汪自然，陳雨，伊潔，吳潔(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100730)

諾如病毒(norovirus)，又叫諾瓦克病毒，是一種無包膜、單鏈正向的RNA病毒[1]。人類諾如病毒是世界范圍內(nèi)急性腸胃炎的主要病原體，每年約6.99億人感染，約占全球所有腸胃炎病例的1/5[2]。諾如病毒可以引起腹瀉、嘔吐、惡心、低燒和腹部絞痛等癥狀，在新生兒、老年人和免疫功能低下的人群中感染率較高。人與人之間的病毒傳播主要通過污染的水和食物，人群對諾如病毒普遍易感，感染后不能獲得長久的免疫力。目前諾如病毒的主要檢測方法包括電鏡檢測法、免疫檢測法、分子生物學(xué)檢測方法等[3]。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法因其較高的靈敏度和特異性，是當(dāng)下臨床診斷諾如病毒感染的可靠方法。本研究對諾如病毒RNA檢測試劑盒的各項(xiàng)性能進(jìn)行評價(jià)并評估諾如病毒的臨床感染現(xiàn)況。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)，核酸提取儀、磁珠法核酸提取純化試劑(上海伯杰公司)，諾如病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法，湖北朗德公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶(江蘇康為世紀(jì)公司)，2×Taq預(yù)混PCR反應(yīng)液(北京康潤公司)。

1.2方法

1.2.1核酸提取 按照提取試劑說明書操作，主要提取步驟包括：裂解、吸磁珠、漂洗、洗脫、棄磁珠。

1.2.2PCR擴(kuò)增及測序 提取得到的RNA首先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。逆轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，分別使用GⅠ或者GⅡ引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下：GⅠ-F：5′-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3′，GⅠ-R：5′-CCAACCCARCCATTRTACA-3′； GⅡ-F：5′-CARG

ARBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3′，GⅡ-R：5′-CCR

CCNGCATRHCCRTTRTACAT-3′，由北京睿博興科公司合成。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94 ℃ 2 min；變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃ 7 min后轉(zhuǎn)入4 ℃保存。PCR產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)條帶的初步判定為陽性。擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京睿博興科公司測序，儀器為ABI 3730XL測序儀，測序引物使用默認(rèn)參數(shù)，測序試劑為BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(美國Thermo Fisher公司)。將測序后雙向拼接得到的序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對，與數(shù)據(jù)庫中諾如病毒的基因序列比對一致的認(rèn)為該樣本諾如病毒RNA檢測陽性。對于無擴(kuò)增條帶的認(rèn)為該樣本諾如病毒RNA檢測陰性。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按諾如病毒RNA檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書操作，反應(yīng)條件為：42 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min(采集熒光信號)，共40個(gè)循環(huán)。選擇FAM檢測通道檢測諾如病毒RNA；選擇VIC通道檢測內(nèi)標(biāo)。在質(zhì)控品及內(nèi)標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有效的前提下，如果FAM通道擴(kuò)增曲線呈S型且循環(huán)閾值(Ct)≤36.00，則結(jié)果判定為陽性。

1.3性能驗(yàn)證方案及指標(biāo) 性能驗(yàn)證主要按照中 國 合 格 評 定 國 家 認(rèn) 可 委 員 會 (China National Accreditation Service, CNAS)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則及其在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》(CNAS-CL02-A009)[4]文件執(zhí)行。

1.3.1重復(fù)性 選取含1×104copies/mL、1×105copies/mL諾如病毒陽性質(zhì)控品和諾如病毒陰性質(zhì)控品各1例，每一種標(biāo)本重復(fù)測定5次，測定4 d，每份樣本共測定20次，計(jì)算每種標(biāo)本的符合率及Ct值的批內(nèi)和批間精密度。性能驗(yàn)證通過標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽性符合率均應(yīng)≥95%，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)(CV)應(yīng)符合說明書的聲明范圍(≤5%)。選取含1×104copies/mL、1×105copies/mL諾如病毒陽性質(zhì)控品和諾如病毒陰性質(zhì)控品各1例，由不同的操作人員使用同一批號試劑在同一臺儀器上完成檢測，操作人員檢測結(jié)果與實(shí)際結(jié)果陰性、陽性結(jié)果符合率均應(yīng)為100%。

1.3.2符合率 20例疑似諾如病毒感染的患者糞便樣本隨機(jī)排列，以PCR擴(kuò)增及測序法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，使用諾如病毒RNA檢測試劑盒對樣本進(jìn)行平行檢測，計(jì)算符合率。性能驗(yàn)證通過標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽性檢出率均應(yīng)≥95%。

1.3.3檢測下限 選取諾如病毒核酸1×105copies/mL、1×104copies/mL和1×103copies/mL質(zhì)控品，每一種質(zhì)控品重復(fù)檢測20次，計(jì)算符合率。性能驗(yàn)證通過標(biāo)準(zhǔn)：1×105copies/mL和1×104copies/mL濃度的RNA檢出率均應(yīng)≥90%。

1.3.4抗干擾能力 在經(jīng)PCR及測序比對鑒定為諾如病毒RNA陽性的糞便樣本中分別加入以下物質(zhì)：含血紅蛋白(100 g/L)的血液、 阿莫西林(5 μg/mL)、對乙酰氨基酚(0.15 μg/mL)、布地奈德混懸液(0.5 mg/mL)，將加入干擾物質(zhì)的標(biāo)本全部提取核酸，檢測加入干擾物質(zhì)和未加入干擾物質(zhì)的標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)其Ct值。性能驗(yàn)證通過標(biāo)準(zhǔn)：未加入干擾物質(zhì)樣本的Ct值應(yīng)在加入血或藥物樣本的Ct值的95%置信區(qū)間內(nèi)，否則為抗干擾能力差。

1.3.5交叉反應(yīng) 分別將檢驗(yàn)科保存的大腸埃希菌菌液(1.0×106CFU/mL)、腸炎沙門菌菌液(1.0×106CFU/mL)、宋內(nèi)志賀菌菌液(1.0×106CFU/mL)和艱難梭菌菌液(1.0×106CFU/mL)的標(biāo)本分別加入諾如病毒陰性標(biāo)本中，使用諾如病毒核酸試劑盒進(jìn)行檢測。性能驗(yàn)證通過標(biāo)準(zhǔn)：不應(yīng)出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線或Ct值，否則為特異性差。

1.4臨床樣本檢測 收集北京協(xié)和醫(yī)院2020年12月至2021年7月各科室疑似諾如病毒感染患者的糞便樣本共4 179例，其中男性1 883例，年齡中位數(shù)為34歲；女性2 296例，年齡中位數(shù)為34歲。使用諾如病毒核酸檢測試劑盒進(jìn)行檢測，并計(jì)算陽性率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 16.0軟件分析。計(jì)算95%置信區(qū)間及陰性、陽性檢出率，各組間陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1性能驗(yàn)證結(jié)果

2.1.1重復(fù)性驗(yàn)證 1×104copies/mL、1×105copies/mL諾如病毒陽性質(zhì)控品和諾如病毒陰性質(zhì)控品使用試劑檢測，符合率為100%，符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。1×104copies/mL陽性質(zhì)控品的批內(nèi)CV為0.40%，批間CV為2.77%。1×105copies/mL陽性質(zhì)控品的批內(nèi)CV為0.69%，批間CV為2.68%。CV均小于5%，符合說明書要求。不同操作人員檢測結(jié)果與實(shí)際結(jié)果的符合率均為100%。

2.1.2符合率驗(yàn)證 20例糞便樣本提取核酸后，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別使用GⅠ和GⅡ的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明20例樣本中3例擴(kuò)增有條帶，且均為GⅡ型(圖1)。對有擴(kuò)增的條帶進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果與諾如病毒序列高度一致，表明相應(yīng)樣本確證為諾如病毒檢測陽性。20例樣本測序結(jié)果表明，3例為陽性，17例為陰性。部分陽性樣本測序峰圖見圖2。對20例臨床樣本使用試劑盒檢測，3例檢測為陽性，17例檢測為陰性，與測序結(jié)果一致，符合率為100%，符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

注：A，GⅠ基因擴(kuò)增結(jié)果；B，GⅡ基因擴(kuò)增結(jié)果。M, DL 2 000 DNA marker; 1～20，20例臨床樣本。

圖2 諾如病毒核酸陽性樣本測序部分結(jié)果

表1 20例臨床樣本PCR-熒光探針法與測序法比對結(jié)果

2.1.3檢測下限驗(yàn)證 1×105copies/mL、1×104copies/mL和1×103copies/mL諾如病毒質(zhì)控品使用試劑盒重復(fù)檢測20次，檢測結(jié)果均為陽性，檢測下限可以達(dá)到1×103copies/mL，而試劑標(biāo)明的檢測下限為1×104copies/mL，檢測下限符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.4抗干擾能力驗(yàn)證 在確證為諾如病毒RNA陽性的樣本加入各干擾物質(zhì)后提取核酸，使用試劑檢測，所得Ct值的95%置信區(qū)間為18.08～19.76，而未加干擾物質(zhì)的對照樣本Ct值為19.19，在95%置信區(qū)間內(nèi)，抗干擾能力符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。見表2。

2.1.5交叉反應(yīng)驗(yàn)證 在確證為諾如病毒RNA陰性的樣本中分別加入大腸埃希菌、腸炎沙門菌、宋內(nèi)志賀菌或艱難梭菌菌液后提取核酸，使用試劑檢測，均未出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線或Ct值，交叉反應(yīng)符合性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。見表2。

表2 諾如病毒核酸檢測試劑抗干擾能力和交叉反應(yīng)驗(yàn)證

2.2臨床樣本檢測結(jié)果 4 179份臨床樣本中陽性樣本517例，總陽性率為12.37%。其中，男性患者(13.91%，262/1 883)陽性率高于女性患者(11.11%，255/2 296)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.523，P=0.006)。不同月份陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=140.6，P<0.001)，2021年3～4月陽性率處于較高水平，2021年6～7月陽性率較低，見圖3A。從年齡分布來看，21～40歲的患者的陽性率高于其他年齡組(χ2=68.83，P<0.001)，見圖3B。從科室分布分析，門急診及病房均有陽性樣本檢出，發(fā)熱門診陽性樣本檢出量最高，急診兒科陽性率較高,見圖3C。

注：A，不同月份諾如病毒陽性率分布；B，不同年齡組諾如病毒陽性率分布；C，不同臨床科室陽性率分布。

3 討論

近年來，由諾如病毒引起的暴發(fā)感染得到了越來越多的關(guān)注。諾如病毒具有高度傳染性，即使是少量的病毒也能致病，被感染的人會釋放大量的病毒顆粒污染周圍環(huán)境[5-6]。對于兒童、老人和免疫功能缺陷的人群，一旦感染諾如病毒，可能導(dǎo)致脫水、休克甚至死亡[7]。因此，早期識別諾如病毒的感染者、及時(shí)隔離感染者和消毒周圍環(huán)境是控制諾如病毒感染暴發(fā)的重要環(huán)節(jié)。目前針對諾如病毒有多種檢測方法，而熒光定量PCR方法準(zhǔn)確高效且檢測通量較大，可以滿足臨床的檢驗(yàn)需求。

依據(jù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可國際標(biāo)準(zhǔn)IS015189《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力專用要求》、美國病理家學(xué)會(College of American Pathologists，CAP)和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等相關(guān)文件要求，特定的試劑或者檢測系統(tǒng)在應(yīng)用于臨床檢測之前，需要對其進(jìn)行性能驗(yàn)證以確保其能符合臨床需求[8-10]。本研究從重復(fù)性、符合率、檢測下限、抗干擾能力和交叉反應(yīng)5個(gè)方面對諾如病毒核酸檢測試劑進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià)。在重復(fù)性研究中，選取2個(gè)濃度的諾如病毒核酸質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，每種樣本每天檢測5次，檢測4 d，共20次檢測，符合率為100%，批內(nèi)和批間CV均<5%，說明試劑較為穩(wěn)定，重復(fù)性好。不同操作人員檢測結(jié)果與實(shí)際結(jié)果均一致，說明人員之間重復(fù)性較好。在準(zhǔn)確性研究中，收集發(fā)熱門診20例疑似諾如病毒感染的患者糞便樣本，使用核酸提取儀提取核酸后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。諾如病毒GⅠ和GⅡ是引起人類胃腸炎的2個(gè)主要基因型[11]，本研究以cDNA為模板，分別使用相應(yīng)的引物擴(kuò)增后對陽性條帶進(jìn)行測序比對，結(jié)果表明20例臨床樣本中3例為諾如病毒核酸陽性，且基因型均為GⅡ。這與國內(nèi)報(bào)道GⅡ型為主要流行型的其他研究[11-12]相一致，后期可以收集更多的樣本進(jìn)行基因測序和遺傳進(jìn)化樹分析，以監(jiān)測諾如病毒在本地區(qū)的流行型別及傳播規(guī)律。以測序比對結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，使用諾如病毒檢測試劑盒對20例臨床樣本進(jìn)行檢測，符合率為100%，表明試劑盒檢測較為可靠，準(zhǔn)確性高。試劑盒標(biāo)明的檢測下限為1×104copies/mL，選擇高于、等于和低于該下限的3個(gè)濃度的質(zhì)控品進(jìn)行驗(yàn)證，每種樣本重復(fù)20次，檢出率均為100%，說明檢測系統(tǒng)具有較高的敏感性，檢測下限符合性能驗(yàn)證要求。在抗干擾能力檢測中，在諾如病毒確證陽性的糞便樣本中混入血液和常見的抗病毒藥物作為干擾物質(zhì)，分別提取核酸后使用試劑盒檢測，結(jié)果顯示未加入干擾物質(zhì)的Ct值在加入血或藥物的Ct值的95%置信區(qū)間內(nèi)，表明該試劑盒抗干擾能力較好，血液和常見的藥物對其檢測結(jié)果影響較小。目前有較多的病原體均可以引起發(fā)熱、腹瀉等癥狀，為了避免其他病原體造成的假陽性結(jié)果，在諾如病毒陰性的樣本中加入常見腹瀉相關(guān)的細(xì)菌菌液后提取核酸檢測，結(jié)果均未出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線或者Ct值，說明特異性較高。

近年來，在北京市各區(qū)均存在諾如病毒引起的散發(fā)或暴發(fā)疫情。本研究中，諾如病毒的總陽性率為12.37%，與既往北京市哨點(diǎn)醫(yī)院監(jiān)測數(shù)據(jù)[13]相類似。本研究結(jié)果提示在3～4月陽性率處于較高水平，這可能與季節(jié)更替導(dǎo)致人群免疫力下降有關(guān)。同時(shí)，干冷的天氣環(huán)境也有利于諾如病毒的生長繁殖和傳播[14]。既往研究大多關(guān)注嬰幼兒人群中諾如病毒的感染情況[15]，但本研究中21～40歲年齡組相較于兒童患者具有較高的感染率，這可能與我院為綜合醫(yī)院，收治兒童患者較少有關(guān)。因此，在后續(xù)的監(jiān)測中，青壯年群體的諾如病毒的感染情況也需要關(guān)注。發(fā)熱門診的陽性病例數(shù)較多，一方面說明諾如病毒感染的患者往往有發(fā)熱等癥狀，同時(shí)也提示在發(fā)熱門診需要做好環(huán)境的消毒工作，以免疫情的進(jìn)一步擴(kuò)散。急診兒科陽性率較高，表明兒童群體免疫力相對弱，對諾如病毒易感性強(qiáng)，需要密切監(jiān)測以防止群體疫情的暴發(fā)。

本研究也存在一定的局限性：在交叉反應(yīng)驗(yàn)證中，宜選擇與檢測對象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸進(jìn)行驗(yàn)證，而在本研究的交叉反應(yīng)驗(yàn)證中限于實(shí)驗(yàn)條件，僅選擇了腹瀉相關(guān)的常見細(xì)菌，并未驗(yàn)證輪狀病毒、腺病毒、札如病毒、星狀病毒等胃腸道相關(guān)病毒的交叉反應(yīng)性。

綜上，該檢測試劑穩(wěn)定、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、敏感性高，抗干擾能力和特異性較高，符合性能驗(yàn)證的要求，可為臨床諾如病毒感染診斷提供可靠的病原學(xué)依據(jù)。該檢測系統(tǒng)連續(xù)8個(gè)月的監(jiān)測結(jié)果表明，諾如病毒在人群中具有較高的感染率，尤其是在季節(jié)交替時(shí)和21～40歲群體中，需要持續(xù)的關(guān)注和監(jiān)測。