劉菲菲，席照亮，劉秋月

作者單位：1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院口腔科，北京 100050；

2民航總醫(yī)院口腔科，北京 100025

舌癌是一種發(fā)病率非常高的癌癥［1］，其中舌鱗狀細(xì)胞癌是舌癌中最常見的類型，約占所有類型的80%，并以其高轉(zhuǎn)移和增殖能力著稱，通常會導(dǎo)致言語、咀嚼功能障礙，病死率很高［2-3］。對于舌鱗狀細(xì)胞癌的治療，目前多采用手術(shù)聯(lián)合放化療的方式，其中由于放射療法的不斷應(yīng)用、進(jìn)步和完善，其在早期及晚期舌癌的治療中有著重要的作用［1，4］。但長時(shí)間的輻射暴露容易導(dǎo)致舌癌細(xì)胞出現(xiàn)輻射抗性，故對舌癌放療增敏藥物的開發(fā)成為了近些年研究的重點(diǎn)［5］。

原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSP）是植物中存在的一種富含酚羥基的物質(zhì)，在葡萄籽提取物中，約90%的成分為GSP，易獲取并且天然無毒［6］。目前相關(guān)的實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，GSP 具有多種藥理作用，例如有效的抗炎和抗氧化作用［6-8］。并且，越來越多的研究也發(fā)現(xiàn)GSP 能在一定程度上抑制癌細(xì)胞的增殖［9-10］，另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，GSP用于肺癌細(xì)胞時(shí)，具有一定的放射增敏作用［11］。而本研究于2019 年3 月至2020 年2 月選取了體外培養(yǎng)的人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113 細(xì)胞，旨在探索GSP 對于Tca8113細(xì)胞放射敏感性的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑與儀器人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113購自中國科學(xué)院細(xì)胞研究所；GSP購自北京索萊寶科技有限公司（批號P7230）；DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基采購自美國PAA公司，胎牛血清采購自美國Hyclone 公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annex?in V-FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均采購自美國BD 公司；RT-PCR 試劑盒采購自美國Ther?mo 公司；BCA 試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗均購自美國CST 公司；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)試劑盒采購自TaqMan 公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱采購自美國Thermo 公司；6 MV X 線直線加速器采購自德國西門子公司；流式細(xì)胞儀采購自美國Beckman Coulter 公司；酶標(biāo)儀采購自美國Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)以含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5%二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)人舌癌Tca8113細(xì)胞，每2天換1次液，3～4 d傳1次代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 MTT 法將對數(shù)期生長的人舌癌Tca8113 細(xì)胞接種在96 孔板中，每4 000 個(gè)細(xì)胞/孔，每孔100μL 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GSP 的濃度在20 mg/L 時(shí)，對細(xì)胞沒有明顯毒害作用，當(dāng)超過20 mg/L 時(shí)，其毒性作用增加［12］，故分為Tca8113 細(xì)胞對照組（Tca CON），Tca8113 細(xì)胞加10 mg/L GSP組（Tca GSP-10 mg/L）、Tca8113 細(xì)胞加20 mg/L GSP組（Tca GSP-20 mg/L）、Tca8113 細(xì)胞照射組（Tca IR）、Tca8113 細(xì)胞照射加10 mg/L GSP 組（Tca IR+GSP-10 mg/L）、Tca8113 細(xì)胞照射加20 mg/L GSP 組（Tca IR+GSP-20 mg/L）。吸去培養(yǎng)基后，以排槍將100 μL 含有相應(yīng)濃度GSP 的DMEM 高糖培養(yǎng)基加入各組96 孔板中，常規(guī)組（不需照射組）作用48 h，需照射的組別在加入對應(yīng)的培養(yǎng)基作用24 h 后，即行照射（6 Gy），照射24 h 后，每孔加入5 g/L 的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，每孔加入150μL 的二甲基亞砜，使形成的結(jié)晶均勻溶解后，酶標(biāo)儀562 nm 檢測各濃度組吸光度，并計(jì)算細(xì)胞的生長抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)將對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞接種在96 孔板中（每孔1×105/mL），分組同MTT 法，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入含有相應(yīng)濃度GSP 的培養(yǎng)基作用24 h，并以6 Gy 的劑量對需照射的組別進(jìn)行照射，照后24 h 收集全部細(xì)胞于離心管內(nèi)，常規(guī)組（不需照射組）作用48 h，收集全部細(xì)胞于離心管內(nèi)，以1 000 r/min 離心5 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌并離心2 次。隨后，將500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 染色溶液加入混勻后在避光條件下室溫中反應(yīng)15 min，通過流式細(xì)胞儀檢測，并用其自帶軟件分析各組細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.5 qRT-PCR首先根據(jù)TaqMan miRNA ABC Purification 試劑盒的說明，在不同濃度GSP 培養(yǎng)的Tca8113 細(xì)胞中特異性提取微小RNA（miR）。分光光度計(jì)檢測核酸濃度，以吸光度比A260nm/A280nm評估RNA 的純度，并將評估合格的RNA 保存在?80 ℃。其次，以miR為模板，應(yīng)用TaqMan MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR 合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。最后，以上一步合成的cDNA作為模板，利用TaqMan?Mi?croRNA Assays 試劑盒進(jìn)行qPCR 定量各組miR-124的含量。并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為miR-124 的內(nèi)源對照，使用Allele ID 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物 ，miR-124 正 向 引 物 5′CUCCUCUGAAA?CAGCUGCCUUA3′，反向引物：5′CCGUAAGUGGC?GCACGGAAUCG3′；GAPDH 正向引物5′GTCT?GCTCTGACTTCAACAGAG3′，反向引物：5′AC?CAACCTGTCGCTGTAGCAAA3′，使用2?ΔΔCt方法計(jì)算基因表達(dá)相對量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）將收集的細(xì)胞在蛋白裂解液中裂解30 min，超聲后在4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min。通過BCA 試劑盒定量蛋白濃度，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的蛋白質(zhì)，之后在4 ℃下進(jìn)行300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜［聚偏二氟乙烯（PVDF）膜］。隨后將膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，在4 ℃下用抗B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2），胱天蛋白酶-9（caspase-9），以及β 肌動蛋白（β-actin）的一抗過夜孵育，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗在室溫下保持1 h，最后進(jìn)行ECL 顯影曝光檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用±s進(jìn)行計(jì)量數(shù)據(jù)表示，以Graph Pad Prism 6.0 軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)；采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，當(dāng)P<0.05 時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的GSP 對Tca8113 細(xì)胞抑制率的影響Tca CON 組、Tca GSP-10 mg/L 組及Tca GSP-20 mg/L 組Tca8113 細(xì)胞存活率分別為（98.51±3.96）%、（96.52±2.37）%、（95.89±3.65）%（F=0.65，P=0.555），表明人舌癌Tca8113 細(xì)胞生長增殖在加入GSP（10 mg/L GSP、20 mg/L GSP）作用后，其增殖抑制率沒有明顯差別，對細(xì)胞沒有明顯毒害作用，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分組照射后，Tca IR 組、Tca IR+GSP-10 mg/L組及Tca IR+GSP-20 mg/L 組Tca8113 細(xì)胞存活率分別（63.21±2.97）%、（41.19±4.33）%及（19.61±2.51）%（F=126.30，P<0.001），GSP 加強(qiáng)了照射后對人舌癌Tca8113 細(xì)胞的抑制，且隨藥物濃度的增大，抑制效果增強(qiáng)（P<0.05），這說明GSP 對人舌癌Tca8113 細(xì)胞有放射增敏效果，且隨藥物劑量的增加，放射增敏效果增強(qiáng)。

2.2 GSP 提高了照射后引發(fā)的人舌癌Tca8113 細(xì)胞的凋亡通過Annexin-V/PI 雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測Tca8113 細(xì)胞在不同組別的凋亡水平變化。A、B、C 組為未照射組，細(xì)胞凋亡率分別為（5.57±1.02）%、（5.86±1.09）%、（6.22±1.14）%（F=0.54，P=0.593）；D、E、F 組為照射組，細(xì)胞凋亡率分別為（7.62±0.27）%、（9.61±0.42）%、（17.50±0.37）%（F=55.77，P=0.001），加入GSP 的E、F 組照射后細(xì)胞凋亡率明顯大于單純照射組D組（P<0.05）。該結(jié)果顯示GSP 對人舌癌Tca8113 細(xì)胞具有明顯的放射增敏作用，且隨著藥物劑量的增加，其放射增敏效果增強(qiáng)。

2.3 GSP 上調(diào)了Tca8113 細(xì)胞中miR-124 的表達(dá)水平通過qRT-PCR 檢測在不同濃度GSP 作用下，照射后Tca IR 組、Tca IR+GSP-10 mg/L 組及Tca IR+GSP-20 mg/L組Tca8113細(xì)胞miR-124的表達(dá)水平分別（1.43±0.29）、（2.64±0.45）及（3.81±0.44）（F=26.54，P=0.001），與單純照射組相比，照射（6 Gy）給藥組（10 mg/L GSP，20 mg/L GSP）miR-124的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.05）。

2.4 GSP 調(diào)節(jié)了Tca8113細(xì)胞中Bcl-2和caspase-9的表達(dá)水平Tca CON組、Tca GSP-10 mg/L組及Tca GSP-20 mg/L 組Tca8113 細(xì)胞中Bcl-2 及caspase-9 蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與單純照射組相比，照射（6 Gy）給藥組（10 mg/L GSP，20 mg/L GSP），Bcl-2 表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），而caspase-9的表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），表明GSP 顯著提高了IR誘導(dǎo)的Tca8113凋亡水平。見圖1、表1。

表1 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113中Bcl-2和caspase-9蛋白表達(dá)比較/± s

表1 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113中Bcl-2和caspase-9蛋白表達(dá)比較/± s

注：Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2，caspase-9為胱天蛋白酶-9。①與Tca IR組相比，P<0.05。

組別Tca CON Tca GSP-10 mg/L Tca GSP-20 mg/L F值P值Tca IR Tca IR+GSP-10 mg/L Tca IR+GSP-20 mg/L F值P值caspase-9 1.00±0.00 1.13±0.18 1.24±0.27 2.47 0.118 1.97±0.33 2.58±0.43①2.94±0.52①7.67 0.005重復(fù)次數(shù)666666 Bcl-2 1.00±0.00 0.92±0.14 0.87±0.16 1.71 0.213 0.77±0.25 0.43±0.23①0.31±0.17①7.10 0.006

圖1 原花青素（GSP）調(diào)節(jié)了人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113中Bcl-2和caspase-9的蛋白表達(dá)（蛋白質(zhì)印跡法）

3 討論

本研究采用MTT 法研究了加入不同濃度GSP對照射后Tca8113 細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，GSP對舌癌Tca8113 細(xì)胞具有良好的放射增敏效果，且藥物濃度越高，其放射增敏效果越強(qiáng)。為初步探索其放射增敏效果的機(jī)制，我們采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Annexin V-PI 雙染凋亡檢測技術(shù)評價(jià)了加入不同濃度GSP 照射后的細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)其明顯提高了Tca8113 的細(xì)胞凋亡水平；另外，qRT-PCR 結(jié)果表明GSP 顯著上調(diào)了照射后Tca8113 細(xì)胞的miR-124 的表達(dá)水平，同時(shí)蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，加入GSP照射后，Tca8113 細(xì)胞Bcl-2 表達(dá)水平明顯下降，而caspase-9 的表達(dá)水平明顯升高。初步顯示GSP 對Tca813細(xì)胞的放療增敏作用與miR-124的過表達(dá)及凋亡通路因子Bcl-2下調(diào)、caspase-9上調(diào)有關(guān)。

miR-124 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的miR 之一而成為近年來的熱點(diǎn)［13］。近年來也有研究指出miR-124 的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［14］。有研究報(bào)道，miR-124 可靶向作用于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4、CDK6、細(xì)胞周期蛋白D2，從而抑制黑色素瘤的生長［15］；也有報(bào)道指出，miR-124 的過表達(dá)可減緩乳腺癌［16］、肺癌［17］、鼻咽癌［18］細(xì)胞的增殖；另外也有研究就miR-124 與胃癌之間的關(guān)系進(jìn)行了報(bào)道，指出miR-124 可通過抑制胃癌中的EZH2 減緩癌細(xì)胞的增殖，并通過JNK的活化移至線粒體的周圍，進(jìn)而抑制了Bcl-2 的表達(dá)，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡［19］；更有研究指出，miR-124 的過表達(dá)可提高結(jié)直腸癌的放射敏感性［20］。本研究的結(jié)果中，加入GSP 照射后，miR-124上調(diào)明顯，Tca8113 細(xì)胞增殖受到抑制，并且凋亡通路因子Bcl-2 表達(dá)下降，凋亡起始蛋白caspase-9 表達(dá)上調(diào)，加強(qiáng)了癌細(xì)胞的凋亡水平，從而進(jìn)一步提高了其放射敏感性。

GSP 是植物中廣泛存在的一類多酚類化合物，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基高效的天然抗氧化劑，具有很強(qiáng)的體內(nèi)活性［21］。相關(guān)研究表明，GSP 的抗自由基氧化能力是維生素E 的50 倍，是維生素C 的20 倍，并且吸收迅速完全，代謝半衰期可達(dá)7 h 之久［22］。目前，多種動物實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究的結(jié)果說明，GSP 無毒、無致突變性、無致癌性、無致畸胎性、無致敏性［23-25］，并且本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GSP 對舌癌細(xì)胞具有良好的放射增敏效果，這使其在成品放療增敏藥物的研發(fā)上具有較大的優(yōu)勢和潛力。