杜虹，張志遠，谷小衛(wèi)，董自超

作者單位：1中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第988醫(yī)院心胸外科，河南 焦作454003；

2武漢亞洲心臟病醫(yī)院心臟外科，湖北 武漢430000

冠心病是全球人類死亡或殘疾的主要原因之一，其治療的主要方法為心肌的再灌注溶栓治療［2］。但是，心肌再灌注過程可引起進一步的心肌細胞的再灌注損傷，造成心肌細胞死亡［3］。心肌細胞缺氧/復(fù)氧（H/R）是心肌缺血再灌注損傷的體外模擬［4］。因此，本研究于2018 年5 月至2019 年12 月以缺氧/復(fù)氧心肌細胞為研究對象，探究微小RNA（microR?NA，miRNA/miR）-138-5p 和Kelch 重復(fù)蛋白（Kelch repeat protein，KLHDC10）在缺氧復(fù)氧心肌細胞中的調(diào)控功能及二者之間的作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料心肌細胞H9C2購自上海中國科學(xué)院細胞庫；培養(yǎng)基DMEM 購自上?；鄯f生物科技有限公司；pYr-MirTarget載體購自長沙贏潤生物技術(shù)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購自上海古朵生物公司；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）雙染凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Multi?scan MK3 全自動多功能酶標儀購自上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；EPICS-PRO-FILEⅡ流式細胞儀購自美國Coulter。

1.2 方法

1.2.1細胞的培養(yǎng)與分組 將H9C2 細胞用混有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5%二氧化碳的恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)、傳代。參考劉洋等［5］的方法建立H/R H9C2細胞模型，標記為H/R 組。正常培養(yǎng)的H9C2 細胞標記為對照組。用3～5 倍DNA 或質(zhì)粒量的脂質(zhì)體將以下各組細胞轉(zhuǎn)染至H/R 組細胞：H/R+miRNA 陰性對照（miRcon）組（轉(zhuǎn)染miR-con）、H/R+miR-138-5p 組［轉(zhuǎn)染miR-138-5p 模擬物（miR-138-5p mimics）］、H/R+小干擾RNA 陰性對照（si-con）組（轉(zhuǎn)染si-con）、H/R+KLHDC10小干擾RNA（si-KLHDC10）組（轉(zhuǎn)染si-KL?HDC10）、H/R+miR-138-5p+過表達空載體（pcDNAcon）組（共轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimics 和pcDNA-con）、H/R+miR-138-5p+KLHDC10 過表達載體（pcDNAKLHDC10）組（共轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimics 和pcDNAKLHDC10），轉(zhuǎn)染4 h 后，補充新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，qRT-PCR 確認轉(zhuǎn)染成功后進行標記，用于后續(xù)的實驗研究。若未達到轉(zhuǎn)染效率的要求，則更換質(zhì)?；駾NA、改變轉(zhuǎn)染條件等進行重新轉(zhuǎn)染，直至達到轉(zhuǎn)染要求為止，方可用于后續(xù)試驗。

1.2.2 qRT-PCR 實驗 用總RNA 抽提試劑盒提取需要檢測的細胞總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在冰上將其合成互補DNA（cDNA），保存?zhèn)溆?。用qRTPCR 試劑盒檢測cDNA 中miR-138-5p 和KLHDC10的mRNA 表達水平。 miR-138-5p 正向引物ACACTCCAGCTGGGAGCTGGTGTTG，反向引物GT?GCAGGGTCCGAGGT；U6 正向引物CTCGCTTCG?GCAGCACA，反向引物AACGCTTCACGAATTTGC?GT；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物ACACCCACTCCTCCACCTTT， 反 向 引 物TTACTCCTTGGAGGCCATGT。KLHDC10 引物由上海吉瑪生物公司設(shè)計合成。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting） 將需要檢測的細胞用細胞總蛋白質(zhì)提取液（1 mL/10 cm2）充分地裂解提取總蛋白。用蛋白變性后的上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），并加入等量的Marker。電泳結(jié)束后，切下目的蛋白條帶，將膠上的蛋白用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。再用2.5%的脫脂奶粉將膜進行封閉處理1 h，浸入各個一抗溶液（1∶500～1 500稀釋）中低溫孵育過夜（4 ℃），在浸入二抗（1∶1 000稀釋）中37 ℃孵育2 h。用超敏發(fā)光試劑盒對膜進行顯影曝光。結(jié)果以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，凋亡相關(guān)蛋白細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）等目的蛋白灰度與內(nèi)參蛋白灰度的比值表示蛋白表達水平。

1.2.4 CCK-8 實驗 將需要檢測的細胞104個/孔置于96 孔板中，再加入10μL的CCK-8溶液，在37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，結(jié)束后在酶標儀上檢測細胞的吸光度（A450）。細胞存活率（%）為（1－A450樣品/A450對照）×100%。

1.2.5 流式細胞術(shù)實驗 使用Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。將需要檢測的細胞用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3 遍。用結(jié)合緩沖液懸浮細胞，然后加入Annexin V-FITC和PI各5μL，避光反應(yīng)結(jié)束后進行流式細胞儀檢測分析細胞的凋亡。凋亡率為Annexin V-FITC陽性細胞比率與PI陽性細胞比率之和。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測實驗 首先根據(jù)starbase預(yù)測到的miR-138-5p與KLHDC10之間存在的結(jié)合位點，設(shè)計miR-138-5p 應(yīng)答的KLHDC10 3′非編碼區(qū)（3′UTR）片段，將其克隆至載體pYr-Mir?Target，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體。將H9C2 細胞培養(yǎng)至匯合度約50 %收集細胞。將miR-con、miR-138-5p 與野生型（WT）KLHDC10、突變型（MUT）KLHDC10分別共轉(zhuǎn)染至H9C2細胞，標記為miR-con組WT 細胞、miR-con 組MUT 細胞、miR-138-5p 組WT 細胞、miR-138-5p組MUT 細胞。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細胞用報告基因細胞裂解液充分裂解，加入螢火蟲熒光素酶檢測液，測定熒光素酶活性，取出再加入海腎熒光素酶檢測液，測定熒光素酶活性。結(jié)果以螢火蟲熒光素酶的活性為內(nèi)參，海腎熒光素酶的活性與螢火蟲熒光素酶的活性比值表示樣本目的基因的活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用PEMS3.2 進行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism 6.0 進行相關(guān)數(shù)據(jù)的圖片繪制，計量資料用±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和SNKq檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H/R H9C2 細胞中miR-138-5p 和KLHDC10的表達水平H/R 組于對照組，miR-138-5p 的mRNA 表達水平顯著降低，KLHDC10 的mRNA 和蛋白表達水平均顯著升高（均P<0.05），見表1。

表1 缺氧/復(fù)氧（H/R）H9C2細胞中miR-138-5p和Kelch重復(fù)蛋白（KLHDC10）的表達變化/± s

表1 缺氧/復(fù)氧（H/R）H9C2細胞中miR-138-5p和Kelch重復(fù)蛋白（KLHDC10）的表達變化/± s

組別對照H/R t值P值重復(fù)次數(shù)33 miR-138-5p 1.00±0.11 0.34±0.03 10.03 0.001 KLHDC10 mRNA 1.02±0.10 2.86±0.28 10.72<0.001 KLHDC10蛋白0.33±0.03 0.86±0.09 9.68 0.001

2.2 高表達miR-138-5p 對H/R 處理的H9C2 存活率、凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響H/R 組于對照組，miR-138-5p mRNA 表達水平顯著降低，cyclin D1 蛋白表達水平顯著降低，cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；H/R+miR-138-5p 組于H/R+miR-con 組，miR-138-5p mRNA、cyclin D1 蛋白、細胞存活率均顯著升高，cleaved-caspase-3 蛋白、細胞凋亡率均顯著降低（均P<0.05）。見圖1、表2。

表2 高表達miR-138-5p對缺氧/復(fù)氧（H/R）處理的H9C2細胞存活率、凋亡率、miR-138-5p、cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表達的影響/± s

表2 高表達miR-138-5p對缺氧/復(fù)氧（H/R）處理的H9C2細胞存活率、凋亡率、miR-138-5p、cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表達的影響/± s

注：cyclin D1為細胞周期蛋白D1，cleaved-caspase-3為活化胱天蛋白酶-3。①與對照組比較，P<0.05。②與H/R+miR-con組比較，P<0.05。

組別對照H/R H/R+miR-con H/R+miR-138-5p F值P值cleaved-caspase-3 0.40±0.04 0.96±0.10①0.94±0.09 0.50±0.05②45.98<0.001重復(fù)次數(shù)3333細胞存活率/%100.04±10.05 62.03±6.20①60.08±6.04 89.43±9.01②18.55 0.001細胞凋亡率/%7.22±0.72 28.16±2.82①27.12±2.70 12.42±2.74②57.01<0.001 miR-138-5p 1.00±0.10 0.32±0.03①0.35±0.04 0.88±0.09②72.56<0.001 cyclin D1 0.72±0.07 0.32±0.03①0.30±0.03 0.65±0.07②49.41<0.001

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測高表達miR-138-5p對缺氧/復(fù)氧（H/R）處理的H9C2細胞cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

2.3 低表達KLHDC10 對H/R 處理的H9C2 存活率、凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響H/R+si-KLHDC組于H/R+si-con 組，細胞存活率顯著升高［（83.45±8.35）%比（61.86±6.15）%］（t=6.25，P<0.001），細胞凋亡率顯著降低［（11.72±1.16）%比（28.01±2.81）%］（t=16.07，P<0.001）；KLHDC10 和cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低，cyclin D1蛋白表達顯著升高，見圖2、表3。

表3 低表達KLHDC10對缺氧/復(fù)氧（H/R）處理的H9C2細胞中KLHDC10、cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表達的影響/± s

表3 低表達KLHDC10對缺氧/復(fù)氧（H/R）處理的H9C2細胞中KLHDC10、cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表達的影響/± s

注：KLHDC10為Kelch重復(fù)蛋白，cyclin D1為細胞周期蛋白D1，cleaved-caspase-3為活化胱天蛋白酶-3。

cleavedcaspase-3 0.95±0.10 0.52±0.05 6.66 0.003組別H/R+si-con H/R+si-KLHDC10 t值P值重復(fù)次數(shù)33 KLHDC10 0.84±0.08 0.42±0.04 8.13 0.001 cyclin D1 0.32±0.03 0.62±0.06 7.75 0.001

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測低表達KLHDC10對缺氧/復(fù)氧（H/R）處理的H9C2細胞中KLHDC10、cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

2.4 miR-138-5p 靶向KLHDC10，調(diào)控KLHDC10的表達通過生物信息學(xué)在線靶基因預(yù)測軟件star?base 預(yù)測miR-138-5p 和KLHDC10 的結(jié)合區(qū)域，見圖3。miR-138-5p 組于miR-con 組，WT KLHDC10 的H9C2 細胞熒光素酶活性顯著降低［（0.31±0.03）比（1.00±0.11）］（t=10.48，P<0.001），MUT KLHDC10 的H9C2 細胞熒光素酶活性變化不大［（1.06±0.12）比（1.09±0.13）］（t=0.29，P=0.784）。miR-138-5p 明顯負向調(diào)控KLHDC10 蛋白表達水平，miR-138-5p 組KLHDC10 表達量（0.32±0.03）低于miR-con 組（0.84±0.09）（P<0.05），抗miR-138-5p（anti-miR-138-5p）組KLHDC10 表達量（1.14±0.11）高于陰性對照（antimiR-con）組（0.87±0.10）（P<0.05）（F=45.31，P<0.001）。

圖3 在線靶基因預(yù)測軟件starbase預(yù)測Kelch重復(fù)蛋白（KLHDC10）與miR-138-5p的結(jié)合區(qū)域

2.5 過表達KLHDC10 可逆轉(zhuǎn)miR-138-5p 對H/R處理的H9C2 存活率、凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響H/R+miR-138-5p+pcDNA-KLHDC10 組于H/R+miR-138-5p+pcDNA-con 組，細胞存活率顯著降低［（65.13±6.51）% 比（89.43±9.01）%］（t=3.79，P=0.019），細胞凋亡率顯著升高［（34.20±3.42）%比（12.49±5.28）%］（t=5.98，P=0.004）；KLHDC10 和cleaved-caspase-3 蛋白表達水平顯著升高，cyclin D1蛋白表達水平顯著降低，見表4。

表4 高表達KLHDC10可以逆轉(zhuǎn)miR-138-5p對缺氧/復(fù)氧（H/R）處理的H9C2細胞中KLHDC10、cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白的表達/± s

表4 高表達KLHDC10可以逆轉(zhuǎn)miR-138-5p對缺氧/復(fù)氧（H/R）處理的H9C2細胞中KLHDC10、cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白的表達/± s

注：KLHDC10為Kelch重復(fù)蛋白，cyclin D1為細胞周期蛋白D1，cleaved-caspase-3為活化胱天蛋白酶-3。

組別H/R+miR-138-5p+pcDNA-con H/R+miR-138-5p+pcDNA-KLHDC10 t值P值cleaved-caspase-3 0.50±0.05 0.86±0.09 6.06 0.004重復(fù)次數(shù)33 KLHDC10 0.55±0.06 0.80±0.08 4.33 0.012 cyclin D1 0.66±0.07 0.40±0.04 5.59 0.005

3 討論

miRNA 是一種非編碼微小RNA分子，普遍與人類各種疾病有關(guān)，包括心肌的缺血再灌注損傷［6-8］。但是仍有部分新發(fā)現(xiàn)的miRNA 在心肌損傷中的作用尚未清楚。miR-138-5p 是近期在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn)的一個新的功能miRNA［9］。miRNA在生物中普遍存在，并且其在進化上高度保守。迄今為止，在人類基因組中已鑒定出超過2 000 個miRNA，并且其中超過60%的蛋白質(zhì)編碼基因受miRNA的調(diào)控［10-11］。miRNA在多種疾病中發(fā)揮重要的病理生理作用［12］。 據(jù)報道，miR-138 的失調(diào)是心臟和心缺血/灌注損傷的關(guān)鍵因素［13］。Tang 等［9］在研究中報道，miR-138 在腦缺血再灌注細胞模型中和腦缺血再灌注大鼠模型中均具有調(diào)控作用，在體外miR-138 可為通過靶向脂蛋白2 促進缺血再灌注細胞的增殖，發(fā)揮保護作用。最近，Mao等［14］在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p 可作為長鏈非編碼RNAKLF3反義RNA1 的直接作用靶標，通過調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1 參與缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞的細胞焦亡過程。這說明，miR-138 在缺血再灌注腦損傷和心肌損傷中均具有重要的功能。這些研究所支持的觀點與本研究的實驗結(jié)果完全相吻合。本實驗結(jié)果顯示，miR-138-5p 在H/R H9C2 細胞中的表達水平異常降低，且過表達miR-138-5p 具有促進H/R H9C2 細胞增殖，抑制凋亡的保護作用。此外，生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C驗證了miR-138-5p可靶向KLHDC10，這可能與miR-138-5p 的作用機制有關(guān)。miR-138-5p 在缺血再灌注心肌損傷中的潛在功能機制的深入探索將為心血管疾病的治療提供新方向。

炎性因子在病原防御中起著重要的作用，過度的炎性細胞因子釋放可能會對個體造成一定的損害，如炎癥性腸病、心肌炎和腦梗死［15］。Kelch 家族蛋白在炎癥引起的疾病中的作用十分重要［16］。KL?HDC10 是Kelch 蛋白家族的一員，該家族成員在炎癥過程中的作用得到研究的肯定［17］，但是KLHDC10在心肌損傷中的作用及與miR-138-5p 之間的關(guān)系尚未清楚。Yamaguchi 等［18］報道，KLHDC10 在全身性炎癥反應(yīng)綜合征（ystemic inflammatory response syndrome，SIRS）小鼠模型中表達異常升高，敲減KLHDC10 的SIRS 小鼠模型表現(xiàn)出較低的炎性因子釋放，提示KLHDC10 是壞死性細胞類型的特定調(diào)節(jié)劑，可促進TNFα 誘導(dǎo)的SIRS 的發(fā)展。這說明KLHDC10 在機體的炎性反應(yīng)中占據(jù)關(guān)鍵地位。于是，該研究假設(shè)KLHDC10 在缺氧/復(fù)氧心肌細胞的增殖和凋亡中具有調(diào)控作用。炎癥在心肌缺血再灌注損傷中占有重要地位［19］。心肌缺血再灌注所造成的損傷主要是由炎癥和氧化應(yīng)激引起的心肌細胞的功能損傷。結(jié)果本研究的實驗結(jié)果與假設(shè)完全相符合。KLHDC10在H/R H9C2細胞中的表達水平異常升高，且敲減KLHDC10 具有促進H/R H9C2 細胞增殖，抑制凋亡作用。除此之外，過表達KLHDC10還逆轉(zhuǎn)了miR-138-5p在H/R H9C2細胞中的增殖和凋亡調(diào)控作用。

綜上所述，miR-138-5p 促進缺氧復(fù)氧心肌細胞增殖和抑制凋亡，其機制與靶向KLHDC10 相關(guān)，為心肌損傷的治療奠定理論基礎(chǔ)。本研究的不足之處為實驗結(jié)果并未在動物體內(nèi)和臨床中進行驗證。