黃良永，劉佳麗，杜士明△

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院·武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

婦安消疹洗液在太和醫(yī)院臨床使用近20年，療效確切，臨床主要用于清潔陰道和治療真菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎、濕疹丘疹性蕁麻疹等癥［1-2］。其現(xiàn)行質(zhì)量標準中尚無含量測定項，文獻報道采用高效液相色譜（HPLC）法分別測定蒙花苷、落新婦苷、蛇床子素、苦參堿、氧化苦參堿等的含量［3-7］。為完善該制劑的質(zhì)量標準和考察其質(zhì)量的穩(wěn)定性，本研究中參考文獻［8-20］，采用HPLC梯度洗脫法-雙波長檢測法［21］測定了10批婦安消疹洗液的HPLC圖，分析得到HPLC特征指紋圖譜，確定了5個已知成分，并初步確認特征峰的原藥材歸屬，基本反映了原藥材的組成及質(zhì)量［22-23］?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀，包括LPG-3400泵、WPS-3000SL analyt進樣器、TCC-3000型柱溫箱、VWD-3400型四波長檢測器（美國ThermoFisher公司）；KM-36C型超聲清洗機（廣州市科潔盟實驗儀器有限公司）；AUW120D型電子分析天平（日本Shimadzu公司，d=0.01 mg）；GWA-UN Pure Water system型超純水機（北京普析通用儀器公司）。

1.2 試藥

婦安消疹洗液10批（醫(yī)院制劑室提供，批號分別為20190815，20190920，20191106，20200106，20200511，20200720，20200927，20201214，20210104，20210301，編號分別為S1～S10）；綠原酸對照品（批號為110753-201817，含量96.8%），苦參堿（批號為110805-200508，含量100%），氧化苦參堿（批號為110780-201007，含量92.3%），蒙花苷對照品（批號為111528-201107，含量86.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；落新婦苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為29838-67-3，含量98%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。飲片野菊花（批號為170401）、苦參（批號為170201）、漏蘆（批號為170301）、土茯苓（批號為170301）、蛇床子（批號為170401），均購自湖北清大中藥飲片公司；白礬（湖北神農(nóng)本草中藥飲片公司，批號為170401）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：OMNIBond HPLC Orca C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B，含0.1%庚烷磺酸鈉），梯度洗脫（-5～10 min時10%A，10～30 min時14%A，30～45 min時20%A，45～60 min時30%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm（-5～17 min），225 nm（17～26 min），330 nm（26～70 min）；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：分別取5種對照品適量，精密稱定，分別置容量瓶中，加甲醇超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）處理2 min，用甲醇定容，即得蒙花苷、落新婦苷、苦參堿、氧化苦參堿、綠原酸質(zhì)量濃度分別為22.0，590.0，720.0，530.0，980.0μg/mL的單一 對 照品溶液。

供試品溶液：精密量取樣品25 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲處理30 min，放冷，用甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

藥材對照溶液：按處方比例分別稱取野菊花17.4 g、苦參14.0 g、漏蘆14.0 g、土茯苓10.4 g、蛇床子8.0 g，精密稱定，分別置三角燒瓶中，按婦安消疹洗液制備工藝，制成100 mL的單一溶液。精密量取25 mL，分別置50 mL容量瓶中，按供試品溶液制備方法制得單一藥材對照溶液。取白礬3.4 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用甲醇定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得白礬對照藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：分別精密量取2.2項下溶液各10μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中的色譜峰完全分離；對照品溶液色譜圖中，在與供試品溶液色譜相應(yīng)位置上有5種成分的色譜峰，保留時間完全一致，依次為綠原酸、苦參堿、氧化苦參堿、落新婦苷、蒙花苷的峰（峰號依次為3，5，7，12，18），各成分峰與其相鄰峰完全分離，詳見圖1。5種藥材對照溶液色譜圖中，在與供試品溶液色譜相應(yīng)峰可找到各自的歸屬（白礬屬無機礦物質(zhì)，故其溶液中無色譜峰），詳見圖2。

圖1 高效液相色譜圖3.Chlorogenic acid 5.Matrine 7.Oxymatrine 12.Astilbin 18.Buddleoside A.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

圖2 供試品溶液與藥材對照溶液的色譜圖比較1.Test solution 2.Reference solution of Sophorae Flavescentis Radix 3.Reference solution of Rhapontici Radix 4.Reference solution of Smilacis Glabrae Rhizoma 5.Reference solution of Cnidii Fructus 6.Reference solution of Chrysanthemi Indici Flos 7.Reference solution of AlumenFig.2 Comparision of HPLC chromatograms of test solution and reference solution

精密度試驗：取2.2項下供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定6次，以落新婦苷峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時間的R SD均小于0.39%（n=6），相對峰面積的RSD均小于0.63%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以落新婦苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RS D均小于0.62%（n=5），相對峰面積的R SD均小于1.41%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為S5）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定。以落新婦苷為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各共有峰相對峰面積的R S D均小于0.51%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜研究

指紋圖譜建立與相似度分析：取10批樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，10批樣品的指紋圖譜見圖3。根據(jù)結(jié)果，采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版）”，設(shè)編號S5樣品的色譜圖為參照圖譜，其他樣品色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，設(shè)時間窗寬度為0.2，選用平均值法，采用自動匹配法生成共有特征圖譜R，即得婦安消疹洗液共有模式的對照指紋圖譜（見圖4）。將10批樣品的指紋圖譜均導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版）”相似度評價系統(tǒng)軟件，計算相似度。結(jié)果見表1。

表1 10批樣品相似度評價結(jié)果Tab.1 Similarity of HPLC fingerprints of 10 batchs of samples

圖3 10批樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.3 Superimposed HPLC fingerprints of 10 batches of samples

已知成分確認：將共有特征圖譜R與對照品溶液色譜圖的色譜峰保留時間比較，可知3號、5號、7號、12號、18號峰依次為綠原酸、苦參堿、氧化苦參堿、落新婦苷、蒙花苷。詳見圖4。

圖4 樣品的高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.4 Reference HPLC fingerprints of 10 batches of samples

參照峰選擇：12號峰處于色譜圖的中間位置，與相鄰峰能完全分離，峰面積穩(wěn)定，且為已知成分，故以其為參照峰。將其相對保留時間和峰面積設(shè)為1，計算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積值及RS D值。詳見表2和表3?？梢?，各批次供試品各成分峰的相對保留時間較穩(wěn)定，各成分可被穩(wěn)定檢出；表明不同批次樣品中部分成分的含量相差較大，可能是由于不同來源的原藥材質(zhì)量差異較大。

表2 10批樣品高效液相色譜指紋圖譜共有峰的相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks in HPLC finger?prints of 10 batches of samples

表3 10批樣品高效液相色譜指紋圖譜共有峰的相對峰面積Tab.3 Relative peak area of common peaks in HPLC finger?prints of 10 batches of samples

3 討論

婦安消疹洗液屬中藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，其中含有大量水溶性成分和部分脂溶性成分，為了最大程度地提取兩類成分和除去植物蛋白等雜質(zhì)，預(yù)試驗中以50%，60%，80%甲醇為溶劑，分別超聲20，30，40，60 min。結(jié)果顯示，50%甲醇提取效果較好，超聲處理30 min和60 min的提取效果一致，故以50%甲醇超聲處理30 min為提取方法。2020年版《中國藥典（一部）》中蒙花苷、苦參堿、氧化苦參堿、落新婦苷的檢測波長分別為334，225，291 nm；預(yù)試驗中在334，225，291，277，254 nm等單波長處分別對供試品進行檢測。結(jié)果顯示，330 nm波長處測得的色譜圖中峰的信息量較多，且峰面積相對較大，但婦安消疹洗液中的主要成分苦參堿及氧化苦參堿峰未檢出；將17～26 min時間段的檢測波長改為225 nm，結(jié)果顯示，在此檢測波長下，對照品及供試品中能檢測出苦參堿和氧化苦參堿成分，故將檢測波長改為時間程序控制下的雙波長檢測。預(yù)試驗中以乙腈-0.1%磷酸溶液進行梯度洗脫，但部分色譜峰有拖尾現(xiàn)象，將0.1%磷酸溶液中加入0.1%庚烷磺酸鈉，采用同樣的梯度洗脫程序，色譜圖中各色譜峰對稱，完全分離，峰信息量多。

本研究中所得婦安消疹洗液的指紋圖譜共標識出20個共有峰，10批供試品溶液的色譜圖與共有特征圖譜的相似度均大于0.9，表明所建立的HPLC指紋圖譜可靠。20個特征峰的相對保留時間的RSD為0.08%～0.52%，均小于2.0%，說明不同批次的婦安消疹洗液有效成分的保留時間穩(wěn)定，所含成分基本一致，但相對峰面積的RS D在15.77%～63.58%之間波動，說明不同批次的供試品中各有效成分含量差異大，與生產(chǎn)中原藥材的來源差異有關(guān)，為了保證婦安消疹洗液臨床使用的穩(wěn)定性和有效性，必須保證原藥材的質(zhì)量與來源統(tǒng)一。HPLC指紋圖譜技術(shù)可用于全面控制該制劑的質(zhì)量。本研究中所建立的婦安消疹洗液的HPLC指紋圖譜明確的5個共有峰成分分別為綠原酸、苦參堿、氧化苦參堿、落新婦苷、蒙花苷，可為制劑質(zhì)量標準的提高和同時測定5種指標性成分提供參考。