀結(jié)節(jié)；膽囊擴張，膽汁瘀滯，大部分膽囊都充滿黃色滲出物，腹水明顯，膀胱積尿；rEs-SAG13免疫組病變較輕微，肝腫脹不明顯，有一定數(shù)量的粟粒狀或豆狀結(jié)節(jié)，有的有少許泡狀結(jié)節(jié)；rEs-SAG14免疫組肝明顯腫脹，肝表面有一定量的泡狀大結(jié)節(jié)，且組內(nèi)存在明顯差異(圖5)。

A.空白對照組；B.攻蟲對照組；C.rEs-SAG13免疫組；D.rEs-SAG14免疫組；1～10.試驗兔編號

對各組進行肝病變記分，攻蟲對照組平均病變記分為4.2，rEs-SAG13免疫組平均病變記分為2.7，較攻蟲對照組差異極顯著(P<0.05)，rEs-SAG14免疫組平均病變記分為3.7，與攻蟲對照組差異不顯著(P>0.05)(表4)。

3 討 論

兔球蟲病疫苗研究起步較晚，相對滯后。強毒苗是開發(fā)兔球蟲疫苗最初的嘗試，研究者用黃艾美耳球蟲活蟲苗加倍遞增劑量免疫無球蟲兔，取得了良好的免疫保護效果[18]。強毒苗由于其較高的致病風險和較復雜的免疫程序并未得到應用，相比之下，早熟弱毒苗因其低致病性、強免疫原性而備受期待。大型艾美耳球蟲[19-20]、中型艾美耳球蟲[6，21]、梨形艾美耳球蟲[22]、黃艾美耳球蟲[23]、腸艾美耳球蟲[7，24]等兔球蟲早熟株已成功選育，方素芳等[8]用不同劑量的大型艾美耳球蟲早熟株、腸艾美耳球蟲早熟株和中型艾美耳球蟲早熟株混合卵囊免疫家兔，用其相應親本株的混合卵囊進行攻蟲，發(fā)現(xiàn)免疫組接種后均未出現(xiàn)臨床癥狀，日增重與未免疫未攻蟲對照組相似，卵囊產(chǎn)量與未免疫攻蟲對照組相比有顯著差異，表明早熟弱毒苗具有很好的免疫保護效果。相比于活蟲苗，基因重組亞單位疫苗安全性更好，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。孟慶玲等[25-26]構(gòu)建了斯氏艾美耳球蟲微線蛋白5(MIC-5)和兔IL-15重組質(zhì)粒并在真核細胞中成功共表達，進而制備攜帶MIC-5的減毒鼠傷寒沙門菌活疫苗，接種該疫苗后幼兔無不良反應，相對增重率達84.4%，顯示出良好的安全性和一定的保護作用。

用斯氏艾美耳球蟲感染兔的膽汁抗原和糞便抗原免疫兔后均能引起兔卵囊排出減少，顯示出一定的保護作用；且這兩種可溶性抗原中的主要抗原分子均由裂殖生殖階段分泌[27-30]。頂復門原蟲的入侵是蟲體和宿主細胞相互作用的結(jié)果，通過糖基化磷脂酰肌醇錨定在侵襲期蟲體表面的SAGs能夠非特異性地黏附宿主細胞，啟動入侵，同樣SAGs也能直接接觸宿主的免疫系統(tǒng)，刺激宿主作出免疫應答[31-32]，因此，SAGs被認為是重要的保護性抗原候選。頂復門原蟲SAGs存在表達上的時序性，弓形蟲SAG1和SAG2是速殖子階段特異性抗原，SAG4是緩殖子階段特異性抗原，而SAG3在速殖子和緩殖子階段均存在[33-34]；在柔嫩艾美耳球蟲中，SAG1屬于子孢子特異性抗原，SAG16、SAG22和SAG23在子孢子和裂殖生殖階段均存在，其余的SAGs屬于裂殖生殖階段特異性抗原[35]。

雞柔嫩艾美耳球蟲SAG1[36]及巨型艾美耳球蟲EmSAG[14]的原核表達產(chǎn)物免疫雞后卵囊減少率分別達83.42%、75.93%，相對增重率分別達90.3%、86.3%。本試驗中作者發(fā)現(xiàn)Es-SAG13和Es-SAG14屬于斯氏艾美耳球蟲裂殖生殖階段特異性抗原，在免疫保護試驗中能大幅度減少卵囊排出量，rEs-SAG13免疫組和rEs-SAG14免疫組的卵囊減少率分別達82.8%和51.9%；另外免疫組均能不同程度減少增重損失，相對增重率分別為88.77%、67.48%。同時，攻蟲對照組的肝病理變化也十分典型，肝高度腫脹，表面充滿沿膽小管分布的黃白色結(jié)節(jié)；其中rEs-SAG13免疫能明顯減輕這種肝病理變化，其肝病變記分顯著低于攻蟲對照組(P<0.05)，與雞的巨型艾美耳球蟲EmSAG的原核表達產(chǎn)物免疫雞后顯著降低平均病變評分的結(jié)果相類似[14]。因此，免疫保護試驗結(jié)果初步表明rEs-SAG13可作為斯氏艾美耳球蟲基因重組亞單位疫苗的候選抗原。

4 結(jié) 論

對斯氏艾美耳球蟲的8個SAGs基因進行了克隆、鑒定以及轉(zhuǎn)錄水平分析，發(fā)現(xiàn)Es-SAG13和Es-SAG14基因在裂殖生殖階段表達高于其他階段，且差異極顯著(P<0.001)。免疫保護試驗結(jié)果顯示，rEs-SAG13及rEs-SAG14免疫兔后均能不同程度地減少增重損失和卵囊排出，減輕肝病變，其中，rEs-SAG13免疫保護效果更佳。表明rEs-SAG13可作為斯氏艾美耳球蟲基因重組亞單位疫苗的候選抗原。