張歡歡，王娟，李超

作者單位：1駐馬店市第一人民醫(yī)院新生兒重癥，河南 駐馬店463000；

2駐馬店市第四人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，河南 駐馬店463000

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制涉及多種炎性細(xì)胞、炎性因子和炎性遞質(zhì)［1-2］。中國(guó)兒童哮喘的患病率呈上升趨勢(shì)，尤其是年幼兒童［3-5］。2014 年全球哮喘防治創(chuàng)議指南提出了一種新的哮喘分型-肥胖型哮喘，該型病人臨床表現(xiàn)重、對(duì)常規(guī)哮喘治療藥物反應(yīng)差、病情控制不理想、生活質(zhì)量低下［6］。維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）基因位于12q13.11 號(hào)染色體上，包含11 個(gè)外顯子，其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymor?phisms，SNP）與自身免疫性疾病、哮喘和肥胖癥密切相關(guān)［7-9］。本研究主要檢測(cè)維生素D 水平和VDR基因多態(tài)性與肥胖型哮喘發(fā)病的相關(guān)性，以期為肥胖型哮喘的預(yù)防和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料前瞻性分析2016 年10 月至2019年10 月在駐馬店市第一人民醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科收治的141例兒童哮喘病兒，均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》［10］，無(wú)其他過(guò)敏性疾病、心臟、腎臟和肝臟等主要器官的功能障礙。其中肥胖型哮喘45 例，男25 例，女20 例，年齡（7.2±1.5）歲。非肥胖型哮喘96 例，男57 例，女39 例，年齡（7.6±1.8）歲。收集同期來(lái)該院就診的健康兒童54 例作為對(duì)照組，男29 例，女25 例，年齡（7.4±1.8）歲。無(wú)哮喘家族史和個(gè)人過(guò)敏史。三組間性別（χ2=0.50，P=0.780），年齡（t=1.02，P=0.097）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人近親屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 炎性因子、25 羥維生素D［25-hydroxyvitaminD，25（OH）D］和肺功能檢測(cè)入院時(shí)抽取空腹肘靜脈血5 mL，4 mL 置于低溫（4 ℃）離心機(jī)中，1 500 r/min，離心15 min，吸取上層血清，至于EP 管中，放于?80 ℃超低溫冰箱中保存待用。剩余1 mL 為抽取DNA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所用。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)，病人血清中白介素（IL）-4、IL-7、IL-10、IL-17、IL-33 和25（OH）D 的水平，具體的實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，ELISA 試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司。所有病人接受肺功能檢測(cè)包括：第1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、一秒率、呼氣流量峰值（peakexpira?toryflow，PEF）、殘氣量/肺活量（residual volume/total lung volume，RV/TLV）。

1.3 全血基因組DNA抽提及基因多態(tài)性檢測(cè)將保存的全血樣本，置于37 ℃水浴鍋中融化，按照美國(guó)Gentra公司提供的PUREGENE全血快速基因組DNA提取試劑盒中300μL全血提取基因組DNA的有機(jī)溶劑沉淀法進(jìn)行抽提基因組DNA。抽提的DNA溶解于100μL DNA水合液中，放置65 ℃水浴中1 h，然后檢測(cè)抽提基因組DNA的濃度和純度。通過(guò)Haploview軟件、文獻(xiàn)查閱等方法選擇VDR的SNP位點(diǎn)rs731236、rs1544410、rs1168271和rs2228570，PCR擴(kuò)增及延伸引物由Array Designer 軟件設(shè)計(jì)，北京華大基因科技有限公司合成。rs731236正向引物5′-GGTGGGATTGAGCAGTGAG-3′，反向引物5′-CTTCTGGATC ATCTTGGCATA-3′，rs1544410正向引物5′-GAGGGAGGGAGGAAGGAA-3′，反向引物5′-CTG TAGCAATGAAATCAAACCA-3′，rs1168271正向引物5′-GTGTGTTGGACAGGCGGT-3′，反向引物5′-GCAGTGGTATCACCGGTCA-3′，rs2228570正向引物5′-GGCTCCGAAGGC ACTGTG-3′，反向引物5′-CATAGCATTGAAGTGAAAGCCA-3′。利用SNP基因分型檢測(cè)試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）檢測(cè)選取位點(diǎn)的基因多態(tài)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用LSD 法，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。肥胖型哮喘與SNP位點(diǎn)基因型的關(guān)聯(lián)采用logistic回歸模型進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以?xún)?yōu)勢(shì)比（OR）和95% 置信區(qū)間（95%CI）的形式給出。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較三組兒童炎性因子、25（OH）D 水平肥胖型哮喘組外周血中炎性因子IL-4、IL-7、IL-10、IL-17 和IL-33 與對(duì)照組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肥胖型哮喘組外周血中25（OH）D 水平低于非肥胖型哮喘組和對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組兒童外周血中炎性因子和25（OH）D的檢測(cè)水平比較/± s

表1 三組兒童外周血中炎性因子和25（OH）D的檢測(cè)水平比較/± s

注：IL-4為白介素-4，IL-7為白介素-7，IL-10為白介素-10，L-17為白介素-17，L-33為白介素-33，25（OH）D為25羥維生素D。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與非肥胖型哮喘組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組非肥胖型哮喘組肥胖型哮喘組F值P值25（OH）D/（μg/L）35.6±6.5 23.1±3.5①18.6±3.2①②53.41<0.001例數(shù)54 96 45 IL-4/（ng/L）11.4±2.1 42.7±6.3①40.3±4.7①460.12<0.001 IL-7/（ng/L）5.2±1.4 13.4±2.5①12.6±3.1①104.45<0.001 IL-10/（ng/L）17.6±2.7 5.6±1.8①5.2±1.5①355.10<0.001 IL-17/（ng/L）19.2±5.4 52.4±9.2①55.8±8.6①167.86<0.001 IL-33/（ng/L）61.2±10.6 142.6±14.2①139.3±15.2①535.88<0.001

2.2 比較三組兒童肺功能檢測(cè)結(jié)果三組間FEV1、FVC、一秒率、PEF和RV/TLV比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且肥胖型哮喘組FEV1、一秒率低于非肥胖型哮喘組和對(duì)照組，RV/TLV 高于非肥胖型哮喘組和對(duì)照組，F(xiàn)VC 和PEF 低于對(duì)照組（均P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組兒童肺功能檢測(cè)結(jié)果比較/± s

表2 三組兒童肺功能檢測(cè)結(jié)果比較/± s

注：FEV1為第1秒用力呼氣容積，F(xiàn)VC為用力肺活量，PEF為呼氣流量峰值，RV/TLV為殘氣量/肺活量。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與非肥胖型哮喘組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組非肥胖型哮喘組肥胖型哮喘組F值P值RV/TLV/%34.5±5.6 46.3±11.4①56.2±10.2①②39.57<0.001例數(shù)54 96 45 FEV1/L 90.7±7.3 75.8±8.7①65.2±5.8①②66.90<0.001 FVC/L 86.5±10.5 56.5±8.1①50.3±79①123.54<0.001一秒率/%81.7±7.2 63.4±6.1①58.6±5.9①②43.88<0.001 PEF/（L/s）86.8±11.4 62.5±7.4①58.4±6.2①52.74<0.001

2.3 三組兒童不同基因位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較三組兒童rs2228570 位點(diǎn)AA、AG、GG基因型和A、G 基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

2.4 三組兒童VDR rs2228570 基因型多因素logis?tic回歸分析選擇表3中三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的VDR rs2228570 基因型行l(wèi)ogistic 回歸分析，AA 為肥胖型哮喘的發(fā)生的危險(xiǎn)因素，GG 為肥胖型哮喘的發(fā)生的保護(hù)因素。見(jiàn)表4。

表3 三組兒童不同基因位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較

表4 三組兒童VDR rs2228570基因型多因素logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

兒童哮喘主要由白介素、白三烯、T 淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞引起的氣道炎癥反應(yīng)。在本研究中，非肥胖型哮喘組和肥胖型哮喘組與對(duì)照組相比IL-4、IL-7、IL-17和IL-33炎性因子的水平升高，IL-10的水平降低。IL-4、IL-7 和IL-17 可誘導(dǎo)炎性因子和趨化因子的表達(dá)，IL-33 與其受體結(jié)合后可激活NF-κB和MAPK 信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［11-12］。IL-10對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化有一定的調(diào)節(jié)作用，也可直接參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，為目前公認(rèn)的一種炎癥和免疫抑制因子［13］。非肥胖型哮喘組和肥胖型哮喘組間炎性因子水平卻無(wú)差異，炎性因子IL-4、IL-7、IL-17 和IL-33 和低水平的IL-10 在肥胖型哮喘兒童中監(jiān)測(cè)的臨床價(jià)值不大。在哮喘的發(fā)病過(guò)程中，長(zhǎng)期的炎癥刺激導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，使氣道痙攣狹窄［14-15］。在本研究中，肥胖型哮喘組的通氣測(cè)定指標(biāo)FEV1、FVC、一秒率和PEF 明顯低于非肥胖型哮喘組和對(duì)照組，肥胖型哮喘組肺容量檢測(cè)指標(biāo)RV/TLV 比值顯著高于非肥胖型哮喘組和對(duì)照組。因此，肥胖型哮喘組兒童氣道功能障礙和氣流受限較非肥胖型哮喘組嚴(yán)重。

25（OH）D 與糖蛋白配體結(jié)合后，激活細(xì)胞核內(nèi)的三磷酸腺苷信號(hào)通路傳導(dǎo)，抑制炎性因子激活，減輕炎性因子對(duì)于支氣管平滑肌的影響，保護(hù)平滑肌細(xì)胞膜的完整性［16-17］。本研究中病人外周血中25（OH）D 的水平在肥胖型哮喘中的水平顯著低于非肥胖型哮喘組和對(duì)照組，對(duì)肥胖型哮喘的監(jiān)測(cè)可能具有一定的臨床意義。1，25-二羥基維生素D3通過(guò)抑制氣道炎癥過(guò)程中趨化因子的產(chǎn)生來(lái)減少氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性和氣道重塑［18］。研究顯示，哮喘病人VDR FokI 基因中TT 基因型和T 等位基因攜帶者的頻率顯著高于對(duì)照組［19］。Rodrigues 等［20］研究顯示，哮喘兒童中ApaI的多態(tài)性等位基因（TT）似乎是哮喘的危險(xiǎn)因素，而超重的兒童中，BsmI 的多態(tài)性等位基因似乎是哮喘的危險(xiǎn)因素。在本研究中，肥胖型哮喘組VDR rs2228570位點(diǎn)AA 基因型為肥胖型哮喘的發(fā)生的危險(xiǎn)因素，GG 基因型為肥胖型哮喘的發(fā)生的保護(hù)因素。綜上所述，肥胖型哮喘中維生素D水平顯著降低，AA基因型為肥胖型哮喘的發(fā)生的危險(xiǎn)因素，GG 基因型為保護(hù)因素，為肥胖型哮喘的預(yù)防和治療提供新的方向。