于熹微，趙亮

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院；2.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州121000)

化療被作為當今腫瘤治療的主要手段，由于藥物治療耐藥性(multiple drug resistance，MDR)而限制了化療的有效性，MDR機制是在細胞膜上高表達跨膜轉運蛋白，即P-糖蛋白(P-gp)[1-2]。P-gp這種膜轉運蛋白能夠依賴于能量將藥物轉運到胞外，干擾藥物發(fā)揮作用。本文要以P-gp為靶點克服耐藥過程[3]。環(huán)孢菌素A是第一代以P-gp為靶點的抑制劑，能夠與藥物競爭P-gp的結合位點，減少藥物被排出，提高細胞內的藥物濃度。借助納米技術，將抑制劑高效低劑量的遞送到腫瘤細胞，同時增加藥物敏感性在腫瘤治療中發(fā)揮更大的應用價值[4]。

作為表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶結構域的選擇性抑制劑，厄洛替尼(erlotinib)被廣泛用于人類癌癥的化療[5]。殼聚糖(chitosan，Cs)是甲殼素(chitin)脫乙?；奶烊粔A性多糖，已經被廣泛應用，作為納米材料遞送藥物，效果極佳[6]。在本課題中，我們制備了能夠同時包裹抑制劑CsA和藥物erlotinib的共載殼聚糖納米粒，旨在驗證共載納米粒是可以增加抗腫瘤藥物的敏感性[7]。探索共載納米粒對耐藥Hela細胞的抗腫瘤效果，預示納米藥物輸送系統(tǒng)將對逆轉耐藥具有很大的貢獻[8-9]。

1 儀器與材料

AL-204型精密電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)、HH-M8數顯恒溫水浴鍋(金壇市城西春蘭實驗儀器廠)、DF-1型集熱式磁力攪拌器(金壇市金城國勝實驗儀器廠)、Nano ZS90 納米粒度儀(英國Malvem公司)、JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)、Zeta電位及分子量分析儀(英國Malvem公司)、低溫高速離心機(Sigma公司)、UV-2450紫外可見分光光度計(日立島津公司)、XD-101型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

厄洛替尼(純度98%，批號1241608，美國Sigma公司)、環(huán)孢菌素A(純度98%，批號Y0002292，美國Sigma公司)、殼聚糖(脫乙酰度：80%，海信生物制品有限公司)、冰醋酸(TEDIA公司)、多聚磷酸鈉(天津天河試劑)、CLARK血清(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、RAPI-1640培養(yǎng)液(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、胰蛋白酶(biosharp公司)、四氮唑溴鹽(MTT)、耐厄洛替尼宮頸癌Hela細胞株(錦州醫(yī)科大學生命科學研究院)。

2 實驗方法

2.1 CsA/erlotinib NPs的制備

2.1.1 Cs NPs的制備：采用離子交聯法制備納米粒。精密稱取35 mg殼聚糖溶解于冰醋酸中，室溫下攪拌15 min，在60 ℃進行充分溶解，直至溶脹完全冷卻至室溫。于3000 r/min下，離心10 min，除去殼聚糖冰醋酸溶液中的雜質。用0.22 μm微孔濾器對殼聚糖溶液進行濾過除菌。精密量取殼聚糖溶液于錐形瓶中，在500 r/min的磁力攪拌下用輸液器緩慢滴加1 mg/mL的多聚磷酸鈉溶液保持30滴/分鐘的速度，直至有乳光出現，停止滴加TPP，繼續(xù)攪拌30 min，即得空白殼聚糖納米粒(Cs NPs)懸液。將懸液于12 000 r/min下，離心25 min，棄去上清液，超純水洗滌納米粒后，再次離心回收沉淀，置于真空冷凍干燥機，冷凍干燥48 h，得到Cs NPs。

2.1.2 CsA/erlotinib NPs的制備：精密稱取35 mg殼聚糖溶解于冰醋酸中，室溫下攪拌15 min，在60 ℃進行充分溶解，直至殼聚糖溶脹完全冷卻至室溫。于3000 r/min下，離心10 min，除去殼聚糖冰醋酸溶液中的雜質。用0.22 μm微孔濾器對殼聚糖溶液進行濾過除菌。精密量取殼聚糖溶液于錐形瓶中，在500 r/min的磁力攪拌下緩慢滴加含有CsA(10、15、20 μg/mL)與erlotinib(0.5、1、2 mg/mL)的TPP溶液，保持每分鐘30滴的速度進行滴加，直至溶液有乳光出現，停止滴加，繼續(xù)攪拌30 min，即制得CsA /erlotinib殼聚糖納米粒懸液。將懸液于12 000 r/min下，離心25 min，棄去上清液，超純水洗滌納米粒后，再次離心回收沉淀，最后經冷凍干燥既得CsA/erlotinib NPs。

2.2 表征

2.2.1 TEM透射電鏡：JEM-1200EX透射電子顯微鏡觀察CsA/erlotinib NPs的形態(tài)。

2.2.2 粒徑和Zeta電位的測定：取超純水適量將納米粒凍干粉末復溶，Nano ZS90納米粒度分析儀對CsA/erlotinib NPs進行粒徑和Zeta電位分析。

2.3 體外響應性釋放實驗

pH響應性體外釋放度考察：使用pH為5.8和7.4磷酸鹽緩沖液作為釋放介質，考察CsA/erlotinib NPs在不同pH介質中的釋放程度。

2.4 細胞實驗

2.4.1 細胞培養(yǎng)：將Hela(耐erlotinib)細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代細胞。

2.4.2 細胞攝取實驗：采用熒光定量分析erlotinib和CsA/erlotinib NPs的細胞攝取。調整Hela細胞數目為1×106個/毫升后接種于96孔板內，孵育24 h。加入最終濃度為1 μg/mL的erlotinib及CsA/erlotinib NPs，并使用酶標儀檢測在激發(fā)波長為495 nm處FITC的熒光強度。通過計算細胞從erlotinib和CsA/erlotinib NPs中攝取的熒光強度與兩者的初始熒光強度的比值來測定在3、6、9、12 h erlotinib和CsA/erlotinib NPs的相對攝取比率。

2.4.3 細胞毒性實驗：調整Hela細胞數目為1×106個/毫升后接種于96孔板內，孵育24 h。按照Cs NPs、free erlotinib、free erlotinib and CsA、erlotinib NPs、和CsA/erlotinib NPs的順序，用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度梯度，每孔100 μL加入到96孔板中，同時預留空白培養(yǎng)基作為調零孔，設置6個復孔。繼續(xù)孵育24 h，將MTT(5 mg/mL)按每孔20 μL與培養(yǎng)基80 μL的比例加入到96孔板中，孵育4 h,然后棄去培養(yǎng)液，各孔加入200 μL DMSO，置于酶標儀上在OD=490 nm處檢測吸光度值對細胞活率定量分析。

3 結 果

3.1 CsA/erlotinib NPs的制備

首先采用離子交聯劑TPP使Cs能組裝成Cs NPs，確定好最適配比，即CsA為15 μg/mL，殼聚糖為3.5 mg/mL，厄洛替尼為1 mg/mL的濃度，利用離子交聯法將CsA和erlotinib加入到溶脹完全的殼聚糖中，經交聯后能夠很好實現共載。

3.2 表征

3.2.1 TEM透射電鏡：采用TEM對制備的CsA/erlotinib NPs的形態(tài)進行分析，可以觀察到所制備共載納米粒形態(tài)緊致呈球形，外觀均一，分散性良好，見圖1。

圖1 CsA/erlotinib NPs電鏡圖

3.2.2 粒徑和Zeta電位的測定：所得納米粒的粒徑大小均一，分布圖形可見峰形勻稱，粒徑主要集中在100 nm左右，符合納米粒的粒徑要求，見圖2。

圖2 CsA/erlotinib NPs粒徑分布圖

包封率CsA為(85.3±0.2)%，erlotinib為(88.8±3.1)%以及多分散指數為0.24±0.06，結果可以看出所制備納米粒共載效果良好，見表1。

3.3 體外響應性釋放實驗

pH響應性釋放實驗：erlotinib在48 h內幾乎完全釋放?？疾煺w釋放結果，發(fā)現藥物釋放模式呈pH依賴性，在pH=5.8條件下迅速釋放，但在pH=7.4條件下緩慢釋放。說明共載納米粒在弱酸性環(huán)境下更易釋放，這將有利于納米粒選擇性的在腫瘤酸性環(huán)境下釋放出內容物。同樣CsA在納米粒中的釋放均能在48 h內從納米粒中釋放到緩沖液中，釋放度考察良好，見圖3。

3.4 細胞實驗

3.4.1 細胞攝取實驗：當使用相同濃度的erlotinib和CsA/erlotinib NPs處理細胞時，erlotinib在前3 h內被細胞幾乎完全攝取呈飽和狀態(tài)，攝取率為83.2%，相反，CsA/erlotinib NPs表現出較好的攝取程度，緩慢且呈時間依賴性累積攝取持續(xù)達12 h，攝取率也能達到79.8%，表明Hela細胞對CsA/erlotinib NPs攝取與erlotinib相比無明顯差異，這將有利于保證erlotinib與CsA被順利的遞送到Hela細胞內，發(fā)揮藥物抑制細胞增值的作用，進一步發(fā)揮抑制藥物外排而克服耐藥的發(fā)生，見圖4。

CsA/erlotinib NPs在磷酸鹽緩沖液(pH 5.8和pH 7.4，37 ℃)中48 h體外釋放分布圖

3.4.2 細胞毒性實驗：Cs NPs對細胞幾乎沒有毒性，2.0 μg/mL Cs NPs作用細胞經過24 h后，細胞存活率仍超過95%，CsA/erlotinib NPs組半數抑制濃度(IC50)為14.5 μg/ mL，表現出對耐erlotinib 的Hela較明顯的抑制增殖作用，呈濃度-時間依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，erlotinib的IC50為25.3 μg/ mL，結果大于共載納米粒組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而游離組效果不甚理想，這可能因為藥物裸露在外，缺少殼聚糖納米載體保護易被細胞排出，導致細胞內有效濃度降低。說明當兩者被包封于Cs中時，能夠被保護不被外排，進而發(fā)揮顯著抑制增殖效果，見圖5。

表1 CsA /erlotinib NPs的表征參數

4 討 論

MDR機制介導耐藥的過程主要是細胞失去對傳統(tǒng)化療藥物的敏感性，導致療效不理想。目前研究對MDR形成的主要原因是跨膜轉運蛋白介導的藥物外排。腫瘤內部特殊微環(huán)境、上皮-間質細胞轉化、細胞抗凋亡等因素也是成為耐藥的誘因[10]。借助有效手段去抑制藥物被泵出胞外這將成為克服耐藥的重點[11]。選擇天然有機高分子材料的殼聚糖作為載體，探討其共包載erlotinib與CsA后對erlotinib作用發(fā)生的變化，在大量遞送erlotinib入胞后，借助CsA選擇性競爭P-糖蛋白的結合位點，使得更多erlotinib不被細胞轉運出胞外[12]。

本研究成功制備了CsA/erlotinib NPs，將抗腫瘤經典藥物erlotinib和藥物外排抑制劑CsA一同包載于穩(wěn)定的殼聚糖中成為功能型載藥納米粒，體外釋放度結果表明CsA/erlotinib NPs能夠呈pH響應性藥物釋放特性，共載納米粒在pH為5.8時釋放較為迅速體現出納米粒在腫瘤弱酸性環(huán)境下釋放的特點，進而能夠靶向腫瘤細胞迅速釋放。攝取實驗能夠直觀發(fā)現納米粒被細胞攝入這一主動過程，呈時間依賴性累積，包裹于殼聚糖納米粒中的erlotinib能夠順利被細胞攝入，入胞后CsA從中釋放，抑制細胞的外排作用，使同載的erlotinib能夠更多的滯留于細胞中發(fā)揮作用，與游離組藥物相比幾乎無明顯攝取差異，細胞實驗結果表明CsA/erlotinib NPs對耐藥Hela細胞比erlotinib具有更顯著的細胞毒性。

圖4 erlotinib和CsA/erlotinib NPs在Hela細胞中的熒光定量

圖5 Cs NPs及CsA/erlotinib NPs對耐藥Hela的細胞活力

綜上所述，CsA/erlotinib NPs能夠將二者同時靶向到腫瘤部位，實現共載后能夠增加erlotinib的敏感性，將有助于克服宮頸癌化療時出現的耐藥現象，增加了化療藥物抗腫瘤的效果，這將為以后新藥開發(fā)提供新研究思路。