王 森，師俊華，王之盛，胡 瑞，王俊梅，薛 白，彭全輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所 動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都 611130)

牦牛是我國青藏高原及毗鄰地區(qū)農(nóng)牧民重要的生產(chǎn)生活物資，也是我國重要的特色遺傳資源[1]。牦牛作為藏區(qū)重要的養(yǎng)殖畜種之一，為當(dāng)?shù)厝嗣裉峁┝素S富的肉、乳、毛等重要生活物資。牦牛肉風(fēng)味獨特，與普通肉牛相比，具有低脂肪、高蛋白、富含多種重要的維生素和礦物質(zhì)等優(yōu)勢[2]，但由于營養(yǎng)條件和品種原因，其生長速度緩慢且脂肪沉積效率低下，造成了牦牛肉嫩度較差，口感粗糙[3]，這也就限制了牦牛肉產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效益的提高。牦牛肉中肌內(nèi)脂肪(IMF)含量是影響牦牛肉產(chǎn)品口感的重要因素[4-6]，并且與皮下脂肪(SF)相比，肌內(nèi)脂肪能提供共軛亞油酸和單不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，對降低心血管疾病發(fā)病率、抗動脈粥樣硬化具有一定的益處[7]。因此，研究如何提高牦牛肉中的IMF含量，降低SF含量對提高牦牛肉口感和經(jīng)濟(jì)效益具有重要的意義。

動物體內(nèi)脂肪組織的生長主要通過脂肪細(xì)胞的肥大和增殖[8]，但成熟的脂肪細(xì)胞是有絲分裂之后形成，并不具有分裂能力，因此成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)量在很大程度上取決于前體脂肪細(xì)胞的增殖分化[9]。前體脂肪細(xì)胞成熟的過程大概分為兩個階段：第一階段是前體脂肪細(xì)胞的增殖；第二階段是前體脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞，即永久性細(xì)胞周期停滯的前體脂肪細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榍蛐?，攝取營養(yǎng)使其填充為成熟脂肪細(xì)胞[10]。體外成熟皮下和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞來源于皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的分化，而前體脂肪細(xì)胞的分化主要由分化關(guān)鍵因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)等調(diào)控[11]。脂肪組織的特征和功能存在區(qū)域差異，是由于發(fā)育過程中形成的前體脂肪細(xì)胞來源差異造成[12]，這也說明不同部位來源的前體脂肪細(xì)胞在分化過程中也可能存在差異。

皮下和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的體外模型建立多見于鼠、豬、肉牛、羊等動物，牦牛脂肪沉積率低，因此皮下脂肪模型的建立具有一定的難度，而牦牛肌內(nèi)脂肪細(xì)胞體外模型的建立更鮮有報道。因此，本試驗通過優(yōu)化傳統(tǒng)酶消化法消化成年牦牛的皮下脂肪組織以及背最長肌，建立牦牛體外皮下和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞模型，并進(jìn)一步檢測兩部位前體脂肪細(xì)胞的增殖能力和分化過程中成脂關(guān)鍵基因的表達(dá)，對研究牦牛皮下和肌內(nèi)脂肪的形成、特異性育肥以及改善牦牛肉質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試驗試劑

DMEM-F12高糖培養(yǎng)基、無菌PBS購自上海培源生物有限公司；胎牛血清、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、羅格列酮(ROG)購自Sigma公司；青/鏈霉素(雙抗)、地塞米松(DEX)、胰島素、I型和II型膠原酶購自索萊寶公司；油紅O染色試劑盒購自博奧森公司；RNA提取試劑盒購自美基生物科技公司；反轉(zhuǎn)錄和定量試劑盒購自艾科瑞公司。

1.2 樣品采集及處理

在都江堰輝潤屠宰場采取5頭18～22月齡健康麥洼公牦牛的腹部皮下脂肪組織和背最長肌組織，使用無菌PBS沖洗至表面無血污后，放置到含有5%三抗PBS的無菌袋中帶回?zé)o菌細(xì)胞房。

1.3 牦牛皮下前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)

將皮下脂肪組織使用含10%三抗的PBS浸泡3遍，再用含2%三抗的PBS沖洗至干凈，用剪刀剔除血管、筋膜，隨后用剪刀剪成1～3 mm3的組織顆粒，并與I型膠原酶(2 mg·mL-1)混合，37 ℃恒溫氣浴消化40～60 min，消化后的糜狀物用40 μm的細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，收集濾液并及時終止消化。將得到的濾液以1 200 r·min-1離心10 min，棄去上清液，得到細(xì)胞團(tuán)，使用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，并以相同條件離心；將得到的細(xì)胞團(tuán)用預(yù)熱PBS重懸后，再800 r·min-1離心3 min，棄上清并重復(fù)上述清洗過程2次，最后將細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基、2%雙抗、10%胎牛血清)重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至傳代或凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)

將背最長肌組織使用含10%三抗的PBS交替清洗3次，用剪刀剔除肌肉和筋膜，隨后用剪刀剪成1～3 mm3的組織顆粒，與 II型膠原酶(1 mg·mL-1)混合，之后37 ℃恒溫氣浴消化40～60 min，消化后的糜狀物用40 μm的無菌細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，收集濾液并及時終止消化。將得到的濾液以1 200 r·min-1離心10 min，棄去上清液，得到細(xì)胞團(tuán), 使用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，并以相同條件離心；將得到的細(xì)胞團(tuán)用預(yù)熱PBS重懸后，再800 r·min-1離心5 min，棄上清并重復(fù)上述清洗過程2次，最后將細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，通過差速貼壁法純化2 h，隨后在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至傳代或凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 前體脂肪細(xì)胞標(biāo)記物PREF-1免疫熒光鑒定

將皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分別接種在6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到70%時，棄去培養(yǎng)基，使用PBS輕柔洗滌細(xì)胞，每孔加入1.5 mL 4%的多聚甲醛，將細(xì)胞固定30 min，PBS洗滌；用濃度為0.5%的Triton X-100使細(xì)胞通透60 min，棄去液體，PBS洗滌，使用濃度為5%的山羊血清封閉60 min；棄去封閉溶液，并加入稀釋的兔PREF-1抗體，4 ℃孵育過夜，棄去一抗，加入稀釋的抗兔FITC熒光二抗，37 ℃孵育80 min，棄去二抗后用PBS洗3次，每次3 min。后滴加DAPI避光孵育5 min，用PBS洗4次去除多余的DAPI，每次5 min。最后加入適量PBS，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 前體脂肪細(xì)胞增殖能力檢測

將皮下與肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔細(xì)胞接種量為6×103個。使用CCK-8法檢測牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖速度差異。每孔加入10%的CCK-8試劑，在37 ℃下孵育2 h，在450 nm波長下讀取OD值。

1.7 不同部位前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長融合至90%，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后將完全培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基(添加2%雙抗、1% 注射用卵磷脂、10 μg·mL-1牛胰島素、0.5 mmol·L-1DEX、0.5 mmol·L-1IBMX、1 mmol·L-1ROG)。分化3 d后更換維持培養(yǎng)基(添加2%雙抗、10 μg·mL-1牛胰島素)維持細(xì)胞6 d。換分化培養(yǎng)基第1天記為第0天。

1.8 油紅O染色

皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化出明顯脂滴后，棄去培養(yǎng)基，使用PBS輕柔清洗以完全去除培養(yǎng)基成分，每孔加入1.5 mL 10%中性多聚甲醛固定液，室溫固定30 min。隨后用60%異丙醇浸泡細(xì)胞，之后棄去異丙醇，每孔加入1.5 mL油紅O工作液，室溫孵育15 min，棄去染色液，用60%異丙醇分色，最后晾干鏡檢。

1.9 RNA提取及成脂分化相關(guān)基因qRT-PCR檢測

使用上述RNA提取試劑盒分別提取牦牛分化第0、3、6、9天的總肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和皮下脂肪細(xì)胞RNA。提取RNA后進(jìn)行cDNA的合成和實時定量PCR檢測。引物序列見表1，本試驗中，以UXT基因作為參考基因，使用2-△△CT法計算牦牛肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞成脂分化基因的相對表達(dá)量變化。

表1 實時定量PCR引物序列

1.10 數(shù)據(jù)分析

試驗均設(shè)置3個重復(fù)組，所有數(shù)據(jù)使用 SPASS 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并通過LSD法進(jìn)行多重比較，若P<0.05表示差異顯著，說明具有統(tǒng)計學(xué)意義，作圖則使用GraphPad Prism 6.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞和皮下前體脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對牦牛背最長肌和皮下脂肪組織進(jìn)行酶消化處理，分離出的肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞和皮下前體脂肪細(xì)胞如圖1所示，二者大部分均在原代培養(yǎng)第1天呈現(xiàn)橢圓狀，隨著培養(yǎng)時間的增加，橢圓狀細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭狀，符合前體脂肪細(xì)胞形態(tài)。兩個部位前體脂肪細(xì)胞均能在第4～5天完成融合。

IMF.肌內(nèi)脂肪細(xì)胞；SC.皮下脂肪細(xì)胞

2.2 牦牛前體脂肪細(xì)胞免疫熒光鑒定

將皮下前體脂肪細(xì)胞和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待兩部位細(xì)胞生長至70%，對二者細(xì)胞PREF-1蛋白的表達(dá)進(jìn)行免疫熒光檢測，鑒定結(jié)果如圖2所示，可以看出皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞TIFC檢測呈陽性，且熒光形態(tài)與長梭形符合，這表明，PREF-1蛋白表達(dá)為陽性，PREF-1蛋白作為前體脂肪細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白可以用來鑒定細(xì)胞樣本是否為前體脂肪細(xì)胞，因此可以看出，本試驗分離出來的細(xì)胞均為前體脂肪細(xì)胞，且根據(jù)MERGE組合圖可以看出，兩部位分離出的前體脂肪細(xì)胞形態(tài)良好，且細(xì)胞核顯影與細(xì)胞顯影重合度高。

圖2 免疫熒光鑒定(200×)

2.3 牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長曲線的繪制

使用CCK-8法測定牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的生長曲線，從圖3可以看出，牦牛肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞生長曲線均呈現(xiàn)經(jīng)典的“S”型，兩部位細(xì)胞均在3 d內(nèi)處于潛伏期，在生長第4天達(dá)到對數(shù)生長期，在第6天達(dá)到平臺期，符合細(xì)胞的生長規(guī)律。并且從兩部位OD值差異對比發(fā)現(xiàn)牦牛皮下前體脂肪細(xì)胞在第4天OD值顯著高于肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞(P<0.05)，這說明牦牛皮下前體脂肪細(xì)胞生長速度在第4天高于肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞。

*表示差異顯著(P<0.05)

2.4 牦牛成熟肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和皮下脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞和皮下前體脂肪細(xì)胞完全融合2 d后，棄去原有培養(yǎng)基，換成分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化3 d，如圖4所示，分化3 d后，肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞均由梭形收縮變?yōu)閳A球狀，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)脂滴，但大部分細(xì)胞沒有明顯脂滴出現(xiàn)；6 d后，兩部位脂肪細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)明顯密集的明亮小脂滴，此時能夠看到脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴并未聚集為大的圓形脂滴，脂肪細(xì)胞尚未成熟；分化9 d后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明亮的大圓形脂滴，標(biāo)志兩部位脂肪細(xì)胞均分化成熟。

圖4 前體脂肪細(xì)胞分化形態(tài)(400×)

2.5 牦牛肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞分化階段油紅O試驗

對處于分化第3、6、9天3個時間段的牦牛肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，染色結(jié)果如圖5所示，可以看出，肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞分化至第3天染色結(jié)果不明顯，說明此階段肌內(nèi)和皮下脂肪細(xì)胞脂質(zhì)合成量可能并不高，分化至第6天二者均出現(xiàn)明顯的脂滴，說明分化第6～9天，兩部位的脂肪細(xì)胞均出現(xiàn)了大量脂滴。

2.6 牦牛肌內(nèi)和皮下前體脂肪細(xì)胞分化階段關(guān)鍵基因表達(dá)規(guī)律檢測

成熟脂肪細(xì)胞是由前體脂肪細(xì)胞分化而來，前體脂肪細(xì)胞的分化過程受多種關(guān)鍵因子的調(diào)控。本試驗檢測了脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因PPARγ、C/EBPα，脂肪合成關(guān)鍵基因脂肪酸合成酶(FASN)、脂肪分解關(guān)鍵基因激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)。從圖6可以看出，以上基因表達(dá)水平都隨著前體脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)行而發(fā)生變化。SC和IMF的PPARγ基因的相對表達(dá)量基本都出現(xiàn)隨時間增加而增加的趨勢，無論是SC還是IMF脂肪細(xì)胞在第9天PPARγ表達(dá)量顯著高于分化第0、3、6天(P<0.05)。SC和IMF的C/EBPα基因相對表達(dá)量均在分化第6天達(dá)到峰值，二者C/EBPα基因表達(dá)量在第6天顯著高于第0、3、9天(P<0.05)。HSL基因相對表達(dá)量也隨分化時間的增加而增加，兩部位HSL基因表達(dá)量在分化第9天顯著高于第0、3、6天(P<0.05)，IMF脂肪細(xì)胞HSL基因表達(dá)量在第3天顯著高于0天(P<0.05)，SC脂肪細(xì)胞HSL基因表達(dá)量在分化第6天顯著高于0天(P<0.05),第0和3天的表達(dá)量差異并不顯著(P>0.05)。FASN基因相對表達(dá)量也隨分化時間的增加而增加，兩部位FASN基因表達(dá)量在分化第9天顯著高于第0、3、6天(P<0.05)，IMF脂肪細(xì)胞FASN基因表達(dá)量在第3天顯著高于第0天，SC脂肪細(xì)胞FASN基因表達(dá)量在分化第6天顯著高于第0天(P<0.05),第0和3天的表達(dá)量差異并不顯著(P>0.05)。

3 討 論

脂肪含量是影響肉產(chǎn)品口感、風(fēng)味和銷量的關(guān)鍵因素[13]，但不同部位脂肪沉積具有不同的效應(yīng)。皮下脂肪的過度沉積不僅嚴(yán)重影響牛肉產(chǎn)品的口感。牛肌內(nèi)脂肪單不飽和脂肪酸、共軛亞油酸以及必須氨基酸含量豐富十分有利于消費(fèi)者健康[14-15]，并且肌內(nèi)脂肪含量對牛肉品質(zhì)也有明顯的提升[16]。因此建立體外皮下和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞模型，探究皮下和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化和增殖差異，對牦牛不同部位脂肪特異性沉積具有重要的意義。

本試驗借鑒了張萌萌等[17]和樸政玉等[18]分離松遼黑豬和肉牛前體脂肪細(xì)胞的方法，熊靜等[19]發(fā)現(xiàn)，離心力過低會造成細(xì)胞收獲量減少，而離心力過高會造成細(xì)胞活力下降，蔣斌等[20]試驗表明，離心力過高、時間長和次數(shù)多會造成細(xì)胞活力下降，因此本試驗改進(jìn)了離心步驟，減少了離心力對牦牛前體脂肪細(xì)胞的傷害以及通過差速貼壁法純化了牦牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，最終成功分離了牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，通過CCK-8活性檢測，兩部位前體脂肪細(xì)胞生長曲線均呈現(xiàn)經(jīng)典“S”型，與多數(shù)試驗報道的前體脂肪細(xì)胞生長曲線相似[21-24]。通過對前體脂肪細(xì)胞特異性蛋白(PREF-1)進(jìn)行檢測，免疫熒光結(jié)果表明，本試驗分離的皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞形態(tài)符合長梭形，蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜附近，此結(jié)果與Park和Kim[25]試驗中PREF-1熒光定位相似，并且DAPI和FITC熒光組合圖表明，本試驗分離的皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞純度很高，說明本試驗牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞模型建立成功。

傳統(tǒng)前體脂肪細(xì)胞分化方法有油酸誘導(dǎo)法以及經(jīng)典的雞尾酒法[26]，但油酸誘導(dǎo)法多用于家禽的前體脂肪細(xì)胞分化[27-28]，而經(jīng)典雞尾酒法又存在分化效率低、成脂量低的缺點[29]，因此本試驗通過改良經(jīng)典雞尾酒法，向分化培養(yǎng)基中添加卵磷脂注射劑，之后對上述兩部位前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分化結(jié)果表明，換成分化培養(yǎng)基后至出現(xiàn)大脂滴，分化成熟經(jīng)過9 d，分化效率高，且脂滴數(shù)量可觀，并且油紅O染色結(jié)果表明，牦牛皮下和肌內(nèi)成熟脂肪細(xì)胞分化成功。綜上所述，牦牛皮下和肌內(nèi)成熟脂肪細(xì)胞模型建立成功。

PPARγ和C/EBPα是動物脂肪組織生成的主要調(diào)節(jié)因子，并且都在脂肪組織中高表達(dá)[30]，二者均可調(diào)節(jié)許多脂質(zhì)合成基因的表達(dá)[31]，其中C/EBPα可以誘導(dǎo)脂肪生成并上調(diào)PPARγ表達(dá)[32]，而PPARγ是脂肪細(xì)胞分化的主要關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠通過調(diào)節(jié)乙酰輔酶A羧化酶活性促進(jìn)甘油三酯的形成，最終影響脂肪的沉積[33]，在本試驗中，牦牛SC和IMF脂肪細(xì)胞中PPARγ出現(xiàn)相同的上升趨勢，而C/EBPα在6 d后表達(dá)量發(fā)生下降。試驗表明，脂肪細(xì)胞的PPARγ、C/EBPα的表達(dá)量會隨著分化時間的增加出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，與本試驗中SC和IMF脂肪細(xì)胞C/EBPα表達(dá)量趨勢相似，但本試驗中兩部位脂肪細(xì)胞在9 d的分化期內(nèi)PPARγ表達(dá)均未見下降，Wang等[34]對豬脂肪細(xì)胞分化檢測發(fā)現(xiàn)其PPARγ、C/EBPα的表達(dá)在3～4 d內(nèi)回落，而Tokach等[35]試驗表明，肉牛脂肪細(xì)胞在分化7 d后其PPARγ表達(dá)量也未出現(xiàn)回落，與本試驗結(jié)果相似，而與Wang等[34]在豬細(xì)胞上的試驗結(jié)果不符，這可能是因為不同物種脂肪細(xì)胞PPARγ的表達(dá)規(guī)律存在差異。PPARγ的上調(diào)可以促進(jìn)SREBP1的表達(dá)，Ikeda等[36]試驗表明，SREBP1能夠促進(jìn)FASN的表達(dá)，F(xiàn)ASN是生物體脂質(zhì)生物合成的主要限速酶，張濤[37]試驗發(fā)現(xiàn)，綿羊脂肪沉積與FASN的表達(dá)量成正比，Liang等[38]使用葡萄皮提取物和白藜蘆醇抑制FASN可減少脂肪堆積，因此可見FASN在生物體內(nèi)脂肪沉積過程中發(fā)揮著重要的作用。在本試驗中，SC和IMF脂肪細(xì)胞PPARγ的表達(dá)量趨勢與FASN表達(dá)量上升趨勢相同，與Ikeda等[36]的結(jié)果相似，F(xiàn)ASN表達(dá)量的上升與脂肪細(xì)胞分化成脂的過程相符。HSL是脂肪動員最初的限速酶和關(guān)鍵酶，其作用是將甘油三酯分解為甘油和游離脂肪酸，進(jìn)而防止體內(nèi)脂肪的沉積，在脂肪分解中具有重要的調(diào)節(jié)作用[39]。劉作華[40]研究發(fā)現(xiàn)，在不同脂肪細(xì)胞中HSL表達(dá)量會隨著葡萄糖濃度的增加而增加，本試驗中，IMF和SC脂肪細(xì)胞在9 d分化期內(nèi)，HSL均呈現(xiàn)上升趨勢，這可能與兩部位前體脂肪細(xì)胞分化過程中使用高糖培養(yǎng)基且更換頻繁有關(guān)。值得一提的是，在本試驗中IMF脂肪細(xì)胞HSL和FASN的表達(dá)量在第3天升高，而SC脂肪細(xì)胞卻在第6天升高,這似乎說明牦牛IMF脂肪細(xì)胞在體外分化時，脂質(zhì)代謝啟動的速率可能高于SC脂肪細(xì)胞。

4 結(jié) 論

本試驗通過改良傳統(tǒng)膠原酶消化法和雞尾酒誘導(dǎo)分化法，成功分離牦牛原代皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，并且成功誘導(dǎo)牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞成脂成化。本試驗中，成脂分化關(guān)鍵基因PPARγ、HSL、FASN表達(dá)量在9 d分化期內(nèi)均呈現(xiàn)上升趨勢，C/EBPα表達(dá)量在分化第6 d后顯著下降。本試驗成功分離了牦牛原代皮下和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，改進(jìn)了誘導(dǎo)分化方法，并初步檢測了前體脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步探究牦牛皮下和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)代謝以及不同脂肪組織差異提供了良好的模型。