李武峰，關(guān)家偉，邱麗霞，孫瑜彤，杜 敏

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2.美國華盛頓州立大學(xué)動物科學(xué)系，普爾曼 99164-6310)

驢肉是常見的肉類食品之一，不僅肉質(zhì)鮮嫩，還富含許多優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)。廣靈驢是早期勞動人民多年精心培育的優(yōu)質(zhì)小型驢種，也是中國五大優(yōu)良驢種之一[1-2]。近年來，廣靈驢因肉質(zhì)鮮嫩以及營養(yǎng)價值豐富逐漸受到人們的追捧。嫩度是衡量肉品質(zhì)的感官指標(biāo)之一，是肉食質(zhì)量的決定性感官屬性[3]。許多研究發(fā)現(xiàn)，消費者有意愿選購嫩度更好的肉食產(chǎn)品[4]。肉質(zhì)的嫩度主要受到肌纖維特性、肌內(nèi)結(jié)締組織特性、肌原纖維蛋白水解酶特性以及肌內(nèi)脂肪含量等相關(guān)因素的影響[5-6]。目前，評價肉質(zhì)嫩度的方法主要是華納-布拉茨勒剪切力(WBSF)和肌原纖維斷裂指數(shù)(MFI)[7-8]，此外，高光譜成像技術(shù)可能是進(jìn)行肉質(zhì)嫩度分類和可視化的潛在方法[9-10]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一種通過對基因表達(dá)情況和調(diào)控規(guī)律進(jìn)行全面研究從而揭示復(fù)雜的生物學(xué)通路以及性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機制的學(xué)科。Fernandez-Barroso等[11]對不同嫩度伊比利亞豬進(jìn)行RNA-Seq研究，鑒定出了200個差異表達(dá)基因和245個新異構(gòu)體。Muniz等[12]利用RNA測序數(shù)據(jù)鑒定與肉牛嫩度相關(guān)的新mRNA亞型。代謝組學(xué)不僅提供了發(fā)現(xiàn)用于監(jiān)測和評估食品質(zhì)量的生物標(biāo)志物的線索，而且還揭示了酶促反應(yīng)產(chǎn)生關(guān)鍵代謝物的分子途徑，已被廣泛應(yīng)用于肌肉和肉類科學(xué)的研究[13-14]。Muroya等[15]基于CE-TOF MS的代謝組學(xué)研究揭示了死后豬快慢型肌肉特有的代謝途徑。Wang等[16]通過核磁共振氫譜(1HNMR)和多元數(shù)據(jù)分析研究了肉雞胸肌木質(zhì)化對代謝產(chǎn)物譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組氨酸、β-丙氨酸、肌酸、肌酐等代謝物的水平顯著低于正常組。目前，對畜禽動物肉質(zhì)進(jìn)行組學(xué)研究的報道多見于豬[17]、牛[18-19]、羊[20]和雞[21]等動物，而尚未見以驢肉為材料進(jìn)行肉質(zhì)嫩度的研究。

由于單一的轉(zhuǎn)錄組分析獲得的差異表達(dá)基因在代謝通路中作用于多種物質(zhì)，不能直接判斷引起代謝物質(zhì)累積的強度，而代謝組學(xué)可以發(fā)現(xiàn)相關(guān)通路中代謝物種類和離子豐度的差異，對全面解析肉質(zhì)嫩度相關(guān)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控機制具有非常重要的意義。因此，可以借助轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析充分挖掘調(diào)控驢肉嫩度的基因與代謝物，從分子水平上解析驢肉嫩度的調(diào)控機制。本試驗利用轉(zhuǎn)錄組以及代謝組測序技術(shù)研究不同肉質(zhì)嫩度的廣靈驢背最長肌組織并篩選出差異表達(dá)基因和差異代謝物，然后通過聯(lián)合分析來揭示不同肉質(zhì)嫩度的廣靈驢個體的生物遺傳機制，旨在為廣靈驢肉質(zhì)嫩度的分子改良和分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從山西省忻州市繁峙縣田源毛驢養(yǎng)殖科技發(fā)展有限公司選擇30頭生長環(huán)境和飼養(yǎng)條件相同、33～36月齡的雌性廣靈驢。于屠宰30 min內(nèi)采集第12～13肋骨間的背最長肌組織，之后于液氮中冷藏備用。

1.2 主要儀器與試劑

石油醚、TRIzol、甲醇、丙醇、甲酸和乙腈均為Merck級標(biāo)準(zhǔn)品。MAQC-12肌肉嫩度儀(南京銘奧儀器設(shè)備有限公司)；索氏抽提器SXT-02(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司)；超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜儀(Thermo公司)；Illumina Novaseq 6000 測序儀(Illumina公司)。

1.3 樣品測定及篩選

利用嫩度儀和索氏抽提儀檢測廣靈驢背最長肌的剪切力和肌內(nèi)脂肪含量。對30頭廣靈驢剪切力和肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行綜合分析，以“剪切力×0.7-肌內(nèi)脂肪含量×100×0.3”為參考，篩選出剪切力和肌內(nèi)脂肪含量存在顯著差異的8頭廣靈驢，并將其分成高嫩度組(HT，n=4)和低嫩度組(LT，n=4)。

1.4 廣靈驢背最長肌總RNA提取以及轉(zhuǎn)錄組測序

使用TRIzol試劑從背最長肌組織中提取總RNA，然后利用Nanodrop 2000和Agilent 2100生物分析儀對總RNA的濃度、純度以及RIN(RNA integrity number)值進(jìn)行檢測。取檢驗合格的總RNA樣品構(gòu)建cDNA文庫并在Illumina Novaseq 6000平臺上進(jìn)行雙端測序，測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。將原始數(shù)據(jù)過濾后得到高質(zhì)量的質(zhì)控數(shù)據(jù)，并與從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的驢的基因組數(shù)據(jù)(GCF_001305755.1)進(jìn)行比對，利用Trinity 2.8.4軟件對reads序列進(jìn)行組裝拼接，利用定量指標(biāo)TPM方法來計算基因表達(dá)水平。

1.5 代謝組樣品處理及LC-MS檢測

取50 mg背最長肌組織樣本于2 mL離心管中，加入400 μL提取液(甲醇∶水=4∶1(v∶v))進(jìn)行代謝產(chǎn)物提取。樣本經(jīng)研磨、低溫超聲提取、靜置、離心后移取上清液至進(jìn)樣瓶中上機分析。所有樣品均采用LC-MS進(jìn)行分析，每組樣品有6個生物學(xué)重復(fù)。色譜條件：HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d., 1.8 μm)；流動相(A為95%水+5%乙腈，B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水，A、B相均含0.1%甲酸)；柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。質(zhì)譜條件：采用正、負(fù)離子兩種模式采集質(zhì)譜信號，電壓為3 500 V和-2 800 V；鞘氣40 psi，輔助加熱氣10 psi，離子源加熱溫度400 ℃，20～40～60 V循環(huán)碰撞能。

1.6 轉(zhuǎn)錄組、代謝組的數(shù)據(jù)分析及聯(lián)合分析

使用DESeq2[22]進(jìn)行組間基因的差異分析，計算每個基因的差異表達(dá)倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)，并以|log2Fold-Change|≥1且矯正后的P值(P-adjust)<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析[23]，并以P-adjust<0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用主成分分析(PCA)和正交最小偏二乘判別分析(OPLS-DA)來判定各樣本間的差異大小。差異代謝物的選擇基于變量權(quán)重值(VIP)和Student’s-t檢驗P值來確定，VIP≥1且P-adjust<0.05的代謝物為顯著差異代謝物。通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的代謝通路注釋，以P-adjust<0.05為條件判斷KEGG通路存在顯著富集情況。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因與代謝物進(jìn)行通路富集分析，利用R語言cor函數(shù)算出兩者的斯皮爾曼(Spearman)系數(shù)，以相關(guān)系數(shù)大于0.8為篩選標(biāo)準(zhǔn)，之后用Cytoscape構(gòu)建基因-代謝物網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 廣靈驢背最長肌剪切力和肌內(nèi)脂肪含量的測定

高嫩度組(HT，n=4)和低嫩度組(LT，n=4)的廣靈驢肌內(nèi)脂肪含量和剪切力值如表1所示，LT組與HT組差異極顯著(P<0.000 1)。

表1 廣靈驢背最長肌剪切力和肌內(nèi)脂肪含量的描述性統(tǒng)計

2.2 廣靈驢背最長肌組織差異表達(dá)基因篩選

與對照組(LT組)相比較，在HT組中共鑒定出1 253個差異表達(dá)基因，其中表達(dá)量發(fā)生上調(diào)(up)的基因共有832個，占差異基因總數(shù)的66.40%，表達(dá)量發(fā)生下調(diào)(down)的基因共有421個，占差異基因總數(shù)的33.60%(圖1)。對HT和LT兩組中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了聚類分析，從圖2中可以看出，8個樣本聚為兩個類別，HT組中的樣本HT1、HT3、HT2、HT4聚為一類，LT組的樣本LT2、LT4、LT1、LT3聚為一類，這說明這些聚集基因可能具有相似的功能注釋或者處于同一條代謝通路，且不同組間樣本具有明顯的表達(dá)差異。

圖1 HT組和LT組的組間差異表達(dá)基因火山圖

橫坐標(biāo)為樣本，縱坐標(biāo)為基因聚類

2.3 廣靈驢背最長肌組織差異基因KEGG富集分析

將1 253個差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示共富集到310個代謝途徑，其中29個代謝途徑顯著富集(P<0.05)，選取顯著富集的前25條KEGG代謝通路進(jìn)行展示(圖3)，其中AMPK信號通路、糖酵解/糖異生、胰高血糖素信號通路、黏附斑激酶信號通路、磷酸戊糖途徑、果糖和甘露糖代謝、胰島素抵抗、甘油酯代謝、甘油磷脂代謝、HIF-1信號通路以及胰島素信號通路等多種通路可能影響廣靈驢的肉質(zhì)嫩度。

圖3 KEGG富集分析散點圖

2.4 廣靈驢背最長肌組織代謝組PCA分析和OPLS-DA分析

PCA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4)，正、負(fù)離子模式中的組間樣本被區(qū)分開，QC樣本均能聚集在中心點附近，表明兩組之間的代謝物存在差異，分析方法重復(fù)性較好。OPLS-DA分析表明(圖5)，HT組和LT組在正、負(fù)離子模式下均有效地分成兩類，表明各組間代謝物表型存在顯著差異。為了避免過度擬合，本研究還進(jìn)行了OPLS-DA模型驗證(置換檢驗n=200)，正、負(fù)兩種離子模式下的R2與Q2截距分別達(dá)到0.928 7、-0.009 3和0.936、-0.117 7，說明兩個模型具有較好穩(wěn)定性且不存在過擬合現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，材料具有足夠的重現(xiàn)性，使其適合于以下分析驗證。

2.5 廣靈驢背最長肌組織代謝產(chǎn)物分析與鑒定

在正、負(fù)兩種離子模式下共檢測出699種具有已知結(jié)構(gòu)的代謝物。和LT組相比，HT組中篩選出225個差異代謝物，正離子模式下159個(圖6A)，其中上調(diào)代謝物107個，下調(diào)代謝物52個；負(fù)離子模式下66個(圖6B)，其中上調(diào)代謝物47個，下調(diào)代謝物19個。

A.正離子模式下差異代謝物火山圖；B.負(fù)離子模式下差異代謝物火山圖。散點大小表示OPLS-DA模型的VIP值，紅色表示代謝物含量增加，藍(lán)色表示代謝物含量降低，灰色表示無顯著差異

2.6 廣靈驢背最長肌組織差異代謝物KEGG富集分析

將差異代謝物富集到KEGG數(shù)據(jù)庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有111條通路得到富集，其中有20條KEGG代謝通路顯著富集(P<0.05，圖7)。在這些代謝通路中，嘌呤代謝，磷酸戊糖途徑，組氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，甘油磷脂代謝，谷胱甘肽代謝，F(xiàn)oxO信號通路，D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝，檸檬酸鹽循環(huán)，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等11個通路可能與廣靈驢的肉質(zhì)嫩度有關(guān)。

圖7 差異代謝物KEGG富集圖

2.7 廣靈驢背最長肌組織轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合KEGG通路分析

為深入了解廣靈驢肉質(zhì)相關(guān)作用機制，本研究對相同分組的差異基因和代謝物進(jìn)行KEGG聯(lián)合分析。將HT組和LT組的差異代謝物與差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路聯(lián)合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有57條共富集通路，有6條代謝通路(甘油磷脂代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，磷酸戊糖途徑，精氨酸和脯氨酸代謝，胰高血糖素信號通路以及PPAR信號通路)在KEGG聯(lián)合通路中富集(P<0.1)，并可能參與了廣靈驢肉質(zhì)嫩度的調(diào)控(表2)。

表2 轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合KEGG富集分析部分通路

2.8 廣靈驢背最長肌組織差異表達(dá)基因、差異代謝物相關(guān)性及網(wǎng)絡(luò)圖分析

對HT組和LT組差異表達(dá)基因和差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，并通過相關(guān)性分析篩選KEGG通路中差異表達(dá)基因和差異代謝物。發(fā)現(xiàn)在甘油磷脂代謝，胰高血糖素信號通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，磷酸戊糖途徑，精氨酸和脯氨酸代謝中存在Spearman相關(guān)系數(shù)大于0.8的基因和代謝物，繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖并解釋代謝物和基因之間的相互關(guān)系。甘油磷脂代謝通路中，上調(diào)代謝物膽堿、溶血磷脂酰膽堿(18:1(9Z))、溶血磷脂酰膽堿(17:0)、溶血磷脂酰膽堿(18:0)與上調(diào)基因GPAM的正相關(guān)性強；上調(diào)代謝物甘油磷酸膽堿與上調(diào)基因(GPAM、DGKE)的正相關(guān)性較強；上調(diào)代謝物甘油磷?；掖及放c上調(diào)基因(PLA2G12A、DGKE、DGKH、GPAM)的正相關(guān)性強(圖8A)。在磷酸戊糖途徑中，上調(diào)代謝物1-磷酸核糖與下調(diào)基因(PFKM、PGM1、GPI、LOC106841113、LOC106828083)的負(fù)相關(guān)性較強；上調(diào)代謝物7-磷酸景天庚酮糖與下調(diào)基因(PFKM、PGM1、GPI)的負(fù)相關(guān)性強(圖8B)。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中，上調(diào)代謝物腺苷酸基琥珀酸和檸檬酸與上調(diào)基因RIMKLB和下調(diào)基因DDO有較強的相關(guān)性(圖8C)。在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，下調(diào)代謝物肌酸與上調(diào)基因LOC106837908和下調(diào)基因GAMT的相關(guān)性強(圖8D)。在胰高血糖素信號通路中，上調(diào)代謝物檸檬酸與下調(diào)基因PRKAB2的負(fù)相關(guān)性強(圖8E)。

A.甘油磷脂代謝；B.磷酸戊糖途徑；C.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；D.精氨酸和脯氨酸代謝；E.胰高血糖素信號通路。橢圓代表代謝物，菱形代表基因，實線表示正相關(guān)，虛線線表示負(fù)相關(guān)

3 討 論

驢肉是常見的肉類食品之一，驢肉的品質(zhì)和口感直接影響消費者的選擇意愿，廣靈驢作為山西地方品種，具有肉質(zhì)鮮嫩、肌內(nèi)脂肪含量高等特點。因此本試驗以廣靈驢為研究對象，對具有不同嫩度背最長肌的廣靈驢進(jìn)行了研究，找到了嫩度的相關(guān)差異表達(dá)基因，并通過結(jié)合差異代謝物進(jìn)行聯(lián)合分析，從轉(zhuǎn)錄和代謝水平共同探究調(diào)控廣靈驢肉質(zhì)嫩度的分子機制。

本試驗對HT和LT兩組進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，共發(fā)現(xiàn)有1 253個差異基因，其中發(fā)生上調(diào)的基因有832個，下調(diào)的基因有421個，KEGG通路涉及到碳水化合物代謝(糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、果糖和甘露糖代謝)，脂質(zhì)代謝(甘油酯代謝、甘油磷脂代謝)，內(nèi)分泌系統(tǒng)(胰高血糖素信號通路、胰島素信號通路、胰島素抵抗)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(HIF-1信號通路、AMPK信號通路)以及細(xì)胞過程(黏附斑激酶信號通路)等多種途徑。代謝組分析發(fā)現(xiàn)，在HT組和LT組共篩選出225個差異代謝物，其中上調(diào)154個，下調(diào)71個。之后進(jìn)行了KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及到碳水化合物代謝(磷酸戊糖途徑、檸檬酸循環(huán))，脂質(zhì)代謝(甘油磷脂代謝)，氨基酸代謝(組氨酸代謝、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝、精氨酸生物合成和丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝)，核苷酸代謝(嘌呤代謝)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(FoxO信號通路)等多個途徑。通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)富集到KEGG的共同通路有57條，其中甘油磷脂代謝，磷酸戊糖途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝以及胰高血糖素信號通路可能參與了廣靈驢肉質(zhì)嫩度的調(diào)控。

磷脂是肌內(nèi)脂肪中主要的活性成分，而甘油磷脂是磷脂中含量最多的一種。甘油磷脂不僅能夠參與生物體內(nèi)細(xì)胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號傳導(dǎo)[24]，還能活化細(xì)胞并促進(jìn)脂肪代謝和血清膽固醇的降低等[25]。研究發(fā)現(xiàn)，膽堿類化合物是肉質(zhì)嫩度的重要指標(biāo)[17]。在甘油磷脂代謝通路中，膽堿、溶血磷脂酰膽堿(18:1(9Z))、溶血磷脂酰膽堿(17:0)、溶血磷脂酰膽堿(18:0)都與GPAM基因的正相關(guān)性強；代謝物甘油磷酸膽堿與GPAM和DGKE基因的正相關(guān)性較強；代謝物甘油磷酰基乙醇胺與PLA2G12A、DGKE、DGKH和GPAM基因的正相關(guān)性強。PLA2G12A基因在脂質(zhì)催化過程和磷脂代謝過程中發(fā)揮了重要作用，并與肌內(nèi)脂肪有一定的相關(guān)性，因此它可能有助于的脂肪沉積[26]。二甘油激酶(DGKs)能夠?qū)⒏视投チ姿峄⑵滢D(zhuǎn)化為磷脂酸，從而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。作為DGKs的亞型，DGKE和DGKH基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮了一定的作用從而對脂肪的沉積產(chǎn)生一定的影響[27-28]。而GPAM基因也在肌內(nèi)脂肪的形成中起調(diào)控作用[29]。因此，甘油磷脂代謝通路中的相關(guān)基因可能通過參與磷脂代謝的相關(guān)過程來調(diào)控肌內(nèi)脂肪的沉積，從而對肉質(zhì)嫩度產(chǎn)生一定的影響。Hamill等[30]對豬肉嫩度和肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)基因進(jìn)行了功能分析，發(fā)現(xiàn)與嫩度相關(guān)的差異基因顯著富集在甘油磷脂代謝和磷酸戊糖途徑中，與肌內(nèi)脂肪相關(guān)的基因在磷酸戊糖途徑中也得到顯著富集，這與本研究結(jié)果相一致。

磷酸戊糖途徑是葡萄糖代謝中的重要代謝途徑，其中的NADPH可以參與生物大分子的合成，同時也可以使體內(nèi)的氧化還原處于穩(wěn)定狀態(tài)，使得肌肉的抗氧化能力增強[31]。在磷酸戊糖途徑中，1-磷酸核糖和7-磷酸景天庚酮糖分別與PFKM、PGM1、GPI、LOC106841113、LOC106828083基因以及PFKM、PGM1、GPI基因的負(fù)相關(guān)性強。PFKM是一個能夠在糖酵解過程中進(jìn)行調(diào)節(jié)的酶，也是葡萄糖代謝的主要控制點[32]。PGM1能夠可逆地催化磷酸葡萄糖第1和第6位置間磷酸基的轉(zhuǎn)移，在糖原代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。有報道發(fā)現(xiàn)，PGM1可進(jìn)行磷酸化、乙?；图谆确g后修飾，翻譯后修飾影響著新陳代謝和宰后肌肉肉質(zhì)的轉(zhuǎn)變[33]，Silva等[34]利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，包括PGM1在內(nèi)的肌肉蛋白磷酸化可能是導(dǎo)致牛肉嫩度最終差異的原因。GPI是參與糖酵解的一種酶，能夠促進(jìn)葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸的相互轉(zhuǎn)換[35]。LOC106841113和LOC106828083兩個基因都注釋到果糖-1,6-二磷酸酶基因(FBP)中，F(xiàn)BP是糖異生途徑第二步反應(yīng)的限速酶，在葡萄糖生成或糖原合成中發(fā)揮功能[36]。作為參與磷酸戊糖途徑中的相關(guān)基因，PFKM、LOC106841113、LOC106828083、PGM1、GPI等基因可能參與肌肉能量代謝的調(diào)控，從而對肉質(zhì)嫩度產(chǎn)生一定的影響。

肌肉中氨基酸含量不僅影響著蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，同時也影響著肉質(zhì)嫩度和風(fēng)味[37]。通常，氨基酸是動物死后早期肌肉的重要能量來源，因為它們都可以降解為檸檬酸鹽循環(huán)的一部分或可以轉(zhuǎn)換為該循環(huán)的一部分的中間化合物[38]，從而改變動物死后早期能量狀態(tài)的差異而影響蛋白水解并有利于肉的嫩化。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中，本研究發(fā)現(xiàn)代謝物腺苷酸基琥珀酸和檸檬酸與RIMKLB、DDO基因有較強的相關(guān)性。RIMKLB基因能夠編碼N-乙酰天冬氨酸谷氨酸合成酶I，并在HT組中上調(diào)。DDO是一種D-天冬氨酸氧化酶，是目前唯一能夠降解雙羧酸D-氨基酸的酶[39]。在此通路中，RIMKLB和DDO均與腺苷酸基琥珀酸和檸檬酸有一定的相關(guān)性，說明這兩個基因可能參與了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中的相關(guān)過程，并對肉質(zhì)嫩度產(chǎn)生了一定的作用。在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，代謝物肌酸與LOC106837908和GAMT基因的相關(guān)性強。肌肉中的肌酸主要以N-磷酸肌酸的形式存在，它是收縮肌肉纖維的主要能量來源[40]，GAMT是肌酸生物合成最后一步的反應(yīng)酶。Rosa等[41]比較了不同鈣蛋白酶基因型內(nèi)洛爾牛的肌肉蛋白質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)GAMT基因與嫩度表型相關(guān)。另外，在胰高血糖素信號通路中，代謝物檸檬酸與PRKAB2基因的負(fù)相關(guān)性強。一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是一種能量穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)器，在對外部應(yīng)激反應(yīng)的能量穩(wěn)態(tài)控制中起著重要作用[42]。AMPK是由催化亞基α和兩個調(diào)節(jié)亞基β和γ組成的異三聚絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其中PRKAB2編碼AMPKβ2亞基[43]。AMPK可以有效的促進(jìn)肌肉對葡萄糖的吸收，保證骨骼肌中的糖原含量，骨骼肌代謝會影響肌肉結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性，進(jìn)一步改變?nèi)赓|(zhì)的嫩度[44]。在此通路中，檸檬酸與PRKAB2基因具有一定的相關(guān)性，并對肉質(zhì)嫩度的調(diào)控具有一定的作用。

4 結(jié) 論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)對不同肉質(zhì)嫩度的廣靈驢的背最長肌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了精氨酸和脯氨酸代謝，甘油磷脂代謝，磷酸戊糖途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及胰高血糖素信號通路可能參與廣靈驢不同肉質(zhì)嫩度之間的調(diào)控，從而揭示了不同肉質(zhì)嫩度的廣靈驢的轉(zhuǎn)錄和代謝響應(yīng)規(guī)律，涉及到PLA2G12A、DGKE、DGKH、GPAM、PFKM、PGM1、GPI、RIMKLB、DDO、GAMT等基因以及1-磷酸核糖、7-磷酸景天庚酮糖、甘油磷酸膽堿、溶血磷脂酰膽堿(18:1(9Z))、膽堿、溶血磷脂酰膽堿(17:0)、溶血磷脂酰膽堿(18:0)、甘油磷?；掖及贰⑾佘账峄晁?、檸檬酸和肌酸等代謝物。該研究結(jié)果有助于解析具有不同背最長肌肌肉嫩度的廣靈驢個體的遺傳差異，為進(jìn)一步研究廣靈驢的分子育種提供了理論依據(jù)。