鄔建飛，劉 宇，馬 瑤，蔣旭東，胡雙閣，龔三你，字向東，盧建遠(yuǎn)

(西南民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor-β, NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中最早被研究的一類生物活性分子，由意大利科學(xué)家麗塔·萊維-蒙塔爾奇尼發(fā)現(xiàn)并被美國(guó)科學(xué)家斯坦利·科恩首次分離純化[1]。NGF是一種分子量為26～28 ku的同源二聚體，由α、β和γ三個(gè)亞基組成，其中γ亞基是一種高度特異性的活性蛋白酶，α亞基無(wú)顯著活性[2]。NGF在發(fā)現(xiàn)之初被認(rèn)為僅對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和功能特性的表達(dá)等具有調(diào)控作用[3]，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NGF在其他生理活動(dòng)中也發(fā)揮著重要作用，如促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、改變細(xì)胞極性和誘導(dǎo)血管生成等方面[4-6]。研究表明NGF主要通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶1(neurotrophic receptor tyrosine kinase 1, NTRK1，也稱TrkA)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(nerve growth factor receptor, NGFR，也稱p75 NTR)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能，NGF以高親和力與NTRK1的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使NTRK1二聚體化并激活其細(xì)胞內(nèi)激酶，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖和分化；NGF以低親和力與NGFR結(jié)合，通過(guò)激活NF-κB、Jun-N和神經(jīng)酰胺信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)促細(xì)胞凋亡[5]。

研究還發(fā)現(xiàn)，NGF廣泛存在于駱駝、公牛、羊駝等動(dòng)物的精漿細(xì)胞中，它能夠提高精子存活率，同時(shí)也是母畜發(fā)生促黃體素(LH)峰和誘發(fā)排卵所必需的生物分子，其在雌性動(dòng)物的生殖調(diào)控中起著重要調(diào)控作用[7-8]。研究表明，NGF基因敲除小鼠的初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的數(shù)量顯著低于正常小鼠；利用馬絨毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin，eCG)誘導(dǎo)大鼠超數(shù)排卵，在LH峰發(fā)生前注射NGF拮抗劑或TrkA阻滯劑，LH的峰值顯著下降，同時(shí)排卵受到抑制[9-10]。駱駝和羊駝肌肉注射NGF會(huì)引起血漿中LH濃度激增；在母牛排卵前肌注NGF可以促進(jìn)黃體的形成，LH釋放量和LH峰值都顯著增加；體外培養(yǎng)牛卵泡膜細(xì)胞時(shí)用NGF進(jìn)行處理，細(xì)胞增殖速率明顯增加，同時(shí)促進(jìn)了前列腺素E2、雄烯二酮和孕酮(P4)的釋放[7-8,11]。目前，已經(jīng)在牛[12]、大鼠[9]、松鼠[13]、人類[14]等動(dòng)物的卵巢中檢測(cè)到NGF及其受體的表達(dá)，進(jìn)一步探究NGF及其受體在卵巢中的作用機(jī)制具有重要意義。

綜上所述，NGF不僅在神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和功能特性的表達(dá)等具有調(diào)控作用，而且在多種非神經(jīng)系統(tǒng)尤其是在促進(jìn)排卵和黃體形成等方面也發(fā)揮重要作用。牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒、低氧、高紫外線輻射等多種不利因素下的青藏高原特有畜種，其繁殖效率低下[15-17]，目前有關(guān)牦牛NGF基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以牦牛作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)牦牛NGF基因克隆測(cè)序、生物信息學(xué)分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)，并采用RT-qPCR技術(shù)和對(duì)NGF基因在牦牛不同組織和不同生理期生殖器官的表達(dá)變化進(jìn)行分析，再進(jìn)一步利用免疫組化(immunohistochemistry, IHC)技術(shù)定位NGF蛋白在牦牛各生殖器官中的表達(dá)分布，為進(jìn)一步探究NGF基因在牦牛生殖生理中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑及主要儀器

本試驗(yàn)樣品均采自四川省成都市青白江區(qū)屠宰場(chǎng)，試驗(yàn)動(dòng)物是同批次的青海高原牦牛。采用頸動(dòng)脈放血法處死母牦牛后立即采集試驗(yàn)樣品，其中包括：3頭5～6歲黃體期(卵巢表面可見(jiàn)突出黃體)牦牛的心、肝、脾、肺、腎、卵巢、子宮和輸卵管組織樣(n=3)，用眼科剪剪至約1 cm×0.5 cm×0.5 cm大小后放入RNase free凍存管，置于液氮帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆?；用同樣方法分別采集3頭卵泡期(卵巢表面分布多個(gè)明顯有腔卵泡)牦牛、3頭妊娠期(妊娠3～4月)牦牛以及3頭胎牛(3～4月齡)的卵巢、子宮和輸卵管組織樣(n=3)；同時(shí)采集3頭黃體期牦牛卵巢、子宮、輸卵管組織樣(n=3)，用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，待固定完成后用于IHC試驗(yàn)。

TRIzol、總量RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天漠科技開發(fā)有限公司；RevertAidTMMaster Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix(2×)、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購(gòu)自Thermo Scientific(美國(guó))公司；NGF一抗購(gòu)自Affinity(中國(guó))公司；4%多聚甲醛固定液購(gòu)自博士德生物工程有限公司；檸檬酸(PH6.0)抗原修復(fù)液、蘇木素染液、蘇木素分化液、中性樹膠、組化試劑盒DAB顯色劑、HRP標(biāo)記的山羊抗兔購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T載體、DL-2000 Marker購(gòu)自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。PCR儀(ETC811)購(gòu)自蘇州東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；激光共聚焦顯微鏡(LSM800)購(gòu)自ZEISS(德國(guó))公司；組織切片機(jī)(RM2016)購(gòu)自Leica(德國(guó))公司；脫水機(jī)(JJ-12 J)、包埋機(jī)(JB-P5)購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX6)購(gòu)自伯樂(lè)公司；瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(CL1000)購(gòu)自Thermo Scientific(美國(guó))公司。

1.2 牦牛組織樣RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)TRIzol法提取牦牛組織樣RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各組RNA的濃度和純度，選OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0間的備用，并使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。根據(jù)RevertAidTMMaster Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書將樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中黃牛NGF基因(登錄號(hào)：XM_010803102.3)mRNA序列，使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)NGF基因的PCR引物和RT-qPCR引物；根據(jù)GenBank中牦牛的GAPDH基因(登錄號(hào)：EU195062.1)設(shè)計(jì)RT-qPCR內(nèi)參基因GAPDH的引物。所有引物(表1)由擎科梓熙(成都)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.4 NGF基因的克隆和測(cè)序

以黃體期牦牛卵巢cDNA為模板，對(duì)牦牛NGF基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)為20 μL體系：ddH2O 6.4 μL，Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix(2×)10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，DMSO 0.6 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性(98 ℃，30 s)；變性(98 ℃，10 s)，退火(66.2 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，20 s)，共38個(gè)循環(huán)；延伸(72 ℃，10 min)，最后4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，根據(jù)DNA純化試劑盒操作說(shuō)明純化收回目的片段。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接，隨后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，再均勻涂布到含Amp抗生素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白色單菌落，接種到含Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)6 h，利用菌液PCR 鑒定陽(yáng)性克隆，隨后將陽(yáng)性菌液送至擎科梓熙(成都)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 NGF基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)牦牛NGF基因特性進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析的具體項(xiàng)目和軟件見(jiàn)表2。

表2 生物信息學(xué)分析內(nèi)容及對(duì)應(yīng)軟件

1.6 牦牛NGF基因的組織表達(dá)譜

采用RT-qPCR檢測(cè)NGF基因的表達(dá)水平，反應(yīng)體系為15 μL：上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 5.5 μL，PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 7.5 μL，各組織cDNA 1 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序：預(yù)變性(95 ℃，3 min)；變性(95 ℃，10 s)，退火(59.5 ℃，30 s)，共39個(gè)循環(huán)。

1.7 免疫組織化學(xué)(IHC)定位NGF蛋白在牦牛生殖器官中的分布

將組織樣在4%多聚甲醛中進(jìn)行充分固定，后進(jìn)行脫水，包埋，切片(4 μm)，石蠟切片脫蠟至水，然后將組織切片置于盛有檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)的修復(fù)盒中進(jìn)行抗原修復(fù)；再將切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片放入PBS(pH 7.4)中置于脫色搖床上晃動(dòng)洗滌，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；隨后滴加3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min；輕輕吸掉封閉液，在切片上滴加一抗(1∶100稀釋)，對(duì)照組添加等量PBS代替一抗，后在濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜；洗掉一抗后滴加二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋組織，室溫孵育50 min；洗掉二抗后滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，流水沖洗切片終止顯色；用蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。利用激光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果，拍攝各組顯微照片。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品采用RT-qPCR重復(fù)檢測(cè)3次，以牦牛GAPDH基因表達(dá)量為參照，記錄每組數(shù)據(jù)的Ct值，根據(jù)2-△△Ct算法[18]，求出各組組織樣的相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行Duncan’s分析檢測(cè)不同組間的差異顯著性，其中P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著；表達(dá)差異圖利用Graphpad prism 8.02軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛NGF基因的克隆

本研究以3頭黃體期牦牛卵巢的cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期長(zhǎng)度大小一致的目的片段(圖1)。通過(guò)測(cè)序得到牦牛NGF基因長(zhǎng)942 bp，CDS區(qū)全長(zhǎng)726 bp, 共編碼241個(gè)氨基酸(圖2)。已將牦牛NGFcDNA序列提交至NCBI，獲得登錄號(hào)MZ298995。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.3頭牦牛的NGF目的片段

2.2 牦牛NGF蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)

利用ExPASy Protparam tool在線軟件對(duì)牦牛NGF的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)分子式為C1179H1861N349O339S10，分子質(zhì)量為26.67 ku；脂肪族系數(shù)為74.90、不穩(wěn)定系數(shù)為44.16、親水性總平均值為-0.293、理論等電點(diǎn)為9.72、在哺乳動(dòng)物體內(nèi)紅細(xì)胞中的估計(jì)半衰期為30 h、消光系數(shù)為26 845；NGF蛋白共包含20種氨基酸，其中含量最高的是丙氨酸(Ala)，其次是蘇氨酸(Thr)，占比分別為9.5%和8.3%，其他氨基酸含量均低于8%，帶負(fù)電荷(Asp+Glu)的氨基酸殘基總數(shù)和帶正電荷(Arg+Lys)的氨基酸殘基總數(shù)分別為19和31個(gè)。因此可以推斷，NGF蛋白屬于堿性不穩(wěn)定親水蛋白。

利用NetPhos 3.1預(yù)測(cè)牦牛NGF的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示其包含24個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包含13個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)和11個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)；利用NetOGlyc4.0預(yù)測(cè)牦牛NGF的糖基化位點(diǎn)，結(jié)果顯示其包含16個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中包含15個(gè)O-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(圖2)。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位顯示，NGF蛋白在細(xì)胞中廣泛分布，其中主要分布于線粒體和細(xì)胞外(包括細(xì)胞膜)，占比分別為26.1%和17.4%，其次是細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，占比均為13.0%，還存在于高爾基體和液泡中，占比分別為8.8%和8.7%。

加粗代表糖基化位點(diǎn)，斜體代表磷酸化位點(diǎn)，斜體加粗代表同時(shí)屬于糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)；下劃線是起始密碼子，*表示終止密碼子

2.3 牦牛NGF蛋白質(zhì)同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用DNAMAN將牦牛NGF基因所編碼的氨基酸與其他物種進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，在進(jìn)行比對(duì)的物種中，牦牛與黃牛(NP_001092832.1)的氨基酸序列相似性最高，為100%，與野牛(XP_010829044.1)、綿羊(XP_004002418.2)、野豬(XP_020945655.1)、赤狐(XP_025850472.1)的NGF氨基酸序列相似度依次為99%、98%、94%、92%，說(shuō)明NGF基因在物種進(jìn)化中具有高度保守性(圖3)。

黑色代表同源性為100%，粉色代表同源性大于75%，藍(lán)色代表同源性大于50%,白色同源性小于50%

為了進(jìn)一步研究牦牛NGF基因的進(jìn)化過(guò)程，利用MEGA7.0構(gòu)建牦牛NGF氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示(圖4)，牦牛首先與黃牛聚為一類，說(shuō)明牦牛NGF基因與黃牛親緣關(guān)系最近；其次與水牛、野牛、山羊、綿羊聚為一類，這些動(dòng)物都屬于反芻動(dòng)物；再與野豬、虎鯨、小夜猴、金絲猴、東北虎和狗聚為一類；最后與蝙蝠聚為一類，與牦牛NGF基因親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是蝙蝠，表明該基因的進(jìn)化符合物種的進(jìn)化規(guī)律。

圖4 NGF蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 牦牛NGF蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及蛋白相互作用的預(yù)測(cè)

利用PSIPRED和SWISS-MODE線上軟件分別對(duì)牦牛NGF蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示NGF蛋白由β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，占比分別為62.24%、14.11%和23.65%。不具有跨膜結(jié)構(gòu)、胞外結(jié)構(gòu)、無(wú)序結(jié)構(gòu)等(圖5A)，三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5B)與二級(jí)結(jié)構(gòu)相吻合，SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，牦牛NGF氨基酸18位和19位間可能存在Sec信號(hào)肽。

利用STRING線上分析軟件對(duì)牦牛NGF蛋白進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，結(jié)果顯示NGF蛋白與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶1(NTRK1)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶2(NTRK2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASP3)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素5(PCSK5)和弗林蛋白酶(FURIN)等蛋白互作緊密(圖5C)，它們的相關(guān)性系數(shù)分別為0.999、0.992、0.988、0.967、0.948和0.941。

A.NGF蛋白的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中黑色代表β-轉(zhuǎn)角，淺黑色代表α-螺旋，灰色代表無(wú)規(guī)則卷曲; B.NGF蛋白的預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)；C.牦牛NGF蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析圖

2.5 牦牛NGF基因在組織中的表達(dá)分析

以輸卵管中NGF基因的相對(duì)表達(dá)量作為參考，利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)牦牛心、肝、脾、肺、腎、卵巢、子宮和輸卵管中NGF基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖6)，NGF基因在牦牛各組織中廣泛表達(dá)，其中在卵巢中相對(duì)表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；其次在心和腎中表達(dá)較高，在心中的表達(dá)極顯著高于子宮、輸卵管、肝、脾和肺(P<0.01)，在腎中的表達(dá)量極顯著高于輸卵管、肝、脾和肺(P<0.01)；在子宮中表達(dá)量顯著高于肺(P<0.05)；在輸卵管、肝、脾和肺中表達(dá)量較低，且組織間表達(dá)差異不顯著。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著。下同

黃體期卵巢中NGF的相對(duì)表達(dá)量最高，極顯著高于其他3個(gè)時(shí)期(P<0.01)，其他時(shí)期間表達(dá)差異不顯著；在子宮中，NGF相對(duì)表達(dá)較高的是妊娠期，顯著高于胎牛期和卵泡期(P<0.05)，卵泡期和胎牛期的表達(dá)差異不顯著；在輸卵管中，NGFmRNA各時(shí)期表達(dá)差異不顯著(圖7)。另經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，胎牛期卵巢中NGF的相對(duì)表達(dá)量顯著高于輸卵管(P<0.05)，卵泡期卵巢中NGF的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于子宮和輸卵管(P<0.01)，黃體期卵巢中NGF的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于子宮和輸卵管(P<0.01)，妊娠期卵巢和子宮中NGF的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于輸卵管(P<0.01)。

圖7 NGF基因在母牦牛生殖器官中的相對(duì)表達(dá)水平

2.6 牦牛NGF蛋白在生殖器官中的表達(dá)和定位

利用免疫組化技術(shù)定位NGF蛋白在牦牛生殖器官中的表達(dá)分布，其中棕黃色為NGF蛋白。NGF蛋白在牦牛顆粒層細(xì)胞和卵巢上皮層細(xì)胞均有表達(dá)，在顆粒層細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈(圖8A,B,C,D)；NGF蛋白在牦牛子宮內(nèi)膜具有高表達(dá)(圖8E)，在牦牛輸卵管的黏膜上皮細(xì)胞高表達(dá)(圖8F)。

A～F.免疫組化染色照片；A～D.卵巢；E.子宮；F.輸卵管；G～I(xiàn).卵巢、子宮、輸卵管的陰性對(duì)照.SG.顆粒層；TI.卵泡膜內(nèi)層；PF.初級(jí)卵泡；OE.卵巢上皮層；FA.卵泡腔；E.子宮內(nèi)膜；EM.黏膜上皮；L.管腔

3 討 論

NGF對(duì)周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)和分化等具有重要的調(diào)節(jié)功能，在發(fā)育和神經(jīng)生物學(xué)中扮演著重要的角色[3]，NGF不僅對(duì)退化的周圍神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，而且對(duì)神經(jīng)細(xì)胞合成神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽也起著調(diào)節(jié)作用[19]。臨床研究表明，NGF局部給藥對(duì)治療人皮膚壓瘡、角膜潰瘍、青光眼、視網(wǎng)膜黃斑病變、視網(wǎng)膜色素變性以及兒童視神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腦外傷都具有積極作用[3]。NGF能誘導(dǎo)駱駝排卵的發(fā)現(xiàn)掀起了新的研究熱潮，探討NGF在雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)中的潛在作用具有重要意義[8, 20-21]。鑒于牦牛的低繁殖率和高流產(chǎn)率，研究NGF基因在牦牛生殖器官的表達(dá)特性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，也為后續(xù)利用研究NGF提高牦牛繁殖效率提供一定的理論基礎(chǔ)。

本研究成功克隆測(cè)序得到牦牛NGF基因完整的CDS區(qū)，其長(zhǎng)度為726 bp，共編碼241個(gè)氨基酸，在所編碼的氨基酸中，丙氨酸和蘇氨酸的含量較高，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)NGF中丙氨酸發(fā)生突變時(shí)其對(duì)NGFR的結(jié)合親和力降低4～10倍，生物學(xué)活性降低，說(shuō)明丙氨酸對(duì)NGF的功能實(shí)現(xiàn)不可或缺[22]。BREK是一種具有催化活性的絲氨酸/蘇氨酸激酶，BREK在受到NGF的刺激后迅速磷酸化，激活其酶活力，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元突觸的形成[23]。牦牛NGF蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位顯示其主要存在于線粒體中。Ahluwalia等[24]在研究NGF對(duì)大鼠胃微血管細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)NGF的高親和力受體 TrkA主要存在于胃微血管細(xì)胞膜的線粒體中，NGF的保護(hù)機(jī)制是由TrkA對(duì)線粒體的直接作用所介導(dǎo)的。在NGF氨基酸序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)牦牛與黃牛的同源性最高，相似度為100%，系統(tǒng)進(jìn)化樹也顯示牦牛首先與黃牛聚為一類，說(shuō)明牦牛NGF基因與黃牛親緣關(guān)系最近，再與同屬于反芻動(dòng)物的水牛、野牛、山羊、綿羊聚為一類，最后與同屬于哺乳動(dòng)物的野豬、虎鯨、小夜猴、金絲猴、東北虎、狗、蝙蝠聚為一類，在所進(jìn)行比對(duì)的動(dòng)物中氨基酸同源性均在87%以上。Ebendal等[25]也發(fā)現(xiàn)，NGF氨基酸在不同物種間具有高度的同源性，說(shuō)明NGF基因在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守。蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)NGF蛋白與NTRK1、NGFR、NTRK2、Caspase-3、PCSK5和Furin等蛋白互作緊密。NTRK1和NGFR同屬于NGF受體，NGF與NTRK1和NGFR特異性結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能[3]；Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，在利用神經(jīng)節(jié)苷脂治療急性脊髓損傷大鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)Caspase-3的表達(dá)下調(diào)，NGF基因表達(dá)上調(diào)，表明二者存在拮抗作用[26]。PCSK5是體內(nèi)proNGF的加工酶，PCSK5加工與否決定了神經(jīng)元細(xì)胞的存活及死亡，加工后的NGF與NTRK1以高親和力結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化，未加工的NGF與NGFR以低親和力結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)NGF的成熟還需要Furin蛋白酶的內(nèi)切作用實(shí)現(xiàn)[27-28]。

本研究的組織表達(dá)譜結(jié)果分析顯示，NGF在牦牛各組織中廣泛表達(dá)，其中在卵巢中的相對(duì)表達(dá)量最高，在心、腎和子宮的表達(dá)量較高，在肺、脾和肝的表達(dá)較低。在人[29]和小鼠[30]的研究中也發(fā)現(xiàn)，NGFmRNA廣泛分布，并在卵巢和心高表達(dá)，對(duì)維持卵巢和心的生理功能具有重要作用。RT-qPCR結(jié)果顯示牦牛黃體期卵巢中NGFmRNA的表達(dá)量顯著高于卵泡期、妊娠期和胎牛期，說(shuō)明NGF在維持牦牛黃體功能中發(fā)揮重要作用。牦牛卵巢IHC結(jié)果顯示NGF蛋白廣泛分布于卵泡的顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞中，這與在人、松鼠和牛卵巢上的表達(dá)定位相似，證明NGF蛋白在牦牛卵巢的功能實(shí)現(xiàn)上不可缺少。已有研究發(fā)現(xiàn)，排卵后殘留的顆粒細(xì)胞在LH的作用下形成富含毛細(xì)血管的黃體組織，NGF與VEGF協(xié)同促進(jìn)血管細(xì)胞增殖，以形成黃體的血管系統(tǒng)[31]。研究還發(fā)現(xiàn)，NGF對(duì)LH峰和排卵的促進(jìn)作用主要通過(guò)促進(jìn)下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元實(shí)現(xiàn)，卵巢在調(diào)節(jié)下丘腦或垂體對(duì)NGF的反應(yīng)中起著重要作用，NGF促進(jìn)垂體分泌LH[8]。羊駝NGF肌注治療可以增加血漿中P4濃度，同時(shí)增加了黃體直徑，擴(kuò)大了黃體血管面積，延長(zhǎng)了黃體退化時(shí)間[32]。Stewart等[33]對(duì)荷斯坦母牛進(jìn)行同期發(fā)情處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，GnRH配合NGF使用的試驗(yàn)組中LH的釋放量和LH峰值都比僅用GnRH的處理組高。Silva等[34]向美洲駝肌肉、靜脈或?qū)m內(nèi)注射NGF都會(huì)引起排卵前LH激增，進(jìn)而誘發(fā)排卵和功能性黃體的發(fā)育，García-García等[35]向雌性兔子肌肉注射NGF后發(fā)現(xiàn)兔子排卵率有了顯著提高。上述研究結(jié)果均證明，NGF會(huì)對(duì)雌性動(dòng)物卵巢的生殖活動(dòng)產(chǎn)生重要影響，但也有研究顯示卵巢中NGF的過(guò)量表達(dá)會(huì)損害胚胎發(fā)育并導(dǎo)致成年雌性小鼠的生殖和代謝功能障礙；同時(shí)還會(huì)損害卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的雙向交流，降低卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[36-37]。牦牛黃體期卵巢中NGF的高表達(dá)說(shuō)明NGF可能在促進(jìn)牦牛黃體形成和促進(jìn)排卵過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

子宮是早期胚胎附植、發(fā)育的場(chǎng)所，還具有調(diào)節(jié)卵巢功能、幫助精子獲能等功能[38]。Barraza等[39]在妊娠羊駝的子宮腔上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了NGF和NTRK1的表達(dá)，懷孕15 d的羊駝的子宮中NGF和NTRK1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于未妊娠組，并觀察到駱駝子宮內(nèi)膜血管的增加，說(shuō)明NGF參與了羊駝胚胎妊娠過(guò)程的血管發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠過(guò)程中胎兒的發(fā)育、P4和雌激素分泌量的增加等都會(huì)損害子宮的交感神經(jīng)系統(tǒng)，而妊娠期大鼠子宮中NGF的表達(dá)量顯著增高有利于懷孕子宮交感神經(jīng)系統(tǒng)的再生[40]。本研究RT-qPCR結(jié)果顯示NGF在妊娠期子宮中的相對(duì)表達(dá)量最高，子宮IHC結(jié)果顯示NGF蛋白在子宮內(nèi)膜高表達(dá)，說(shuō)明NGF參與了牦牛的妊娠過(guò)程，NGF可能參與母牦牛子宮內(nèi)膜血管的形成和交感神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)，為妊娠子宮的功能實(shí)現(xiàn)發(fā)揮重要作用。Li等[41]在牛輸卵管上皮細(xì)胞中檢測(cè)到NGF及其受體NTRK1的表達(dá)，并推測(cè)NGF/NTRK1可能通過(guò)與促性腺激素的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)牛輸卵管功能；Maruccio等[42]發(fā)現(xiàn)，NGF和NTRK1主要存在于日本鵪鶉輸卵管的血管壁神經(jīng)纖維中。輸卵管是卵子進(jìn)入子宮的通道，是精卵結(jié)合的受精部位，輸卵管局部化境的變化主要發(fā)生在排卵前后和妊娠早期，其他時(shí)期差異不明顯[43]。本研究發(fā)現(xiàn)，NGF在牦牛各時(shí)期輸卵管中均有表達(dá)，但表達(dá)差異不顯著，這與輸卵管在這幾個(gè)時(shí)期的功能沒(méi)有顯著差異一致。輸卵管IHC結(jié)果顯示，NGF蛋白主要存在于牦牛輸卵管的黏膜上皮中，說(shuō)明NGF蛋白參與了牦牛輸卵管的生殖活動(dòng)。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆出牦牛NGF基因并通過(guò)測(cè)序獲得其完整的CDS區(qū)，其長(zhǎng)度為726 bp，共編碼241個(gè)氨基酸，核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因在進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性；NGF基因在牦牛各組織中均有表達(dá)，在卵巢中表達(dá)量較高，尤其是在黃體期的卵巢和妊娠期的子宮中表達(dá)量高，IHC定位發(fā)現(xiàn)NGF蛋白主要在卵巢的顆粒細(xì)胞和子宮內(nèi)膜中表達(dá)，說(shuō)明NGF可能在維持母牦牛卵巢機(jī)能與妊娠以及促黃體作用發(fā)揮重要的調(diào)控作用。