劉 暢，劉 教，陳 進(jìn)，王勉之，熊文廣，曾振靈*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510624；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

噬菌體被稱為細(xì)菌病毒，必須寄生于特定的活菌體內(nèi)。其個(gè)體微小，僅由核酸和蛋白質(zhì)外殼構(gòu)成。噬菌體在自然界中分布廣泛，數(shù)量超過1031個(gè)[1]，分布于水體、土壤、人體及畜禽腸道等各種環(huán)境中[2]，有細(xì)菌的地方就有噬菌體的存在。相對(duì)于其他生態(tài)環(huán)境，水環(huán)境中的噬菌體的數(shù)量最多[3]。根據(jù)其繁殖特點(diǎn)，噬菌體可被分為裂解性噬菌體和溶原性噬菌體兩大類。

近年來，細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)峻，多重耐藥菌株檢出率逐年增加，甚至出現(xiàn)同時(shí)攜帶blaNDM-5及mcr-1這樣的“超級(jí)細(xì)菌”[4]，嚴(yán)重危害人類和畜禽健康，解決抗生素耐藥問題已變得刻不容緩。噬菌體作為一種天然“抗菌藥物”，其制劑的毒性低，特異性強(qiáng)和開發(fā)周期短等，被視為“后抗生素時(shí)代”很好的治療手段和生態(tài)環(huán)境凈化制劑[5]。用于“噬菌體治療”的是裂解性噬菌體，“噬菌體治療”概念的提出最早可以追溯到20世紀(jì)20年代，但因?yàn)榈诙问澜绱髴?zhàn)和抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移了人們對(duì)“噬菌體治療”的關(guān)注[6]，一定程度上制約了它的發(fā)展，直至近10年，噬菌體再次獲得了人們的關(guān)注[7]。目前,運(yùn)用噬菌體治療多重耐藥細(xì)菌感染病患已取得了令人振奮的成果[8-9]，這些成果不僅證實(shí)了噬菌體治療的可行性，也暗示著噬菌體在獸醫(yī)生產(chǎn)臨床上也具有極大的應(yīng)用潛力。

廣東家禽養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，抗菌藥物的不合理使用，使得多重耐藥菌株不斷檢出[10]，也給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，嚴(yán)重挑戰(zhàn)了獸醫(yī)臨床上對(duì)抗大腸桿菌的有效藥物的選擇。為了解決上述問題，本研究提出利用禽源多重耐藥大腸桿菌為宿主菌，以從養(yǎng)殖場(chǎng)池塘水中采集樣品為研究對(duì)象，試圖分離出可裂解攜帶blaNDM-5及mcr-1耐藥基因大腸桿菌的噬菌體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，解析其全基因組序列，旨在為養(yǎng)殖場(chǎng)中blaNDM-5及mcr-1陽性大腸桿菌的防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

菌株：宿主菌為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理研究室分離并保存的禽源多重耐藥大腸桿菌GZB8C146-1M，菌株詳細(xì)信息如表1所示。

表1 GZB8C146-1M菌株信息

池塘水樣品來源：廣東肇慶某家禽養(yǎng)殖場(chǎng)所采集的池塘水。

1.2 主要試劑

麥康凱瓊脂和LB肉湯等均購于廣州環(huán)凱微生物有限公司。

SM緩沖液：稱取NaCl 4.68 g，MgSO41.58 g，Tris 4.85 g，明膠0.016 g，加入去離子水充分溶解，調(diào)節(jié)pH至7.5，定容至800 mL，高壓滅菌后使用。

噬菌體DNA提取試劑盒購于Omega公司。

1.3 樣品的處理

將采集回來的鴨場(chǎng)污水離心除去大顆粒雜質(zhì)，依次使用5.00、1.20、0.45、0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，通過Millipore Pellicon XL超濾膜將濾液濃縮為50 mL的液體，即為噬菌體母液，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 噬菌體的分離與純化

分別取100 μL噬菌體母液和100 μL對(duì)數(shù)期菌懸液加入至2 mL LB肉湯中，37 ℃、160 r·min-1搖床中培養(yǎng)4 h，6 000×g離心5 min，0.22 μm 濾膜除菌后再加入100 μL菌懸液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心過膜除菌，如此重復(fù)3次，得到富集液。將富集液用SM緩沖液倍比稀釋一定倍數(shù)后，加入等體積的菌懸液，靜置培養(yǎng)30 min后制作雙層平板，37 ℃培養(yǎng)6～8 h，若瓊脂平板上顯現(xiàn)出噬菌斑，挑取單個(gè)透亮圓潤的噬菌斑，加入1 mL SM緩沖液中，渦旋混勻后過膜除菌，制作雙層平板進(jìn)行純化，此步驟約重復(fù)3次，直至得到大小均一的噬菌斑。

1.5 噬菌體的透射電鏡觀察

將封口膜平鋪在玻璃片上，用鑷子把銅網(wǎng)夾至封口膜上，使用移液槍取10 μL噬菌體富集液滴在銅網(wǎng)上，靜置10 min后，用濾紙吸去多余液體后，取10 μL 2%磷鎢酸滴在銅網(wǎng)上，靜置1～3 min后，用濾紙吸去多余液體。室溫放置干燥后，放置透射電鏡(型號(hào)：日本電子JEOL JEM-1200EX)觀察，并進(jìn)行拍照記錄。

1.6 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)(OMOI)測(cè)定

大腸桿菌菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600nm=0.3～0.4)，噬菌體液富集3次備用，完成細(xì)菌和噬菌體計(jì)數(shù)后，在2 mL離心管中分別加入100 μL稀釋后的菌懸液，按照噬菌體∶細(xì)菌(P∶B)=10∶1、1∶1、10-1∶1、10-2∶1、10-3∶1、10-4∶1的數(shù)量比例加入倍比稀釋后噬菌體(每個(gè)比例作3個(gè)重復(fù))。在37 ℃、160 r·min-1搖床中培養(yǎng)4 h后，進(jìn)行噬菌體的效價(jià)測(cè)試，滴度最高的組對(duì)應(yīng)的MOI，即為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.7 噬菌體的一步生長曲線的測(cè)定

在2 mL離心管中加入1 mL的細(xì)菌菌懸液，按照P∶B=10的比例，加入富集后的噬菌體液，37 ℃靜置15 min，10 000 ×g離心30 s棄去上清液后，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基迅速吹打菌體沉淀，離心棄上清，重復(fù)洗滌2次，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基并吹打沉淀，轉(zhuǎn)移混合液至LB肉湯試管中(總體積5 mL)，放置37 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)，每間隔10 min取200 μL培養(yǎng)液，離心過膜處理后，測(cè)定培養(yǎng)液中噬菌體的效價(jià)，一共持續(xù)取樣測(cè)定90 min，本試驗(yàn)設(shè)置3組平行。根據(jù)爆發(fā)量計(jì)算公式：爆發(fā)量=爆發(fā)末期噬菌體滴度/感染初期宿主菌濃度，計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果，并繪制噬菌體的一步生長曲線圖。

1.8 噬菌體的溫度穩(wěn)定性測(cè)定

將1 mL噬菌體富集液(每組設(shè)3個(gè)重復(fù))分別置于4 ℃冰浴及37、45、50、55、60、70 ℃的水浴鍋中處理1 h后，對(duì)樣品進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定不同溫度處理后的噬菌體效價(jià)。

1.9 噬菌體的pH穩(wěn)定性測(cè)定

配制pH為1～12的LB肉湯，將100 μL噬菌體富集液分別加入到不同pH的1 mL LB肉湯中(每組設(shè)3個(gè)重復(fù))，37 ℃、180 r·min-1搖床下孵育1 h后，測(cè)定不同pH條件下處理后的噬菌體效價(jià)。

1.10 宿主譜測(cè)定

挑取本實(shí)驗(yàn)室中102株與GZB8C146-1M同一批分離出的blaNDM-5陽性大腸桿菌和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922，其中12株大腸桿菌同時(shí)攜帶blaNDM-5和mcr-1耐藥基因，采用點(diǎn)樣法測(cè)定噬菌體的宿主譜。取100 μL對(duì)數(shù)期菌液加入5 mL半固體中，搖晃均勻后靜置放涼即得到試驗(yàn)所需的雙層平板，將2 μL噬菌體液點(diǎn)板于雙層平板上，37 ℃培養(yǎng)6～8 h后，讀取試驗(yàn)結(jié)果。

1.11 噬菌體的全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

使用Omega公司病毒提取試劑盒進(jìn)行噬菌體DNA的提取，DNA樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行二代測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入CLC Genomics Workbench 10.1，通過De Novo Assembly進(jìn)行拼接，獲得contigs，用于進(jìn)一步分析。利用RAST(https://rast.nmpdr.org/rast.cg)和NCBI中的BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)注釋和驗(yàn)證ORF；利用MEGAX軟件及NCBI中BLAST比對(duì)相似的10組噬菌體序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫CGE(https://cge.cbs.dtu.dk/services/)進(jìn)行耐藥基因和毒力基因的查找。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離與純化

以同時(shí)攜帶blaNDM-5及mcr-1陽性大腸桿菌GZB8C146-1為宿主菌，從鴨場(chǎng)污水中分離純化出1株噬菌體，將其命名為vB_EcoM-ZQ1(圖1A)。

2.2 噬菌體的透射電鏡觀察

透射電鏡結(jié)果(圖1B)顯示，vB_EcoM-ZQ1具有較為典型的二十面體頭部和尾部，噬菌體全長大小約為180 nm，其中，頭部約為72 nm，尾部約為108 nm。通過電鏡觀察和全基因組測(cè)序分析，該噬菌體屬于有尾病毒目，肌尾噬菌體科。

A.噬菌體vB_EcoM-ZQ1的噬菌斑；B.噬菌體vB_EcoM-ZQ1的透射電鏡圖

2.3 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)(OMOI)

根據(jù)表2所示結(jié)果可知，當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1時(shí)，噬菌體vB_EcoM-ZQ1效價(jià)最高，為6.7×1011PFU·mL-1，所以噬菌體vB_EcoM-ZQ1的最佳感染復(fù)數(shù)為0.1。

表2 噬菌體vB_EcoM-ZQ1最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

2.4 噬菌體的一步生長曲線

由圖2可知，噬菌體vB_EcoM-ZQ1的潛伏期為20 min，在這期間噬菌體的效價(jià)雖有增長，但是總體趨勢(shì)較緩慢。在20～30 min，噬菌體效價(jià)急劇增加，持續(xù)時(shí)間10 min后，噬菌體又趨于穩(wěn)定增長。根據(jù)公式可得噬菌體vB_EcoM-ZQ1的裂解量大約為92 PFU·cell-1。

圖2 噬菌體vB_EcoM-ZQ1的一步生長曲線

2.5 噬菌體的溫度穩(wěn)定性

由圖3A可知，噬菌體vB_EcoM-ZQ1在4～55 ℃，噬菌體的效價(jià)變化不大，較為穩(wěn)定。60 ℃時(shí)，噬菌體效價(jià)出現(xiàn)明顯下降，在70 ℃時(shí)，觀察不到噬菌體的存活，說明在該溫度下，噬菌體vB_EcoM-ZQ1的活力被嚴(yán)重破壞。

2.6 噬菌體的pH穩(wěn)定性

如圖3B所示，噬菌體vB_EcoM-ZQ1在pH耐受范圍為4～10，噬菌體對(duì)pH有較寬的耐受性，當(dāng)pH低于3或高于11時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)存活的噬菌體，說明噬菌體vB_EcoM-ZQ1不耐強(qiáng)酸和強(qiáng)堿。

A.噬菌體vB_EcoM-ZQ1溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果；B.噬菌體vB_EcoM-ZQ1pH穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 噬菌體的宿主譜測(cè)定

噬菌體vB_EcoM-ZQ1能裂解26株大腸桿菌，裂解率為25.5%。26株大腸桿菌中，有24株是攜帶blaNDM-5耐藥基因的大腸桿菌，有2株為同時(shí)攜帶blaNDM-5和mcr-1耐藥基因。結(jié)果說明噬菌體vB_EcoM-ZQ1對(duì)多重耐藥細(xì)菌有一定的裂解作用，但試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)該噬菌體并不能裂解大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922，試驗(yàn)所選取菌株信息及裂解情況如表3所示。

表3 宿主譜選用菌株信息及宿主譜測(cè)定結(jié)果

2.8 噬菌體的基因組學(xué)分析

基因組裝后的噬菌體vB_EcoM-ZQ1基因全長149 112 bp，GC含量為49.1%。通過注釋和比對(duì)后，該基因組共比對(duì)到184個(gè)ORF，預(yù)測(cè)出了2個(gè)tRNA，分別為tRNA-Met(CAT)和tRNA-Ser(GCT)?；蚪M中并未預(yù)測(cè)出耐藥基因和毒力因子，說明了噬菌體ZQ1在臨床上應(yīng)用的安全性。

在184個(gè)ORF中，有70個(gè) ORF是已知功能的基因，其中約35%的基因與噬菌體的結(jié)構(gòu)與組裝有關(guān)，如tail spike protein、baseplate wedge subunit、Gp4 head completion protein和Gp13 neck protein等；約61%的基因與噬菌體DNA復(fù)制和調(diào)控有關(guān)，如DNA ligase、putative DNA polymerase和dCMP deaminase等；terminase large subunit、terminase small subunit及Gp20 portal vertex protein of head與噬菌體DNA包裝有關(guān)，同時(shí)有1個(gè)基因putative endolysin與宿主裂解相關(guān)(圖4)。

圖4 噬菌體vB_EcoM-ZQ1的基因圖譜

由圖5的發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果顯示，噬菌體vB_EcoM-ZQ1與沙門菌噬菌體pSal-SNUABM-02的親緣關(guān)系最近，位于同一分支，其次是沙門菌噬菌體P46FS4，而與腸桿菌噬菌體EspM4VN的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討 論

大腸桿菌廣泛分布于養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境和動(dòng)物體內(nèi)，大腸桿菌病傳統(tǒng)上采取抗菌藥物進(jìn)行治療，在這個(gè)過程中，由于臨床養(yǎng)殖人員缺乏足夠的理論知識(shí)儲(chǔ)備，養(yǎng)殖場(chǎng)細(xì)菌耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重[11]?！俺?jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)給抗菌藥物的運(yùn)用帶來了極大的壓力，也嚴(yán)重威脅到了公共衛(wèi)生健康，于是近些年“噬菌體治療”概念被提出，由于噬菌體易獲得、低成本和安全性高等優(yōu)點(diǎn)[12]，“噬菌體治療”也被越來越多人所接受，且逐步形成產(chǎn)業(yè)化試用于臨床[13]。

本研究從鴨場(chǎng)水環(huán)境中成功分離出1株對(duì)同時(shí)攜帶blaNDM-5及mcr-1耐藥基因的家禽源大腸桿菌有裂解作用的噬菌體vB_EcoM-ZQ1。該噬菌體電鏡下呈現(xiàn)出多面體的頭部和一個(gè)可收縮的尾部，噬菌體全長大小約為180 nm，其中，頭部約為72 nm，尾部約為108 nm，屬于有尾病毒目，肌尾噬菌體科噬菌體[14-15]，和基因組分析比對(duì)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，也和葛展霞等[16]報(bào)道的噬菌體形態(tài)相似。

噬菌體vB_EcoM-ZQ1在溫度4～55 ℃范圍內(nèi)都能較穩(wěn)定生長，與孫利廠等[17]的報(bào)道相比，該噬菌體具有更寬的活性范圍；在pH4～10時(shí)，噬菌體vB_EcoM-ZQ1的活性都較高，耐受范圍比楊慧敏等[18]報(bào)道的要寬，但當(dāng)pH低于3或高于11時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)噬菌體的存活，說明噬菌體不耐強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，這一結(jié)論與絕大多數(shù)報(bào)道一致[19]。噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)為0.1，潛伏期為20 min，裂解期為10 min，裂解量為92 PFU·cell-1，噬菌體的裂解期要短于一般文獻(xiàn)報(bào)道[20]，但與Thanh 等[21]報(bào)道的一步生長曲線相似，并表示該噬菌體能在短時(shí)間內(nèi)完成裂解過程，運(yùn)用于臨床實(shí)踐中，能快速殺滅耐藥大腸桿菌[22]。宿主譜試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，噬菌體的裂解率為25.5%，低于Zhou等[23]的報(bào)道，也不能裂解大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922，考慮與試驗(yàn)選用菌株也有一定關(guān)系，但對(duì)于治療多重耐藥大腸桿菌甚至攜帶blaNDM-5及mcr-1依舊有理論意義。

經(jīng)過全基因組測(cè)序分析后，將噬菌體序列上傳至NCBI(NCBI序列號(hào)：MW650886)，該噬菌體基因全長149 112 bp，GC含量為49.1%，無明顯的GC偏向性，共有184個(gè)ORF，其中有70個(gè)ORF是已知功能的基因，表明該基因組絕大部分基因組序列有待研究。噬菌體vB_EcoM-ZQ1中發(fā)現(xiàn)了tRNA的存在，噬菌體依靠吞噬宿主菌獲得增殖，利用宿主菌的tRNA完成自身生物合成的過程[24]，在很長一段時(shí)間，噬菌體被認(rèn)為不攜帶tRNA，但隨著研究的深入和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的噬菌體中發(fā)現(xiàn)了tRNA的存在，Bailly-Bechet等[25]指出tRNA可能在一定程度上能提高噬菌體對(duì)宿主菌的裂解能力。但在噬菌體中并未發(fā)現(xiàn)該噬菌體中含有耐藥基因與毒力因子，驗(yàn)證了該噬菌體運(yùn)用于獸醫(yī)臨床的安全性。噬菌體vB_EcoM-ZQ1和沙門菌噬菌體pSal-SNUABM-02[26]的親緣關(guān)系最近，位于同一分支，與志賀菌phiSboM-AG3[27]有92.37%的相似性，而這些噬菌體的宿主菌分別是志賀菌和腸桿菌，考慮噬菌體vB_EcoM-ZQ1有可能具有裂解其他類型菌的能力，有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

成功篩選出1株對(duì)同時(shí)攜帶blaNDM-5及mcr-1耐藥基因的家禽源大腸桿菌有裂解作用的噬菌體vB_EcoM-ZQ1，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性和基因組學(xué)研究，明確了噬菌體形態(tài)和生物學(xué)特征，驗(yàn)證了運(yùn)用于獸醫(yī)臨床的可行性，從基因組學(xué)角度也證明了該噬菌體的安全性，為后期噬菌體防控blaNDM-5及mcr-1陽性大腸桿菌感染奠定了一定基礎(chǔ)。