伍志通，葉慧芬，向文耀(貴港市人民醫(yī)院.檢驗(yàn)科，.感染科，廣西貴港 537100)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六大最常見的惡性腫瘤和第三大癌癥死亡原因，中國(guó)是世界上HCC發(fā)病率最高的國(guó)家[1]。遺傳因素特別是基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。近年研究表明，一些基因的SNP與HBV相關(guān)性HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[2-3]。

內(nèi)脂素(visfatin)是一種在內(nèi)臟脂肪組織中高表達(dá)的脂肪細(xì)胞因子，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過基因篩查發(fā)現(xiàn)，人類visfatin基因存在多個(gè)SNP位點(diǎn)，已有研究表明visfatin rs61330082、rs2505568等SNP與膀胱癌[4]、食管癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]、胰腺癌[7]等多種癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。研究表明，visfatin rs61330082基因多態(tài)性可能與廣西壯族人群HBV相關(guān)HCC風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)[8]。然而，visfatin rs13237989基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)、HBV相關(guān)肝硬化(liver cirrhosis, LC)和HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是否相關(guān)，目前尚未見報(bào)道。本研究評(píng)估visfatin rs13237989基因多態(tài)性與CHB、HBV相關(guān)LC和HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，以期為HCC的早期預(yù)測(cè)提供一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 選取2019年8月至2019年11月貴港市人民醫(yī)院收治的434例無血緣關(guān)系且連續(xù)入選的HBV相關(guān)性肝病患者。其中，CHB 140例，HBV相關(guān)性LC 143例，HBV相關(guān)性HCC 151例。所有患者乙肝病毒表面抗原(HBsAg)檢測(cè)呈陽(yáng)性超過6個(gè)月。CHB組和LC組患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，HCC組患者符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017 年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。CHB定義為HBV DNA陽(yáng)性且血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)在6個(gè)月內(nèi)持續(xù)升高。隨機(jī)選取同期在本院體檢中心進(jìn)行常規(guī)體檢的132名健康志愿者作為對(duì)照組。所有健康受試者均未感染HBV，肝功能檢查正常。本研究獲得研究對(duì)象知情同意，并經(jīng)過貴港市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(GYLLPJ-20200622-08)。

1.2主要儀器和試劑 梯度PCR儀Easy Cycler(德國(guó)AnalytikJena公司)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)5200Multi(上海天能公司)；3730XL型測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)。AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒(康寧生命科學(xué)公司)；Hotstart HiTaq DNA聚合酶(上海生工公司)；dNTP(加拿大Fermentas公司)；SNaPshot Multiplex Kit(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；SAP酶和ExoⅠ酶(哈爾濱?；?。

1.3SNP位點(diǎn)的選擇 檢索基因多態(tài)性的NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)，查閱visfatin SNP的種類，選擇在中國(guó)人群次要等位基因頻率(MAF)>0.05且已有報(bào)道或能引起機(jī)體生物學(xué)效應(yīng)的SNP。最終選取rs13237989作為廣西地區(qū)HBV相關(guān)性HCC的研究位點(diǎn)。

1.4DNA提取和SNP分型 收集研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，采用AxyPrep DNA提取試劑盒提取DNA。依據(jù)GenBank收錄的visfatin基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并由廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。PCR擴(kuò)增上游引物序列為5′-GCAATAGAAGCCAAATGAG

A-3′，下游引物序列為5′-ATTATTTAGCCTCCTCCC

TT-3′ 。用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增目的DNA序列，擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10 μL，包含5×buffer(15 mmol/L Mg2+) 2 μL，Solution I(10×)1 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 0.8 μL，HotStar HiTaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 15 min；15個(gè)循環(huán)(94 ℃ 40 s，63 ℃開始每循環(huán)遞減0.5 ℃ 1 min，72 ℃ 8 min)；25個(gè)循環(huán)(94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min)；72 ℃ 8 min。對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，反應(yīng)體系包含3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，10×SAP Buffer 0.4 μL，SAP酶(5 U/μL) 0.2 μL，10×ExoI Buffer 0.4 μL，ExoI酶(20 U/μL) 0.05 μL。37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃保溫15 min以滅活SAP和ExoI酶。使用多重單堿基延伸技術(shù)(SNaPshot)確定rs13237989的基因型，以純化后的PCR產(chǎn)物作為SNaPshot PCR的模板進(jìn)行反應(yīng)，配制反應(yīng)混合液5 μL，其中包括2 μL PCR反應(yīng)液，1 μL SNaPshot Pooled PCR產(chǎn)物，1 μL延伸引物，ddH2O補(bǔ)足至5 μL。SNaPshot PCR延伸引物由廣州擎科公司進(jìn)行合成，序列為5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACCACTGCAATAAAGCAAGTCA-3′。PCR反應(yīng)條件為：96 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)(96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)，保溫溫度為4 ℃。在5 μL上述SNaPshot PCR產(chǎn)物中加入0.5 U SAP，震蕩混勻，37 ℃保溫1 h，75 ℃失活15 min。然后將純化后的SNaPshot PCR產(chǎn)物送廣州擎科公司用3730XL型DNA序列檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)序，使用GeneMarkerV1.91軟件分析結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行。采用方差分析、χ2檢驗(yàn)比較基線資料(年齡、性別)。采用擬和優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析各組中實(shí)際檢測(cè)的基因型頻率分布是否符合哈-溫(Hardy-Weinberg，HWE)平衡定律，P>0.05被認(rèn)為各基因型的分布符合HWE平衡。采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析各基因型、等位基因頻率在各組中分布是否有差異。采用非條件Logistic回歸分析，校正年齡、性別等因素，計(jì)算OR值和95%可信區(qū)間(CI)，比較各組樣本基因型和等位基因、構(gòu)建的顯性模型和隱性模型與CHB、LC和HCC之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1研究對(duì)象的基本情況 各組男女性別匹配(P均>0.05)。CHB組年齡偏低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LC組、HCC組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 研究人群的基本特征

2.2Visfatin rs13237989與HBV相關(guān)性HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 Visfatin rs13237989在CHB、LC、HCC和健康人群中的基因型和等位基因頻率分布見表2。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，這4組的基因型頻率均與HWE的預(yù)測(cè)一致(P>0.05)，表明本研究對(duì)象具有群體代表性。對(duì)rs13237989 位點(diǎn)多態(tài)性與CHB、LC和HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系進(jìn)行Logistic回歸分析，校正性別和年齡2個(gè)因素的影響后，未發(fā)現(xiàn)rs13237989位點(diǎn)的任何遺傳模型與CHB、LC和HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P均>0.05)。

表2 Visfatin基因多態(tài)性在病例和對(duì)照組間的相關(guān)性分析

2.3Visfatin rs13237989與HBV相關(guān)性HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的性別分層分析 性別分層后，通過Logistic 回歸分析，校正年齡后結(jié)果顯示，在男性人群中，以CC基因型為參照，TT基因型與CHB的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)(OR=0.400，95%CI：0.176～0.911,P=0.029),但與LC、HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)(P>0.05)。以C等位基因?yàn)閰⒄?，T等位基因與CHB的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)(OR=0.639，95%CI：0.426～0.959，P=0.031),但與LC、HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)(P>0.05)。顯性模型分析中，以CC基因型為參照，CT+TT基因型與CHB、LC和HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)(P>0.05)。隱性模型分析中，以CC+CT基因型為參照，TT基因型與CHB(OR=0.454，95%CI：0.216～0.954，P=0.037)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān),但與LC 和HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)(P>0.05)，見表3。女性人群中，未發(fā)現(xiàn)rs13237989位點(diǎn)的任何遺傳模型與CHB、LC、HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P均>0.05)，見表4。

3 討論

本研究首次對(duì)廣西地區(qū)人群visfatin rs13237989基因多態(tài)性與CHB、HBV相關(guān)LC和HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，rs13237989位點(diǎn)的任何遺傳模型與CHB、LC和HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)，提示此位點(diǎn)在HBV相關(guān)HCC患者的病程進(jìn)展過程中無明顯影響。然而，經(jīng)性別分層分析后發(fā)現(xiàn)，TT基因型、T等位基因和隱性模型(TT vs CC+CT)與男性人群CHB的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，但與LC和HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。顯性模型(CT+TT vs CC)與CHB、LC和HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。而在女性人群中，未發(fā)現(xiàn)rs13237989位點(diǎn)的任何遺傳模型與CHB、LC和HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。這種差異的原因可能是由于男性和女性的體脂成分和性激素水平不同引起的[11]。

Visfatin(或NAMPT)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成的重要限速酶，催化煙酰胺(NAM)轉(zhuǎn)化為煙酰胺單核苷酸(NMN)。由于NAD作為輔酶調(diào)節(jié)糖酵解、絲氨酸生物合成和脂肪酸氧化等多種代謝信號(hào)通路，NAD的不斷產(chǎn)生促進(jìn)了癌細(xì)胞的生存和增殖[12]。研究發(fā)現(xiàn)，NAMPT在HBV陽(yáng)性肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于HBV陰性肝癌細(xì)胞，且這種作用依賴于HBV X蛋白，NAMPT通過調(diào)節(jié)有氧糖酵解促進(jìn)HBV復(fù)制和HBV介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的增殖，從而在HBV相關(guān)HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[13]。rs13237989位點(diǎn)位于visfatin基因內(nèi)含子上，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子突變會(huì)影響基因剪接，繼而對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用[14]。因此，研究該位點(diǎn)的基因多態(tài)性對(duì)于深入了解visfatin參與的疾病具有重要的意義。

表3 男性人群visfatin基因多態(tài)性在病例和對(duì)照組間的相關(guān)性分析

表4 女性人群visfatin基因多態(tài)性在病例和對(duì)照組間的相關(guān)性分析

目前，只有一項(xiàng)研究報(bào)道了visfatin rs13237989基因多態(tài)性與疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。Zhou等[15]研究發(fā)現(xiàn)，visfatin rs13237989基因多態(tài)性影響胰島素水平和糖尿病指數(shù)，但與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。另外，目前國(guó)內(nèi)外還有一些關(guān)于visfatin其他位點(diǎn)的基因多態(tài)性與癌癥相關(guān)性的報(bào)道。本課題組曾研究發(fā)現(xiàn)visfatin rs61330082多態(tài)性可能與廣西壯族人群HBV相關(guān)HCC風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)[8]，有研究發(fā)現(xiàn)visfatin rs61330082 CC基因型和C等位基因顯著增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，rs2505568 A等位基因和AT基因型顯著降低膀胱癌的易感性，然而，rs9034基因多態(tài)性與膀胱癌之間的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，visfatin基因rs61330082 CC基因型和C等位基因可增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),而rs2505568和rs9034與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)[5]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，visfatin基因rs61330082 CC基因型增加非小細(xì)胞肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而CT、TT基因型和C等位基因降低非小細(xì)胞肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3]。以上結(jié)果與本研究結(jié)果不完全一致，提示基因的不同SNP與不同人群或疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不同。

本研究仍有不足之處，由于本研究樣本僅來自本地區(qū)人群且樣本量有限，visfatin基因rs13237989位點(diǎn)與HBV相關(guān)HCC風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)可能受地域及樣本量的限制。因此，本研究的發(fā)現(xiàn)仍需要在多中心、多民族、大樣本研究中進(jìn)一步證實(shí)，并且通過體外功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。