盧 興，王艷寧，黃 玲，朱海燕，張 迪，張韶湘，黎為能

（1.廣西壯族自治區(qū)南寧市第一人民醫(yī)院，廣西 南寧 530022；2.云南省昆明市中醫(yī)院，云南 昆明 650504；3.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533099）

苦柏洗劑是南寧市第一人民醫(yī)院協(xié)定處方，由黃柏、苦參、紫草、澤蘭、地膚子等8味中藥材組方，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)止癢等功效。其水煎液外洗，可治療濕疹、手腳癬、皮膚瘙癢等皮膚疾病，但其煎煮工藝尚無(wú)系統(tǒng)性研究報(bào)道。正交試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于制劑生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好［1-2］，但其評(píng)價(jià)指標(biāo)多為人工賦權(quán)，有欠客觀，信息熵賦權(quán)法中的多評(píng)價(jià)指標(biāo)較好地彌補(bǔ)了該缺點(diǎn)［3-4］。信息熵賦權(quán)是根據(jù)系統(tǒng)某個(gè)屬性的變異程度大小賦權(quán)，其屬性變異程度與該屬性的信息熵呈反比，其提供的信息量與權(quán)重呈正比［5］。本研究中以加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素，以鹽酸小檗堿含量及得膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算各指標(biāo)的信息熵及權(quán)重系數(shù)，并進(jìn)行綜合評(píng)分，對(duì)苦柏洗劑水提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；FA2004N型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）；LD4-2A型低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110713-201814，含量86.7%）；甲醇、乙腈、無(wú)水乙醇均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為超純水；苦參藥材（批號(hào)為2002022）、黃柏藥材（批號(hào)為1903114）、紫花地丁藥材（批號(hào)為1904011）、白鮮皮藥材（批號(hào)為1908060）、土茯苓藥材（批號(hào)為1904046）、澤蘭藥材（批號(hào)為1905030）、紫草藥材（批號(hào)為1908005），均購(gòu)自廣西張益堂中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 得膏率測(cè)定［6］

取樣品貯備液80 mL，4 000 r/min離心15 min，精密量取上清液50 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃下烘干至恒重，取出，置干燥器中30 min，迅速稱定干膏質(zhì)量，計(jì)算得膏率。得膏率（%）=浸膏質(zhì)量×（濃縮液總體積/量取液體積）/藥材質(zhì)量×100%。

2.2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：GL Science Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液（40∶60，V/V；pH 6.33）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2.2 溶液制備

取干燥至恒重的鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。取浸膏［7-8］，加水溶解并定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按苦柏洗劑處方工藝制備缺黃柏的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果分離度＞1.5，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿計(jì)不低于3 500，陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明專屬性良好。詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Berberine hydrochloride A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.3，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得系列對(duì)照品溶液。精密量取20μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=101 136X+57 101（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在7.5～37.5μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測(cè)限考察：分別精密量取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為10∶1和3∶1時(shí)的質(zhì)量濃度分別記作定量限和檢測(cè)限。結(jié)果鹽酸小檗堿的定量限和檢測(cè)限分別為1.86μg/mL和0.56μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)3 d測(cè)定及1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果日間和日內(nèi)精密度試驗(yàn)中鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.78%（n=3）和1.31%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，1，8，24，48，72 h，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的R S D為2.40%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取樣品適量，共6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RS D為2.49%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以加水量（因素A）、煎煮時(shí)間（因素B）、煎煮次數(shù)（因素C）為考察因素［9］，應(yīng)用信息熵理論對(duì)鹽酸小檗堿含量、得膏率進(jìn)行矩陣處理，計(jì)算得兩者的客觀權(quán)重系數(shù)［10-11］，再以這2個(gè)系數(shù)的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)。因素與水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 因素與水平Tab.2 The factors and levels

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n=9）Tab.3 Design and results of the orthogonal test（n=9）

2.3.2 數(shù)據(jù)處理［12-13］

1）建立原始評(píng)價(jià)矩陣（X）

以“小檗堿含量、得膏率”的結(jié)果建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣（X）。

2）建立“概率”矩陣

根據(jù)公式計(jì)算Pij，將原始評(píng)價(jià)矩陣轉(zhuǎn)為“概率”矩陣（P）。

3）各指標(biāo)的信息熵值及權(quán)重系數(shù)

由“概率”矩陣計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的信息熵值（Hi）及權(quán)重系數(shù)（Wi）。

4）綜合評(píng)價(jià)

對(duì)“概率”矩陣（P）的數(shù)值進(jìn)行加權(quán)處理，計(jì)算綜合評(píng)分（Mi），Mi=P1i W1+P2iW2，其中，P1i為“概率”矩陣（P）中第1行第i列數(shù)值，W1為小檗堿含量的權(quán)重系數(shù)即（0.726 5）；P2i為“概率”矩陣（P）中第2行第i列數(shù)值，W2為得膏率的權(quán)重系數(shù)（即0.273 5）。結(jié)果見(jiàn)表3。

5）方差分析

依據(jù)綜合評(píng)分（Mi）對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析可知，3個(gè)因素對(duì)鹽酸小檗堿含量和得膏率綜合評(píng)分值影響大小排序?yàn)榧逯蟠螖?shù)＞煎煮時(shí)間＞加水量，但對(duì)綜合評(píng)分均無(wú)顯著影響（P＞0.05），故選擇A2B3C3為苦柏洗劑的最佳提取工藝，即加10倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。詳見(jiàn)表4。

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 ANOVA results

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)化后的提取工藝，以處方1/10量準(zhǔn)確稱取藥材3份，平行試驗(yàn)3次，結(jié)果得膏率、鹽酸小檗堿含量、綜合評(píng)分的RSD均小于2.35%。詳見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of the validation test（n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

預(yù)試驗(yàn)中以2020年版《中國(guó)藥典》（一部）“黃柏”含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定鹽酸小檗堿含量，但分離效果欠佳，可能由于中藥復(fù)方制劑水提取液的成分復(fù)雜且易相互干擾。因而在選擇流動(dòng)相時(shí)，參考文獻(xiàn)［14］中的方法，用乙腈-0.033 moL/L磷酸二氫鉀（40∶60，V/V）為流動(dòng)相，并調(diào)pH為6.33，結(jié)果目標(biāo)成分峰峰形對(duì)稱，且與其他成分峰之間分離良好。在選擇測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)，進(jìn)行200～700 nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果265 nm和345 nm波長(zhǎng)處均有明顯吸收，但345 nm波長(zhǎng)處的其他成分峰產(chǎn)生的干擾較小，故選擇345 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇

本研究中選擇鹽酸小檗堿為提取工藝的含量測(cè)定指標(biāo)，因黃柏是苦柏洗劑的君藥之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃柏所含鹽酸小檗堿對(duì)溶血性鏈球菌、葡萄球菌等細(xì)菌及部分常見(jiàn)致病性真菌和流感病毒等病原體均有一定抑制作用［15］。但中藥成分復(fù)雜，以單一指標(biāo)評(píng)價(jià)提取工藝有一定局限，而結(jié)合得膏率，以多指標(biāo)評(píng)價(jià)中藥提取工藝，更具合理性［16］。

3.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)處理

本研究中的評(píng)價(jià)指標(biāo)為鹽酸小檗堿含量和得膏率。預(yù)試驗(yàn)中按60%和40%給上述2個(gè)指標(biāo)賦權(quán)，但通過(guò)應(yīng)用信息熵賦權(quán)法，將原始評(píng)價(jià)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成“概率”矩陣計(jì)算信息熵值及權(quán)重系數(shù)，得到2個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)分別為72.65%和27.35%，說(shuō)明主觀賦權(quán)與應(yīng)用信息熵賦權(quán)間有一定差異。信息熵賦權(quán)法是基于試驗(yàn)數(shù)據(jù)，客觀地反映試驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果的影響，能較真實(shí)地反映試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變化，與主觀賦權(quán)相比更精確、客觀和科學(xué)［17］。

從方差分析結(jié)果來(lái)看，3個(gè)因素均對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響，結(jié)合極差分析結(jié)果及綜合評(píng)分得分，從節(jié)約能耗的角度來(lái)看，A2B3C3為最佳提取工藝，A2B1C3也不失為較優(yōu)方案。今后將結(jié)合臨床療效對(duì)2個(gè)工藝進(jìn)行考察。另外，因中藥有效成分的物質(zhì)基礎(chǔ)較復(fù)雜，應(yīng)進(jìn)行多成分測(cè)定及評(píng)價(jià)才可能在提取過(guò)程中盡可能多地保留有效成分［18-19］。本研究中以鹽酸小檗堿含量與得膏率為考察指標(biāo)，結(jié)果較局限，還應(yīng)增加苦參堿、氧化苦參堿等有效成分的考察，以完善苦柏洗劑的提取工藝。

綜上所述，基于信息熵賦權(quán)法優(yōu)選的苦柏洗劑水提工藝穩(wěn)定、可行。