閆凡，黃彩虹

作者單位：榆林市第一醫(yī)院小兒二科，陜西 榆林718000

腎母細(xì)胞瘤又稱為Wilms 瘤，其作為一種胚胎惡性腫瘤在兒童中最為常見(jiàn)［1］。腎母細(xì)胞瘤的病因尚不清楚，其中基因表達(dá)改變是其發(fā)生的重要原因［2］。微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是一種非編碼的RNA，參與細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生［3-4］。miR-183 是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤促進(jìn)因子，在肺癌、膀胱癌、乳腺癌等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，人為的干擾miR-183表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型［5-7］。現(xiàn)階段對(duì)于miR-183在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡中的作用還不明確。本次實(shí)驗(yàn)于2018 年12月至2019 年7 月采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法下調(diào)腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1 細(xì)胞中miR-183 的表達(dá)水平，探討下調(diào)miR-183對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制，以期為靶向基因治療腎母細(xì)胞瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1 細(xì)胞購(gòu)自上海哈靈生物科技有限公司；miR-183 抑制劑（inhibitor）、抑制劑陰性對(duì)照（inhibitor control）、miR-183 模擬物（mimics）和模擬對(duì)照序列（mimics control）由吉滿生物科技（上海）有限公司合成；噻唑藍(lán)（MTT）和膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；程序性細(xì)胞死亡4（programmde cell death 4，PDCD4）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；引物由南京金斯瑞合成；熒光素酶報(bào)告載體由西安淳風(fēng)生物科技有限公司構(gòu)建；活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich；PDCD4 小干擾RNA（si-PDCD4）、小干擾RNA 陰性序列（si-NC）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000分別將miR-183 inhibitor 和inhibitor control 轉(zhuǎn)染到腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞中，具體操作步驟同轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書。設(shè)置轉(zhuǎn)染miR-183 inhibitor 和inhibi?tor control 后的腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1 細(xì)胞為AntimiR-183 組、Anti-NC 組，設(shè)置沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)miR-183 表達(dá)收集培養(yǎng)48 h 以后的對(duì)照組、Anti-NC 組、Anti-miR-183 組細(xì)胞，然后在細(xì)胞內(nèi)添加Trizol 試劑，提取細(xì)胞中總RNA。然后逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。PCR 引物序列如下，miR-183 正向引物：5’-AGUGAAUUCUACCAG UGC?CAUA 3’，反向引物：5’-UAUGGCACUGGUAGA AUUCACU3’；U6正向引物：5’CTCGCTTCGGCAGC?CACA3’，反向引物：5’AACGCTTCACGAATTGC?GT3’。使用SYBR Green 進(jìn)行qRT-PCR，PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃反應(yīng)2 min；95 ℃反應(yīng)10 s；60 ℃反應(yīng)30 s，后兩步設(shè)置45個(gè)循環(huán)，U6為內(nèi)參，結(jié)果用2?ΔΔCt法計(jì)算。

1.4 MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖能力按照對(duì)照組、An?ti-NC 組、Anti-miR-183 組細(xì)胞分組方法將細(xì)胞種植到96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)2 d，加5 g/L 的MTT，培養(yǎng)4 h。然后將上清吸棄，加二甲基亞砜，置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm的吸光度。

1.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞克隆能力把對(duì)照組、Anti-NC 組、Anti-miR-183 組細(xì)胞接種到平皿內(nèi)，培養(yǎng)14 d，觀察出現(xiàn)細(xì)胞克隆。以甲醇固定10 min，使用0.2%的結(jié)晶紫染色，將平皿放在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)≥50 個(gè)細(xì)胞的克隆團(tuán)數(shù)目，隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，計(jì)算均值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡水平收集培養(yǎng)48 h 以后的對(duì)照組、Anti-NC 組、Anti-miR-183 組細(xì)胞，每組收集106個(gè)，將細(xì)胞懸浮在300 μL 的結(jié)合緩沖液中，將Annexin V-FITC 和PI 工作液添加到細(xì)胞中，再加入200 μL 的結(jié)合緩沖液，置于避光條件下結(jié)合反應(yīng)15 min，在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡情況。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）測(cè)定細(xì)胞中cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)收集培養(yǎng)48h 以后的對(duì)照組、Anti-NC 組、Anti-miR-183 組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。將等體積2×上樣緩沖液添加到蛋白樣品中，煮沸5 min。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），每孔上樣30μg 蛋白，電泳2 h后關(guān)閉電源。使用轉(zhuǎn)膜裝置把凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到NC 膜上，轉(zhuǎn)膜條件為4 ℃，轉(zhuǎn)膜電流為400 mA。NC 膜放在封閉液中結(jié)合1 h，將NC 膜放在cleaved-caspase-3 抗體孵育液中，在4 ℃過(guò)夜。NC膜置于二抗反應(yīng)液中結(jié)合2 h。ECL發(fā)光，掃描條帶灰度值，內(nèi)參設(shè)置為β肌動(dòng)蛋白（β-actin）。

1.8 靶基因預(yù)測(cè)和鑒定在線靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan 發(fā)現(xiàn)PDCD4 的3′非翻譯區(qū)（3’UTR）端與miR-183 有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建含有PDCD4 的3’UTR 端的PDCD4 野生型熒光素酶報(bào)告載體（WT），同時(shí)構(gòu)建突變之后的突變型熒光素酶報(bào)告載體（MUT），利用Lipofectamine 2000 把WT 和MUT 分別與mimics control、miR-183 mimics 共轉(zhuǎn)染到腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1 細(xì)胞中，48 h 后，用熒光素酶活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性變化。

1.9 si-PDCD4 對(duì)下調(diào)miR-183 的細(xì)胞增殖、克隆和凋亡影響將Anti-miR-183 與si-NC、Anti-miR-183 與si-PDCD4 共轉(zhuǎn)染到腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1 細(xì)胞中，記為Anti-miR-183+si-NC 組和Anti-miR-183+si-PDCD4組，參照上述MTT 法、平板克隆、流式細(xì)胞術(shù)以及蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定細(xì)胞增殖、克隆、凋亡和cleaved-caspase-3、PDCD4蛋白表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-183 inhibitor 抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中miR-183 表達(dá)對(duì)照組、Anti-NC 組和Anti-miR-183組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中miR-183 表達(dá)水平分別為（1.00±0.09）、（0.98±0.11）和（0.32±0.04）（F=61.82，P<0.001）。與Anti-NC 組比較，Anti-miR-183 組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中miR-183 水平降低（P<0.05），對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 下調(diào)miR-183 對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、克隆和凋亡影響與Anti-NC 組比較，Anti-miR-183 組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、克隆能力下降（P<0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P<0.05）；對(duì)照組各檢測(cè)指標(biāo)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1，表1。

表1 miR-183抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染后腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力（吸光度）、克隆形成數(shù)目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）蛋白水平變化/± s

表1 miR-183抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染后腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力（吸光度）、克隆形成數(shù)目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）蛋白水平變化/± s

注：①與Anti-NC組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組Anti-NC組Anti-miR-183組F值P值cleaved-caspase-3 0.28±0.03 0.27±0.04 0.69±0.09①48.76<0.001重復(fù)次數(shù)333吸光度0.39±0.05 0.40±0.03 0.20±0.02①30.08 0.001克隆形成數(shù)目/個(gè)314.58±23.85 312.87±22.28 213.69±20.94①19.97 0.002凋亡率/%2.45±0.21 2.36±0.32 16.47±1.58①224.56<0.001

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)三組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

2.3 miR-183 與PDCD 靶向關(guān)系預(yù)測(cè)和鑒定在線靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)的PDCD4 的3’UTR 端與miR-183 互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖2。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)TPDCD4 與miR-183 mimics 的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞熒光素酶活性為（0.36±0.04），顯著低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)TPDCD4 與mimics control 的細(xì)胞（1.00±0.12）（t=9.47，P<0.001）；共轉(zhuǎn)染MUT-PDCD4 與miR-183 mimics 的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞熒光素酶活性為0.98±0.10，與共轉(zhuǎn)染MUT-PDCD4 與mimics control 的細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.00±0.12）（t=0.22，P=0.835），說(shuō)明miR-183靶向結(jié)合PDCD4。

圖2 在線靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan預(yù)測(cè)的程序性細(xì)胞死亡4（PDCD4）的3′非翻譯區(qū)（3’UTR）端與miR-183互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)

2.4 下調(diào)miR-183 對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PDCD4 蛋白表達(dá)影響對(duì)照組、Anti-NC 組和Anti-miR-183 組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PDCD4 蛋白水平分別為（0.36±0.04）、（0.37±0.06）和（0.89±0.07）（F=81.89，P<0.001）。與Anti-NC 組比較，Anti-miR-183 組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PDCD4 蛋白水平升高（P<0.05），對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)三組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞PDCD4蛋白表達(dá)

2.5 si-PDCD4 對(duì)下調(diào)miR-183 的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、克隆和凋亡的逆轉(zhuǎn)作用與Anti-miR-183+si-NC 組比較，Anti-miR-183+si-PDCD4 組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和克隆能力升高，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞中cleaved-caspase-3、PDCD4 蛋白表達(dá)水平下降（均P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 程序性細(xì)胞死亡4（PDCD4）小干擾RNA（si-PDCD4）和miR-183抑制劑（inhibitor）共轉(zhuǎn)染后腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力（吸光度）、克隆形成數(shù)目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）、PDCD4蛋白水平變化/± s

表2 程序性細(xì)胞死亡4（PDCD4）小干擾RNA（si-PDCD4）和miR-183抑制劑（inhibitor）共轉(zhuǎn)染后腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力（吸光度）、克隆形成數(shù)目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）、PDCD4蛋白水平變化/± s

組別Anti-miR-183+si-NC組Anti-miR-183+si-PDCD4組t值P值重復(fù)次數(shù)33吸光度0.21±0.03 0.32±0.04 3.81 0.019克隆形成數(shù)目/個(gè)216.20±13.68 286.47±20.65 4.91 0.008凋亡率/%17.93±1.64 10.79±1.28 5.95 0.004 cleaved-caspase-3 0.72±0.08 0.30±0.03 8.51<0.001 PDCD4 0.86±0.09 0.45±0.05 6.90 0.002

3 討論

腫瘤發(fā)生與腫瘤細(xì)胞失控性生長(zhǎng)有關(guān)，是一個(gè)多步驟、復(fù)雜過(guò)程，在腫瘤進(jìn)展中，癌基因表達(dá)上調(diào)和抑癌基因表達(dá)下調(diào)均可以誘導(dǎo)腫瘤惡性進(jìn)展［8］。miRNA 是廣泛存在于真核生物體內(nèi)的單鏈RNA，其可以通過(guò)影響基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)而參與細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程［9］。多項(xiàng)研究顯示，miRNA與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，參與調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)、凋亡等生物學(xué)特性發(fā)揮過(guò)程，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用［10-11］。miR-183在進(jìn)化上高度保守，可以通過(guò)影響腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控腫瘤的發(fā)展［12］。在肺癌中發(fā)現(xiàn)miR-183可以作為一種腫瘤促進(jìn)因子誘導(dǎo)肺癌的生長(zhǎng)［13］。還有研究報(bào)道，在肝癌、前列腺癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-183 的促腫瘤生長(zhǎng)作用，其被認(rèn)為是一種腫瘤促進(jìn)因子［14-15］。本次實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)miR-183后的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和克隆能力下降，提示下調(diào)miR-183 具有抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的作用。

本研究結(jié)果還顯示，下調(diào)miR-183 后的腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡水平升高，細(xì)胞中cleaved-caspase-3蛋白水平也升高。胱天蛋白酶（caspase）蛋白家族含有十幾個(gè)家族成員，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，是目前發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的調(diào)控因子［16］。caspase蛋白家族成員在凋亡反應(yīng)中發(fā)揮起始因子、執(zhí)行因子等不同作用，并且正常情況下以酶原形式存在的caspase 蛋白家族成員不具備活性，只有被激活后才可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生［17］。cleaved-caspase-3 是胱天蛋白酶-3（caspase-3）的活化形式，caspase-3 是凋亡反應(yīng)的執(zhí)行因子，位于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，其活化后是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志［18］。本次結(jié)果顯示，下調(diào)miR-183 促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明下調(diào)miR-183誘導(dǎo)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。

miRNA 具有多種生物學(xué)作用，其生物學(xué)作用的發(fā)揮與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)有關(guān)［19］。研究表明，miR-183 作用機(jī)制與靶向調(diào)控多個(gè)靶基因有關(guān)，并且其在不同的病理過(guò)程中調(diào)控的靶基因不同［20］。本次實(shí)驗(yàn)顯示，PDCD4 是miR-183 的靶基因，miR-183 作用機(jī)制在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制可能與PDCD4 有關(guān)。PDCD4 是一個(gè)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的腫瘤抑制因子，在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)PDCD4 可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖抑制［21］。本研究證實(shí)，下調(diào)PDCD4 可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-183 對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，提示下調(diào)miR-183通過(guò)靶向調(diào)控PDCD4的表達(dá)影響腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡。

總之，下調(diào)miR-183 可以阻礙腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞惡性生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且其作用機(jī)制與靶向調(diào)控PDCD4 的表達(dá)有關(guān)，靶向抑制miR-183 可能是腎母細(xì)胞瘤治療的途徑，miR-183 在腎母細(xì)胞瘤中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)在多株腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討。