譚莉霞，楊文義，閆春曉，王航宇，楊丙信，徐夢陽，武利萍

作者單位：河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 開封475000

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，被認(rèn)為是第四大最常見的腫瘤類型，也是全世界癌癥相關(guān)死亡的第二大原因［1］。由于胃癌早期多無明顯癥狀，大多數(shù)胃癌病例在診斷時已發(fā)展為晚期，很大概率地限制了治療范圍。因此，對胃癌發(fā)病機(jī)制的研究對改進(jìn)預(yù)防策略、開發(fā)早期診斷及管理治療方法是必要的。近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在癌癥中的作用越來越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA 可參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及翻譯進(jìn)而參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程［2-3］。小核仁RNA宿主基因4（small nucleolar RNA host gene 4，SN?HG4）是一類小非編碼RNA 分子，參與rRNAs、tRNAs、snRNAs 等其他RNA 的化學(xué)修飾［4］。最新研究報道稱，SNHG4 表達(dá)上調(diào)與肝癌病人低生存率有關(guān)，是肝癌預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子［5］。Xu 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA SNHG4在骨肉瘤中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤大小及病人不良預(yù)后有關(guān)。上述研究表明LncRNA SNHG4 在多種癌癥中差異性表達(dá)并對腫瘤進(jìn)展起重要作用。本研究利用生物信息學(xué)方法通過iBio Tools v5.0 分析發(fā)現(xiàn)SNHG4 在胃癌中的表達(dá)水平明顯升高，通過檢測胃癌組織中Ln?cRNA SNHG4 表達(dá)水平，分析其與病人臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系，以期為臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015 年1 月至2016 年10 月于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科行手術(shù)根治術(shù)切除的113 例胃癌組織及82 例癌旁正常胃黏膜組織為研究對象。113 例胃癌病人中，男68 例，女45 例，年齡≥50 歲的66 例，<50 歲的47 例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期42 例，Ⅲ～Ⅳ期71 例；低分化73 例，中高分化40 例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移79 例，未轉(zhuǎn)移34 例。所有胃癌病人均經(jīng)病理組織診斷確診，均為首次治療，術(shù)前未行放、化療或其他抗腫瘤藥物治療，病人臨床病理資料及隨訪資料完整。排除合并其他腫瘤病人及自身免疫性疾病病人。所有病人知情同意此次研究，本研究獲得河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（20150213）。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫來源 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個全面的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，是基于癌癥基因組圖譜（the can?cer genome atlas，TCGA）分析和可視化目標(biāo)基因的網(wǎng)站，可實現(xiàn)相關(guān)癌癥基因生物標(biāo)志物鑒定、表達(dá)圖譜分析、生存分析等。本研究基于上述數(shù)據(jù)庫，對SNHG4 在胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中表達(dá)差異進(jìn)行比較。

1.2.2 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測LncRNA SNHG4 表達(dá)水平 首先按照Trizol 試劑盒（日本Takara 公司）說明書方法對胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織進(jìn)行總RNA 的提取，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Applied Biosystem 公司）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），采用qRT-PCR 法檢測LncRNA SNHG4 表達(dá)水平。qRT-PCR 反應(yīng)體系共20 μL，其中SYBR Green qPCR Mix 10 μL，cD?NA 2 μL，正、反向引物各1 μL，雙蒸水6 μL。Ln?cRNA SNHG4 以β 肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成。LncRNA SNHG4 正向引物：5’-GCAGGTGA?CAGTCTGCATGT-3’，反向引物：5’-TTTTA?AGTCCCCTACCCCCATC-3’；β-actin 正向引物：5’-TGCTGTCCCTGTATFCCTCT-3’，反向引物：5’-TGATGTCACGCACGATTTT-3’。循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，90 ℃變性15 s，65 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。利用2?ΔΔCt法計算LncRNA SNHG4 相對表達(dá)水平。

1.3 隨訪所有胃癌病人術(shù)后均以電話或門診形式進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期為2020 年10 月，隨訪時間范圍為6～57 個月，中位隨訪時間21 個月，以病人死亡為隨訪終點事件。到隨訪日期結(jié)束，共計死亡72例，存活31例，失訪10例，即72例發(fā)生終點事件。統(tǒng)計胃癌病人生存時間，繪制Kaplan-Meier 生存曲線，比較不同LncRNA SNHG4 表達(dá)水平病人生存情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與分析。計數(shù)資料以例（%）表示；基于R 語言的survivalROC 包完成時間依賴性ROC 曲線繪制，同時通過約登指數(shù)獲取用于生存分析分組的最佳閾值點。采用χ2檢驗分析LncRNA SNHG4 表達(dá)水平與胃癌病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系；生存分析采用Kaplan-Meier 法，組間生存曲線差異用log-rank 檢驗；多因素Cox 回歸分析影響胃癌病人預(yù)后不良的危險因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫分析SNHG4基因在胃癌組織及正常組織中的表達(dá)情況TCGA 數(shù)據(jù)庫顯示，SNHG4 基因在415 例胃癌組織中的表達(dá)水平為（1.95±0.62），明顯高于其在34 例正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平（0.43±0.12）（t=14.26，P<0.001）。

2.2 LncRNA SNHG4在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平LncRNA SNHG4 在113 例胃癌組織中的表達(dá)水平為（1.67±0.64），明顯高于其在82例癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平（0.98±0.12）（t=9.63，P<0.001）。

2.3 胃癌組織中LncRNA SNHG4表達(dá)情況與病人臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用survivalROC 包繪制時間依賴性ROC 曲線，得到最佳截斷值為1.816，故本研究以LncRNA SNHG4 水平是否大于1.816 將病人分為LncRNA SNHG4高表達(dá)組（>1.816）和低表達(dá)組（≤1.816）。結(jié)果顯示，LncRNA SNHG4 水平高低與胃癌病人年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤位置無關(guān)（P>0.05），與病人臨床分期、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），見表1。

表1 胃癌組織中LncRNA SNHG4表達(dá)情況與病人臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系/例（%）

2.4 LncRNA SNHG4表達(dá)水平與胃癌病人生存時間的關(guān)系Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，Ln?cRNA SNHG4 高表達(dá)組胃癌病人5 年累積生存率為28.85%，中位生存時間16.0 個月；LncRNA SNHG4低表達(dá)組胃癌病人5 年累積生存率為42.62%，中位生存時間27.0個月，log-rank檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.05，P<0.001）。

2.5 影響胃癌病人發(fā)生終點事件的單因素分析胃癌病人年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤位置與終點事件發(fā)生無關(guān)（P>0.05），臨床分期、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與終點事件發(fā)生有關(guān)（P<0.05），見表2。

表2 影響胃癌病人發(fā)生終點事件的單因素分析結(jié)果/例（%）

2.6 影響胃癌病人預(yù)后不良的多因素Cox 回歸分析將臨床分期、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及LncRNA SNHG4 水平作為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、浸潤深度T3～T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ln?cRNA SNHG4高表達(dá)是影響胃癌病人預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素（P<0.05），見表3。

表3 影響胃癌病人113例預(yù)后不良的多因素Cox回歸分析

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種基因共同作用，各個基因構(gòu)成基因網(wǎng)絡(luò)，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖分化、遷移侵襲等生理病理過程參與胃癌進(jìn)展各個階段［7］。多項研究表明，基因的致癌作用主要是通過基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)編碼實現(xiàn)的［8-10］。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)，不到2%的人類基因組是編碼基因，而超過90%的基因是在大多數(shù)系統(tǒng)中起調(diào)節(jié)作用的非編碼基因，可在表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后等不同水平調(diào)控基因表達(dá)［11-12］。LncRNA 是一類長度超過200 bp 的功能性RNA 分子，由于缺失開放性閱讀框而丟失編碼蛋白功能，其在胃癌中的作用研究近年來成為熱點。國內(nèi)學(xué)者符偉玉等［13］通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，利用LncRNA BC002811 構(gòu)建的病毒載體在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)，可提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力。周士誠等［14］發(fā)現(xiàn)，LncRNA-C21orF96 在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)能顯著調(diào)控miR-875-5p 表達(dá)同時促進(jìn)USF2 基因表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。另有報道稱，LncRNA LOXL1-AS1 在胃癌組織和細(xì)胞中高度表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)預(yù)示胃癌的預(yù)后不良，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LOXL1-AS1 通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，加速胃癌腫瘤的惡化［15］。另有其他研究發(fā)現(xiàn)LncRNA 通過靶向調(diào)控miRNA 或蛋白表達(dá)，參與胃癌細(xì)胞的增殖、遷移等生理病理過程［16-17］。以上研究提示，多種LncRNA 參與胃癌的發(fā)展進(jìn)程，然而LncRNA SNHG4在胃癌中作用尚缺乏研究。

隨著研究的不斷進(jìn)展，LncRNA SNHGs 在消化道腫瘤中的作用越來越受到關(guān)注。SNHG1 作為SNORD22 的宿主基因，其位于染色體11q13，SNORD22 位于細(xì)胞核［18］。隨后，SNHG3、SNHG5 等相繼被報道。Wang 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，SNHG7 在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，體外實驗證實抑制SN?HG7 表達(dá)可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期停滯在G1/G0 期，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SN?HG7 可通過調(diào)節(jié)p15 和p16 表達(dá)部分參與胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，LncRNA SNHG4 在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，且其表達(dá)水平與病人臨床分期、腫瘤分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明SNHG4在胃癌中呈高表達(dá)，可能發(fā)揮癌基因作用，并參與胃癌病人腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移等病理過程，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗。Zhang等［20］利用TCGA 數(shù)據(jù)庫評估了SNHG12 表達(dá)與胃癌病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，SNHG12 表達(dá)越高，腫瘤浸潤深度越大，病人生存率越低；體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)SNHG12 通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/AKT 通路誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生。本研究進(jìn)一步分析SNHG4 水平與胃癌病人生存時間的關(guān)系，結(jié)果顯示，LncRNA SNHG4 高表達(dá)胃癌病人5 年累積生存率明顯低于低表達(dá)病人；多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、浸潤深度T3～T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA SNHG4 高表達(dá)是影響胃癌病人預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素，LncRNA SN?HG4 高表達(dá)病人預(yù)后不良風(fēng)險是低表達(dá)的2.045倍，提示LncRNA SNHG4 表達(dá)水平與胃癌病人預(yù)后有關(guān)，可能作為胃癌病人預(yù)后的獨立預(yù)測因子。

綜上所述，LncRNA SNHG4 在胃癌組織中表達(dá)升高，與病人臨床分期、腫瘤分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其高表達(dá)是胃癌病人預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素，可能為胃癌病人預(yù)后評估提供參考。本研究僅在臨床病理方面分析了的LncRNA SNHG4 表達(dá)差異，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步細(xì)胞實驗研究及驗證。