唐 林，魏大為，汪書哲，雷召雄，高曉茜，王興平，馬燕芬，馬 云

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021)

牛肉具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，富含維生素、礦物質(zhì)、脂肪酸以及各種氨基酸。目前，我國(guó)的牛肉供應(yīng)主要是以地方黃牛為主，如何提高地方黃牛的肌內(nèi)脂肪含量從而改善肉品質(zhì)，是我國(guó)畜牧行業(yè)的重大課題。前期研究表明，牛的飼養(yǎng)環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)水平可以對(duì)肌內(nèi)脂肪含量產(chǎn)生影響，但遺傳調(diào)控是影響肌內(nèi)脂肪含量的決定性因素[1-3]。因此，從基因?qū)用嫣骄考?nèi)脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制意義重大。

ADIG基因是Kim等[4]為了研究脂肪細(xì)胞中新的分子通路而發(fā)現(xiàn)的新基因。研究表明，該基因是脂肪細(xì)胞分化過程中一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因[5]。最近的研究指出，ADIG基因的異位表達(dá)可以增強(qiáng)牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的脂肪積累，并促進(jìn)牛肌肉細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化[6-7]，敲除ADIG基因會(huì)影響脂肪組織的生成[8]。因此，ADIG基因可能在脂肪形成過程中發(fā)揮重要功能。

目前，關(guān)于牛ADIG基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究尚不清楚，本試驗(yàn)以南陽(yáng)牛為研究材料，選擇可能與脂肪形成相關(guān)的ADIG基因?yàn)檠芯繉?duì)象；構(gòu)建牛ADIG基因組織表達(dá)譜；克隆獲得牛ADIG基因啟動(dòng)子序列，確定其核心啟動(dòng)子區(qū)域；結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)調(diào)控牛ADIG基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。為探究ADIG基因在肉牛分子水平上的改良培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

待健康南陽(yáng)公牛((24±2)月齡)屠宰后，迅速采集3頭牛的心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪等7種組織，-80 ℃冰箱保存，同時(shí)采集血液樣本-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 牛不同組織ADIG基因mRNA表達(dá)量檢測(cè)

通過TRIzol法提取3頭牛的肝、心、肺、脾、肌肉、腎及脂肪組織總RNA，質(zhì)量檢測(cè)合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。ADIG基因不同組織的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)以cDNA為模板，設(shè)計(jì)定量引物(表1)進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系：上、下游引物各0.5 μL，TB Green Premix Ex Taq II(2×)10 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)和技術(shù)學(xué)重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物信息

1.3 牛ADIG基因序列分析及蛋白序列進(jìn)化樹構(gòu)建

通過(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得牛ADIG基因序列，結(jié)合Ensembl(https://asia.ensembl.org/index.html)網(wǎng)站，對(duì)牛ADIG基因啟動(dòng)子位置進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。MEGA 5.0軟件分析牛ADIG基因的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建ADIG蛋白質(zhì)的進(jìn)化樹。

1.4 牛ADIG基因啟動(dòng)子克隆

提取南陽(yáng)牛血液基因組DNA，利用啟動(dòng)子全長(zhǎng)引物ADIG-PF和ADIG-PR擴(kuò)增牛ADIG基因的全長(zhǎng)啟動(dòng)子(表2)。體系為50 μL：2×Phanta?Max Master Mix 25 μL，50～100 ng基因組DNA，引物各2 μL，用ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min，4 ℃10 min保存。PCR產(chǎn)物連接T載體，用于后續(xù)6條截短體擴(kuò)增。

1.5 牛ADIG基因啟動(dòng)子關(guān)鍵區(qū)的分析

1.5.1牛ADIG基因啟動(dòng)子逐段缺失片段的克隆 設(shè)計(jì)6條用于牛ADIG基因啟動(dòng)子不同截短片段的擴(kuò)增引物ADIG-F1、ADIG-F2、ADIG-F3、ADIG-F4、ADIG-F5及ADIG-F6，1條固定下游引物ADIG-R0，引物分別添加KpnⅠ和BglⅡ雙酶切位點(diǎn)(表2)。以牛ADIG基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)-2 186/+59片段為模板進(jìn)行啟動(dòng)子逐段缺失片段擴(kuò)增(反應(yīng)體系和程序同“1.4”)，測(cè)序鑒定后用于下一步試驗(yàn)。

表2 牛ADIG基因啟動(dòng)子及其缺失片段克隆引物

1.5.2 牛ADIG基因啟動(dòng)子截短體載體構(gòu)建 使用KpnⅠ和BglⅡ在37 ℃下對(duì)pGL3-Basic載體和6個(gè)截短體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物連接成功后分別命名為：pADIG-1 621/+59、pADIG-1 288/+59、pADIG-850/+59、pADIG-589/+59、pADIG-321/+59和pADIG-79/+59，并用酶標(biāo)儀進(jìn)行純度和濃度測(cè)定。

1.5.3 牛ADIG基因啟動(dòng)子核心區(qū)域鑒定 復(fù)蘇293T細(xì)胞、牛原代脂肪細(xì)胞和3T3-L1細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將重組質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒以24∶1的比例分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞、牛原代脂肪細(xì)胞以及3T3-L1細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒步驟，以pGL3-Basic為對(duì)照，分別檢測(cè)出Firefly luciferase(F)和Renilla luciferase(R)的值，通過(F/R)的值確定牛ADIG基因啟動(dòng)子核心區(qū)域。

1.6 牛ADIG基因啟動(dòng)子關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

通過(http://jaspar.genereg.net和http://gene-regulation.com/pu-b/programs/alibaba2/index.html)預(yù)測(cè)脂肪相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與牛ADIG基因核心啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)置閾值大于90%，預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比并取交集，并對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行標(biāo)注。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，結(jié)果使用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05表示差異顯著，用*表示；P<0.01表示差異極顯著，用**表示。

2 結(jié) 果

2.1 牛不同組織ADIG基因的表達(dá)規(guī)律

南陽(yáng)牛ADIG基因的組織表達(dá)譜如圖1所示。ADIG基因在南陽(yáng)牛肺(P<0.05)、腎(P<0.05)以及皮下脂肪(P<0.01)組織中高表達(dá)。證明，ADIG基因在南陽(yáng)牛脂肪組織中發(fā)揮重要作用。

圖1 南陽(yáng)牛不同組織中ADIG基因的相對(duì)表達(dá)情況

2.2 牛ADIG基因結(jié)構(gòu)及蛋白序列進(jìn)化分析

牛ADIG基因位于13號(hào)染色體(NC_037340.1)上，是一條含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子的全長(zhǎng)為9 869 bp的序列，其蛋白序列由含有N末端和C末端的80個(gè)氨基酸構(gòu)成，N端富含亮氨酸且具有核定位序列(PWSKRP)，C末端富含酸性氨基酸，推測(cè)牛ADIG基因在調(diào)控過程中具有重要功能。以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的牛ADIG基因信息，確定其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)胞嘧啶(C)為+1位置，向上游查找2 245 bp的序列，預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子區(qū)。不同ADIG蛋白質(zhì)序列(山羊、馬和豬)的進(jìn)化樹由MEGA 5.0軟件構(gòu)建。結(jié)果如圖2所示，表明ADIG蛋白在不同物種中同源性較高，尤其在牛和山羊間進(jìn)化保守。

2.3 牛ADIG基因啟動(dòng)子片段擴(kuò)增

據(jù)牛ADIG的啟動(dòng)子序列信息，PCR擴(kuò)增其啟動(dòng)子區(qū)(圖3A)，并將PCR產(chǎn)物與T載體連接，測(cè)序證實(shí)其長(zhǎng)度為2 245 bp且序列正確(圖3B)。

A.牛ADIG基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物；B.ADIG基因pDM-18T載體測(cè)序部分圖譜

2.4 牛ADIG基因核心啟動(dòng)子鑒定

2.4.1 啟動(dòng)子不同截短體載體構(gòu)建 使用ADIG-F1/ADIG-R0～ADIG-F6/ADIG-R0引物擴(kuò)增獲得牛ADIG基因啟動(dòng)子截短體，并連接pGL3-Basic載體，獲得pADIG-1 621/+59、pADIG-1288/+59、pADIG-850/+59、pADIG-589/+59、pADIG-321/+59和pADIG-79/+59重組質(zhì)粒。KpnI和BglII雙酶切鑒定結(jié)果如圖4所示，酶切后獲得2條目的條帶，其中包括4 818 bp空載體及1 680、1 347、909、648、380和138 bp的目的條帶，條帶長(zhǎng)度與預(yù)期一致，重組質(zhì)粒(OD260nm/OD280nm)在1.8～2.0之間，質(zhì)量濃度全部在300 ng·μL-1以上，可用于下一步試驗(yàn)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6.pADIG-1 621/+59、pADIG-1 288/+59、pADIG-850/+59、pADIG-589/+59、pADIG-321/+59和pADIG-79/+59經(jīng)Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切結(jié)果

2.4.2 牛ADIG基因啟動(dòng)子核心區(qū)域的確定 雙熒光素酶報(bào)告基因缺失啟動(dòng)子片段的活性分析表明當(dāng)牛ADIG基因啟動(dòng)子區(qū)-321/-79片段缺失時(shí)，雙熒光素報(bào)告載體pADIG-79/+59在293T細(xì)胞(P<0.05,圖5A)、3T3-L1細(xì)胞(P<0.01,圖5B)和牛原代脂肪細(xì)胞(P<0.05,圖5C)中的活性較pADIG-321/+59都顯著下降。表明，牛ADIG基因5′端上游2 245 bp序列是啟動(dòng)子區(qū)，具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性功能，-321/-79 bp區(qū)域?yàn)榕DIG基因啟動(dòng)子核心區(qū)。

A.逐段缺失片段在293T細(xì)胞中的相對(duì)熒光活性；B.逐段缺失片段在3T3-L1細(xì)胞中的相對(duì)熒光活性；C.逐段缺失片段在牛原代脂肪細(xì)胞中的相對(duì)熒光活性

2.5 牛ADIG基因啟動(dòng)子關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

結(jié)合Genomatix和JASPAR等生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)牛ADIG基因啟動(dòng)子核心區(qū)域(-321/-79 bp)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果如圖6所示，牛ADIG基因啟動(dòng)子核心區(qū)與CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、過氧化物酶體增殖活化受體δ(PPARδ)、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(CREB)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5(STAT5A)和AP-2α等相結(jié)合。表明C/EBPα、PPARδ、CREB、STAT5和AP-2α等對(duì)牛ADIG基因具有重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。

圖6 牛ADIG基因啟動(dòng)子核心區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

3 討 論

ADIG基因是3T3-L1細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過程中篩選獲得的一個(gè)新基因，且證明其只在分化成功后的脂肪細(xì)胞中表達(dá)[4]。對(duì)小鼠各組織定量發(fā)現(xiàn)，ADIG基因在脂肪組織中特異表達(dá)[5]。半定量的結(jié)果顯示，ADIG基因在豬脂肪組織中高表達(dá)，且瘦肉型豬脂肪組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)低于脂肪型豬[9]。敲除ADIG基因后會(huì)抑制小鼠脂肪形成[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，ADIG基因在南陽(yáng)牛肺(P<0.05)、腎(P<0.05)和皮下脂肪(P<0.01)中高表達(dá)，且在不同物種進(jìn)化過程中高度保守，ADIG基因在牛脂肪的沉積過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

本研究檢測(cè)到牛ADIG基因-321/-79 bp為啟動(dòng)子核心區(qū)域，對(duì)其核心區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PPARδ、C/EBPα、CREB、STAT5和AP-2α等5個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子在該區(qū)域具有結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游靶基因具有重要調(diào)控作用，從而對(duì)機(jī)體的生命活動(dòng)產(chǎn)生影響[10]。C/EBPα是C/EBPS家族中的一員[11]，還包括C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε和C/EBPζ等4種亞型[12]，該家族廣泛參與細(xì)胞周期、個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育和體內(nèi)免疫反應(yīng)等基本生命活動(dòng)[13-14]。C/EBPα具有p30kd和p42kd兩種亞型[15]，這兩種亞型都參與各種重要生命活動(dòng)[16]。C/EBPα在脂肪細(xì)胞的分化后期會(huì)顯著性高表達(dá)，成脂標(biāo)志基因也隨之特異性高表達(dá)[17-19]，異位表達(dá)C/EBPα可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的脂肪積累[20-21]，C/EBPα基因敲除小鼠出生后短時(shí)間內(nèi)死亡，且體內(nèi)脂肪含量遠(yuǎn)低于正常小鼠[22-23]。綜上所述，C/EBPα對(duì)脂肪形成具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，牛ADIG基因啟動(dòng)子核心區(qū)有C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)，所以推測(cè)，C/EBPα在牛ADIG基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

PPARδ廣泛分布于全身的各個(gè)組織和器官，參與調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、凝血和其他生理學(xué)功能[24]，激活PPARδ可以提高胰島素敏感性和調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝[25]。脂肪組織中PPARδ可以作為脂肪酸感受器調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和線粒體呼吸等生命活動(dòng)的基因表達(dá)，從而預(yù)防肥胖發(fā)生[26-27]，還有研究發(fā)現(xiàn)，被前列環(huán)素及維甲酸激活的PPARδ具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能[28]。CREB通過與靶基因的cAMP相結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[29]。CREB在細(xì)胞的各種生理學(xué)過程中起關(guān)鍵作用，并參與癌癥和其他疾病的調(diào)節(jié)[30]。研究表明，CREB通過磷酸化激活PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ在脂肪細(xì)胞分化早期發(fā)揮作用[31]，也通過調(diào)節(jié)多種蛋白和激酶對(duì)脂肪細(xì)胞分化后期產(chǎn)生影響[32]。

STAT5、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4和STAT6全部屬于STAT家族[33]，在轉(zhuǎn)錄激活與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[34]。STAT5是葡萄糖和脂肪代謝路徑中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子[35-37]。研究表明，STAT5隨脂肪細(xì)胞的分化穩(wěn)定表達(dá)，干擾STAT5后顯著降低脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)[38]。作為AP-2轉(zhuǎn)錄因子家族中最早期鑒定的轉(zhuǎn)錄因子，AP-2α在細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育，分化和凋亡、軟骨形成以及癌癥等生理疾病調(diào)控中發(fā)揮重要作用[39-40]。研究表明，AP-2α在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中參與電子傳遞、脂肪酸代謝以及協(xié)同調(diào)控脂肪細(xì)胞分化[41]，AP-2α通過負(fù)調(diào)控C/EBPα抑制脂聯(lián)素表達(dá)[42-43]。綜上，C/EBPα、PPARδ、CREB、STAT5和AP-2α在個(gè)體各種疾病及生命活動(dòng)和脂肪沉積過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

本研究表明，牛ADIG基因分別在肺、腎以及皮下脂肪組織中均有表達(dá)且在皮下脂肪中極顯著高表達(dá)；其核心區(qū)域在-321/-79 bp；結(jié)合生物信息學(xué)初步鑒定C/EBPα、PPARδ、CREB、STAT5和AP-2α轉(zhuǎn)錄因子對(duì)ADIG基因的轉(zhuǎn)錄活性有重要的調(diào)控作用。以上結(jié)果為探究ADIG基因在肉牛分子水平上的改良培育提供了理論依據(jù)。