厲廣洲

作者單位：日照心臟病醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 日照276800

心肌缺血再灌注損傷是心血管疾病中常見的主要病理特征，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞損傷是治療心肌缺血再灌注損傷的重要途徑之一［1-3］。研究表明中藥具有保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用［4］。飛燕草素葡萄糖苷（delphinidin glucoside，DPg）是飛燕草素與葡萄糖以糖苷鍵結(jié)合產(chǎn)生的一種花色苷化合物，有顯著的抗氧化活性，DPg能顯著抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［5］。DPg還可通過減少高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS 生成，從而減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［6］。DPg 可顯著抑制血小板活化和血栓形成，有助于預(yù)防心血管疾病［7］。研究表明微小RNA（mi?croRNA，miRNA/miR）也參與調(diào)控了心肌缺血再灌注損傷的進(jìn)展，其可作為治療靶點(diǎn)［8-10］。有研究發(fā)現(xiàn)miR-106a 在體內(nèi)外肥厚心肌中均上調(diào)表達(dá)，miR-106a 是促進(jìn)肥大的重要因素［11］。在大鼠腎臟缺血再灌注損傷后期miR-106a 的表達(dá)水平顯著升高［12］。然而DPg 和miR-106a對(duì)缺氧復(fù)氧（H/R）引起的心肌細(xì)胞損傷的影響還尚未可知，2018 年4 月至2019 年10 月，本實(shí)驗(yàn)以H/R 復(fù)制心肌細(xì)胞H9C2 體外缺血/再灌注環(huán)境［13］，觀察DPg 在此過程中是否具有保護(hù)作用，及其機(jī)制是否與miR-106a有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料心肌細(xì)胞H9C2購自深圳市百恩維生物科技有限公司；DPg 購自上海惠誠生物科技有限公司；MTT 法試劑盒、蛋白提取試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）和碘化丙啶試劑盒購自北京Beyotime Biotech?nology 公司；Trizol 試劑、熒光定量試劑盒、Lipo?fectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與H/R 處理 H9C2 細(xì)胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。

H/R：H9C2 細(xì)胞在無血清低糖的DMEM 中，置于入95%氮?dú)?5%二氧化碳的缺氧培養(yǎng)箱中保持2 h，然后更換為含10 % 胎牛血清的高糖DMEM，37 ℃、5%二氧化碳的無菌箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。正常條件培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 用終濃度為50 μmol/L、100 μmol/L、1 000 μmol/L 的DPg 培養(yǎng)液處理H9C2細(xì)胞24 h，而后進(jìn)行H/R 處理，分別記為H/R+50μmol/L DPg 組、H/R+100 μmol/L DPg 組、H/R+1 000μmol/L DPg 組；抗miR-106a（anti-miR-106a）陰性對(duì)照（anti-miR-con）、anti-miR-106a 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后進(jìn)行H/R 處理記為H/R+anti-miR-con 組，H/R+anti-miR-106a 組。 miR-106a 陰性對(duì)照（miRcon）、miR-106a 分別轉(zhuǎn)染至H9C2 細(xì)胞中同時(shí)用100μmol/L的DPg處理24 h，而后進(jìn)行H/R處理，記為H/R+DPg+miR-con組，H/R+DPg+miR-106a組。上述載體質(zhì)粒均構(gòu)建自金瑞斯公司。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性 各組H9C2 細(xì)胞分別加入20 μL 的噻唑藍(lán)（MTT）溶液，繼續(xù)孵育4 h；加入150 μL DMSO 振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度值。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值×100%。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）蛋白表達(dá)水平 提取各組H9C2 細(xì)胞總蛋白，二辛可寧酸法測(cè)定濃度后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別4 ℃加入一抗，過夜；室溫加入二抗，孵育2 h；暗室中曝光顯影，晾干后用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后用胰蛋白酶消化，預(yù)冷PBS 洗滌后重懸。按照Annexin V-FITC 和碘化丙啶試劑盒說明書，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)miR-106a 表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 純度和濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA），按照熒光定量使用說明書，在95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；60 ℃延長5 min 的循環(huán)條件下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。相對(duì)表達(dá)量采用2?ΔΔCt法計(jì)算。miR-106a 正向引物序列：5′-AAAAGTGCTTACAGTG?CAGGTAG-3′，反向引物序列：5′-CTACCTGCACTG?TAAGCACTTTT-3′；內(nèi)參U6 正向引物序列：5′-ATT?GGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以±s表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD 法。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPg 對(duì)H9c2 細(xì)胞的增殖的影響以下各組細(xì)胞存活率比較，F(xiàn)=23.56，P<0.001。與對(duì)照組相比，H/R 組H9C2 細(xì)胞存活率［（46.38±4.65）% 比（100.86±10.08）%］顯著降低；與H/R 組相比，50、100、1 000 μmol/L 濃度DPg 處理組H9C2 細(xì)胞存活率［（60.03±6.01）%、（83.76±8.38）%、（85.38±8.50）%比（46.38±4.65）%］顯著升高。均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 DPg 對(duì)H9C2 細(xì)胞凋亡的影響H/R 組cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率均比對(duì)照組顯著升高（P<0.05）；H/R+100μmol/L DPg 組cleavedcaspase-3 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率均比H/R 組降低（P<0.05）。見圖1、表1。

表1 DPg對(duì)各組心肌細(xì)胞H9C2凋亡影響的研究/± s

表1 DPg對(duì)各組心肌細(xì)胞H9C2凋亡影響的研究/± s

注：DPg為飛燕草素葡萄糖苷，H/R為缺氧復(fù)氧，cleaved-caspase-3為活化胱天蛋白酶-3。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與H/R組比較，P<0.05。

重復(fù)次數(shù)細(xì)胞凋亡率/%7.05±0.71 18.35±1.83①10.25±1.03②62.13<0.001組別對(duì)照H/R H/R+100μmol/L DPg F值P值333 cleaved-caspase-3 0.25±0.02 0.88±0.09①0.42±0.04②94.66<0.001

圖1 飛燕草素葡萄糖苷（DPg）對(duì)各組心肌細(xì)胞H9C2凋亡的影響

2.3 DPg 對(duì)miR-106a 表達(dá)的影響以下各組miR-106a 表達(dá)水平比較，F(xiàn)=100.08，P<0.001。與對(duì)照組（1.00±0.11）相比，H/R 組miR-106a 表達(dá)水平（3.56±0.36）顯著升高（P<0.05）；與H/R 組相比，H/R+100μmol/L DPg 組miR-106a 表達(dá)水平（1.53±0.15）顯著降低（P<0.05）。

2.4 miR-106a 低表達(dá)對(duì)H9C2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響H/R 組miR-106a、cleaved-caspase-3 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率比對(duì)照組顯著升高，cyclin D1表達(dá)水平、存活率比對(duì)照組顯著降低（P<0.05）；H/R+antimiR-106a 組miR-106a、cleaved-caspase-3 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率比H/R+anti-miR-con 組顯著降低，cyclin D1 表達(dá)水平、存活率比H/R+anti-miR-con 組顯著升高（P<0.05）。見圖2、表2。

表2 miR-106a低表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖和凋亡的影響/± s

表2 miR-106a低表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖和凋亡的影響/± s

注：H/R為缺氧復(fù)氧，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，cleaved-caspase-3為活化胱天蛋白酶-3。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與H/R+anti-miR-con組比較，P<0.05。

組別對(duì)照H/R H/R+anti-miR-con H/R+anti-miR-106a F值P值細(xì)胞凋亡率/%7.12±0.72 19.03±1.90①19.23±1.95 11.35±1.15②46.20<0.001重復(fù)次數(shù)3333 miR-106a 1.00±0.12 3.52±0.35①3.60±0.36 1.42±0.14②78.49<0.001 cyclin D1 1.20±0.12 0.45±0.05①0.43±0.04 1.02±0.10②65.30<0.001 cleaved-caspase-3 0.30±0.03 0.88±0.09①0.92±0.10 0.45±0.05②53.52<0.001細(xì)胞存活率/%100.13±10.02 45.36±4.55①49.06±4.92 89.13±8.91②41.23<0.001

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)miR-106a低表達(dá)的心肌細(xì)胞H9C2 cyclin D1、cleaved-caspase-3表達(dá)

2.5 高表達(dá)miR-106a可以逆轉(zhuǎn)100μmol/L DPg對(duì)H9C2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響H/R+DPg 組miR-106a、cleaved-caspase-3 表達(dá)水平、凋亡率顯著低于H/R 組，cyclin D1 表達(dá)水平、存活率顯著高于H/R 組（P<0.05）；H/R+DPg+miR-106a 組miR-106a、cleavedcaspase-3 表達(dá)水平、凋亡率顯著高于H/R+DPg+miR-con 組，cyclin D1 表達(dá)水平、細(xì)胞存活率顯著低于H/R+DPg+miR-con組（P<0.05）。見圖3、表3。

表3 高表達(dá)miR-106a可以逆轉(zhuǎn)100μmol/L DPg對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖和凋亡的影響/± s

表3 高表達(dá)miR-106a可以逆轉(zhuǎn)100μmol/L DPg對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖和凋亡的影響/± s

注：DPg為飛燕草素葡萄糖苷，H/R為缺氧復(fù)氧，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，cleaved-caspase-3為活化胱天蛋白酶-3。①與H/R組比較，P<0.05。②與H/R+DPg+miR-con比較，P<0.05。

組別H/R H/R+DPg H/R+DPg+miR-con H/R+DPg+miR-106a F值P值細(xì)胞凋亡率/%18.06±1.81 10.02±1.05①10.38±1.03 16.39±1.65②24.90<0.001重復(fù)次數(shù)3333 miR-106a 1.00±0.12 0.38±0.04①0.36±0.03 0.86±0.09②52.78<0.001 cyclin D1 0.45±0.04 1.12±0.12①1.18±0.11 0.62±0.06②49.78<0.001 cleaved-caspase-3 0.90±0.09 0.40±0.04①0.45±0.05 0.80±0.08②40.19<0.001細(xì)胞存活率/%100.75±10.08 145.86±14.59①147.38±14.75 110.37±11.10②10.58<0.001

圖3 高表達(dá)miR-106a可以逆轉(zhuǎn)100μmol/L飛燕草素葡萄糖苷（DPg）對(duì)心肌細(xì)胞H9C2 cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)花色苷對(duì)阿霉素造成的心肌損傷具有保護(hù)作用［14］。如矢車菊素-3-葡萄糖苷可改善阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性［15］。DPg 是花色苷的一種，研究報(bào)道DPg能顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化低密度脂蛋白損傷［16］。DPg可保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化的低密度脂蛋白誘導(dǎo)的損傷［17］。本實(shí)驗(yàn)為研究DPg 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響，成功建立心肌細(xì)胞損傷模型，用不同濃度的DPg 處理H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞存活率增加，但細(xì)胞凋亡率減少。說明DPg 可以通過促增殖和抗凋亡作用，緩解H/R 導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。提示，DPg 可能是潛在的H/R心肌細(xì)胞損傷保護(hù)藥物。

本研究結(jié)果顯示，H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-106a 表達(dá)水平顯著升高。有研究表明，miR-106a 在大鼠腎缺血再灌注損傷后表達(dá)水平升高［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果類似。miR-106a 是miR-17家族的成員［18］，有研究報(bào)道m(xù)iR-106a 通過調(diào)節(jié)TH?BS2 加重了脂多糖誘導(dǎo)的TCMK-1 細(xì)胞的炎癥和細(xì)胞凋亡進(jìn)而加重了敗血癥誘導(dǎo)的急性腎損傷［19］。表明miR-106a 可能通過調(diào)控細(xì)胞炎癥和凋亡引起腎損傷。本實(shí)驗(yàn)為研究miR-106a 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響，轉(zhuǎn)染miR-106a 抑制表達(dá)載體，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞呈現(xiàn)較高的存活率、較低的細(xì)胞凋亡率。說明抑制miR-106a 可抑制H/R引起的心肌細(xì)胞凋亡；保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷。

為研究DPg 與miR-106a 的關(guān)系及其是否相互作用影響H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了DPg 處理的心肌細(xì)胞中miR-106a 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-106a 表達(dá)水平顯著降低，表明DPg 可降低miR-106a 表達(dá)。結(jié)果表明，高表達(dá)miR-106a 逆轉(zhuǎn)了DPg 對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。提示，DPg 可能通過下調(diào)miR-106a 的表達(dá)而對(duì)H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，在H/R 引起的心肌細(xì)胞損傷中，DPg可促增殖、抑凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用；其機(jī)制可能與下調(diào)miR-106a 有關(guān)。將可為保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷提供藥物防治的理論依據(jù)。