李 杰，王 蘭

(江蘇省江陰市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 江陰 214400)

肺癌已經(jīng)成為全球及我國發(fā)病率和致死率最高的腫瘤，發(fā)病率逐年增加[1]。肺部磨玻璃結(jié)節(jié)指的是在高分辨率CT圖像上表現(xiàn)為肺內(nèi)密度輕度增加，呈局灶性云霧狀密度的結(jié)節(jié)，其內(nèi)的支氣管及血管束可顯示。隨著影像學(xué)技術(shù)的不斷完善和廣大居民體檢意識(shí)的日益提高，肺部磨玻璃結(jié)節(jié)的發(fā)病率在日益增加。很多醫(yī)院還專門設(shè)立了肺部磨結(jié)節(jié)的多學(xué)科門診。在CT掃描中發(fā)現(xiàn)的肺部磨玻璃樣變性當(dāng)中最終有一部分確診為惡性腫瘤。對(duì)于肺部磨玻璃結(jié)節(jié)的性質(zhì)鑒別是當(dāng)前臨床工作的一個(gè)難點(diǎn)，尋找一種簡便、無創(chuàng)的方法聯(lián)合CT檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)的不同影像學(xué)特征來鑒別肺部磨玻璃結(jié)節(jié)的性質(zhì)是研究的方向。已有研究顯示肺癌患者的肺組織當(dāng)中存在有慢性炎癥[2-3]，各種炎癥因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)，白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)參與了肺損傷和疾病進(jìn)展。本研究通過比較不同性質(zhì)的肺部磨玻璃結(jié)節(jié)患者血清當(dāng)中的炎性及免疫因子的水平，為肺部磨玻璃結(jié)節(jié)性質(zhì)的鑒別診斷探索一種新的方法。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2018年2月—2019年1月我院收治的肺部磨玻璃結(jié)節(jié)患者108例，所有患者之前均未接受過放化療及手術(shù)治療，均排除存在各種感染和自身免疫系統(tǒng)疾病，近期曾使用激素及免疫抑制劑以及存在其他部位腫瘤的患者。由2名長期從事CT診斷的影像科主任醫(yī)師對(duì)所有入選患者的影像進(jìn)行判讀，通過胸外科手術(shù)明確肺部結(jié)節(jié)性質(zhì)，根據(jù)病理結(jié)果和CT表現(xiàn)分為肺癌組(A組)、良性多發(fā)磨玻璃結(jié)節(jié)組(B組)、良性孤立性肺部磨玻璃樣結(jié)節(jié)組(C組)。3組性別、年齡、平均動(dòng)脈壓、體重指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 3組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general information of three groups

1.2研究方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和試劑 主要實(shí)驗(yàn)室設(shè)備：酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、特定蛋白質(zhì)儀器。相關(guān)試劑盒：TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒，Multiset三色試劑，λ型輕鏈測定試劑盒和κ型輕鏈測定試劑盒。

1.2.2炎癥因子檢測 收集清晨空腹靜脈血3～5 mL，將血清提取并儲(chǔ)存在-80 ℃的冰箱中。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平。①樣品稀釋：在ELISA板上設(shè)置10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔，并將100 μL樣品分別加入第1和第2孔中，分別加入50 μL稀釋溶液。從第1孔及第2孔中取100 μL樣品，并分別加入到第3孔和第4孔中，分別加入50 μL稀釋溶液。接下來，從第3個(gè)和4個(gè)孔取50 μL樣品并加入到5和6個(gè)孔中，分別加入50 μL稀釋溶液。將樣品稀釋5倍，最后得到稀釋樣品。②加樣和孵育：將稀釋的樣品加入樣品孔中，膜封閉后在37 ℃孵育30 min; 然后將板洗滌5次(20 s/次)；③酶促溫育：加入50 μL酶標(biāo)記的試劑在37 ℃孵育30 min，然后洗滌板5次(20 s/次)；④顯色和終止：將彩色顯影劑A和B(每個(gè)50 μL)加入到標(biāo)準(zhǔn)孔中以在20 ℃溫育15 min，然后加入50 μL終止緩沖液。使用酶標(biāo)儀(波長450 nm)在15 min內(nèi)讀取光密度(optical density，OD)值，并計(jì)算TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平。

1.2.3T淋巴細(xì)胞亞群水平檢測 收集清晨空腹靜脈血3～5 mL，樣品中白細(xì)胞(white blood cell,WBC)數(shù)量控制在(4～10)×109/L。當(dāng)WBC<4×109/L時(shí)，加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心20 min分離單個(gè)核細(xì)胞；當(dāng)WBC>10×109/L時(shí)，使用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline,PBS)溶液進(jìn)行稀釋。根據(jù)多重三色試劑盒的說明，將5 μL CD3-PC5/CD4-RD1/CD45-PITC和CD3-PC5/CD8-ECD/CD45-PITC分別加入2個(gè)TruCount管中，將40 μL樣品加入到2個(gè)TruCount管中并充分混合，然后在20 ℃溫育15 min；然后加入500 μL FACS溶血素并充分混合，然后在20 ℃在黑暗處溫育15 min；在2 500 r/min離心3 min后取上清液，然后加入300 μL 9%氯化鈉溶液。使用流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+和CD8+水平，并計(jì)算CD4+/CD8+比率。

1.2.4免疫球蛋白檢測 收集清晨空腹靜脈血2～3 mL，完全凝集并以2 000 r/min離心10 min。 取上清液，加入9%氯化鈉，加入稀釋溶液。 根據(jù)特定蛋白質(zhì)儀器的說明進(jìn)行免疫比濁法測定，自動(dòng)檢測免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13組患者炎癥因子指標(biāo)比較 A組、B組患者TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平顯著高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組與B組患者TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.23組患者T淋巴細(xì)胞亞群水平比較 A組、B組患者CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平顯著低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組和B組CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.33組患者免疫指標(biāo)比較 A組、B組患者IgG、IgA、IgM水平顯著低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組與B組患者IgG、IgA、IgM水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表2 3組患者炎癥因子指標(biāo)比較Table 2 Comparison of inflammatory factors in three groups

表3 3組患者T淋巴細(xì)胞亞群水平比較Table 3 Comparison of the levels of T lymphocyte subsets in three groups

表4 3組患者免疫指標(biāo)比較Table 4 Comparison of immune indexes of three groups

3 討 論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率逐年增加，已成為許多國家危及人類健康的主要惡性腫瘤。2015年我國新發(fā)肺癌病例約為78.7萬例，發(fā)病率為57.26/10萬，是男性發(fā)病首位，女性發(fā)病第2位的惡性腫瘤。因肺癌死亡的例數(shù)居我國惡性腫瘤死亡首位，2015年我國因肺癌死亡例數(shù)約為63.1萬例，病死率為45.87/10萬。17個(gè)癌癥注冊(cè)中心的數(shù)據(jù)分析顯示，我國肺癌患者的年齡標(biāo)化5年相對(duì)生存率由2003—2005年的16.1%僅增加至2012—2015年的19.7%。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)在肺癌中的比例高，約占85%，手術(shù)治療的Ⅰ～Ⅲa期NSCLC患者術(shù)后1年生存率可達(dá)70%，5年生存率可達(dá)30%。然而，其中超過70%的NSCLC患者就診時(shí)已有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(Ⅲb～Ⅳ期)，失去手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，說明早期診治尤為重要[4-5]。近年來肺部磨玻璃結(jié)節(jié)的研究越來越受到關(guān)注，但其病理診斷常遇到困難，有學(xué)者認(rèn)為肺部磨玻璃的變化應(yīng)該列入肺癌前病變研究。影像學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)早期肺磨玻璃結(jié)節(jié)的主要方法之一。肺磨玻璃結(jié)節(jié)的病因很多，包括吸煙、空氣污染和遺傳因素等[6-7]。TNF-α是由單核/巨噬細(xì)胞分泌的一種可溶性多肽細(xì)胞因子。當(dāng)機(jī)體受損、感染或患有某些腫瘤時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量TNF-α，血清濃度也會(huì)增加，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)[8]。IL-1是白細(xì)胞介素家族的成員，包括IL-1α和IL-1β，可刺激T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子[9]。IL-6是白細(xì)胞介素家族的重要成員，其釋放對(duì)肺部疾病是一個(gè)危險(xiǎn)信號(hào)[10]。IL-10水平升高可導(dǎo)致機(jī)體處于體液免疫的高反應(yīng)狀態(tài)，在多種腫瘤中均高表達(dá)[11]。本研究顯示，肺癌與良性的彌漫性磨玻璃結(jié)節(jié)患者中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均明顯高于良性孤立性磨玻璃結(jié)節(jié)患者。原因可能是腫瘤細(xì)胞激活單核細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)TNF-α的分泌。TNF-α與IL-1β、IL-6和IL-10等炎癥介質(zhì)發(fā)生作用，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。彌漫性肺部磨玻璃結(jié)節(jié)也會(huì)出現(xiàn)肺組織損傷，故TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平、也較高，接近肺癌。孤立性肺部結(jié)節(jié)無纖維化改變和間質(zhì)炎癥反應(yīng)，所以炎癥因子水平較低，但仍然不容忽視。IgG是一種在抗感染中起主要作用的抗菌和抗病毒抗體；IgA可以形成局部免疫；IgM是一種能溶解致病菌，凝集和吞噬作用的高效抗體，在早期防御中發(fā)揮重要作用[12-13]。肺癌患者與良性彌漫性肺部磨玻璃結(jié)節(jié)患者的IgG、IgA和IgM水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均顯著低于孤立性磨玻璃樣結(jié)節(jié)患者。原因可能是因?yàn)槊庖咔虻鞍字苯又泻蚑NF-α，阻斷抗原抗體反應(yīng),減少炎癥因子釋放。肺癌與良性肺部彌漫性磨玻璃結(jié)節(jié)患者中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達(dá)水平高，導(dǎo)致IgG、IgA和IgM水平降低。T淋巴細(xì)胞亞群中的CD3+是成熟T細(xì)胞表面上的抗原呈遞，可以輔助鑒定T細(xì)胞抗原受體。CD4+是具有免疫調(diào)節(jié)功能的輔助T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞可導(dǎo)致免疫功能障礙的細(xì)胞毒性T細(xì)胞[14-15]。肺癌患者和良性彌漫性磨玻璃樣結(jié)節(jié)患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，明顯低于良性孤立性磨玻璃樣結(jié)節(jié)患者。原因可能是T淋巴細(xì)胞亞群的水平與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，患者常?；济庖呤Ш夂兔庖吖δ艿拖?。CD3+、CD4+和CD8+在肺微環(huán)境中處于平衡狀態(tài)，它能正常調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，受多種炎癥細(xì)胞因子影響，其表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變; 炎癥越嚴(yán)重，平衡越受到損害，并且會(huì)產(chǎn)生顯著的免疫抑制，從而減少其數(shù)量。 隨著肺部疾病的不斷進(jìn)展，CD4+/CD8+比率明顯下降，誘導(dǎo)失衡，引起肺組織病理生理改變[16]。對(duì)于肺部磨玻璃結(jié)節(jié)的患者，檢測血清中的炎癥及免疫指標(biāo)可能可以成為預(yù)測結(jié)節(jié)良惡性的一個(gè)輔助參考因素，但是需要擴(kuò)大樣本數(shù)量開展進(jìn)一步研究，及同無結(jié)節(jié)的健康人作比較進(jìn)行分析。

綜上所述，肺癌和良性肺部彌漫性磨玻璃結(jié)節(jié)患者的炎癥因子水平顯著高于良性單發(fā)磨玻璃結(jié)節(jié)患者，免疫因子的水平顯著低于良性單發(fā)磨玻璃結(jié)節(jié)患者。檢測肺部磨玻璃結(jié)節(jié)患者血清中炎癥因子和免疫因子水平可考慮作為鑒別肺部磨玻璃結(jié)節(jié)良惡性的一種輔助手段。影像學(xué)結(jié)合血清學(xué)檢查可為肺癌的鑒別診斷提供較好的依據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌病變的早期干預(yù)，具有重要的臨床意義。