程 婉，康 靜

（沈陽城市學院，遼寧沈陽 110000）

植物遺傳轉(zhuǎn)化（plant genetic transformation）是應(yīng)用重組DNA 技術(shù)、細胞組織培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)，有目的地將外源基因或DNA 片段插入到受體植物基因組中，并使其在后代植株中得以表達的過程[1]。植物遺傳轉(zhuǎn)化可以定向改變植物遺傳信息，改善育種進程，提高植物抗性，獲得性狀良好的轉(zhuǎn)基因植物。建立高效的再生受體系統(tǒng)是基因遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，基因轉(zhuǎn)化需要有大量且質(zhì)量優(yōu)良的受體來接受外源基因的整合，通過鑒定有更多的受體實現(xiàn)基因的表達，從而篩選出轉(zhuǎn)基因再生植株。目前，由于芍藥間接途徑誘導不定芽困難，增殖較慢，直接途徑誘導不定芽數(shù)量少，不易再生，阻礙了芍藥在分子生物學上轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展，因此為芍藥建立高效、穩(wěn)定的受體系統(tǒng)迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

外植體：愈傷組織、芍藥試管苗的子葉；抗生素：潮霉素（Hygromycin）、慶大霉素（Gentamicin）、頭孢霉素、羧芐霉素。

1.2 選擇抗生素的確定

將芍藥試管苗的子葉接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L。將芍藥愈傷組織分成大小均勻小塊，接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。在以上2 種培養(yǎng)基中，分別添加不同濃度慶大霉素、潮霉素，觀察子葉不定芽生長情況和愈傷組織分化、褐化情況，確定遺傳轉(zhuǎn)化選擇壓和最佳轉(zhuǎn)化受體。

1.3 抑菌抗生素的確定

將芍藥試管苗的子葉接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L。將芍藥愈傷組織分割成大小均勻的小塊，接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。在以上2 種培養(yǎng)基中，分別添加不同濃度頭孢霉素（Cefotaxime）、羧芐霉素（Carbenicinin），觀察子葉不定芽生長情況和愈傷組織塊分化、褐化情況，確定遺傳轉(zhuǎn)化選擇壓和最佳的轉(zhuǎn)化受體。各種抗生素濃度見表1。

表1 抗生素濃度表

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

不定芽分化率（%）=分化的外植體/接種的外植體總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 子葉對抗生素種類和濃度的篩選

由表2 可知，在添加不同種類和濃度的選擇抗生素培養(yǎng)基中，子葉分化不定芽的效率不同。試驗發(fā)現(xiàn)，在添加潮霉素培養(yǎng)基中，不定芽生長較慢，隨著濃度的增大，子葉對潮霉素的敏感度不斷增大，分化率逐漸下降。結(jié)果表明，當潮霉素濃度為2 mg/L 時，分化率最大為75.57%，但與空白對照相比，下降了11.33 百分點。當潮霉素濃度為8mg/L 時，分化率較低，為2.67%；當潮霉素濃度為10mg/L，分化率為0，且子葉生長勢較弱，出現(xiàn)萎蔫甚至死亡。所以，當潮霉素濃度為8mg/L時，可作為芍藥遺傳轉(zhuǎn)化的選擇壓。當在培養(yǎng)基中加入慶大霉素時，不定芽在5mg/L 時分化只有7.76%，當濃度為10mg/L 時，分化率為0，說明子葉對慶大霉素的敏感度過高，因此慶大霉素不適宜作為選擇抗生素。

表2 Hyg 和Gen 對子葉不定芽分化的影響

由表3 可知，在添加不同種類和濃度的抑菌抗生素培養(yǎng)基中，子葉分化不定芽效率均受到一定程度的抑制。試驗發(fā)現(xiàn)，在添加頭孢霉素培養(yǎng)基中，不定芽生長雖受到抑制，但是抗敏感度較高，當濃度為50mg/L，分化率為71.1%，當濃度達到150mg/L，依然有16.67%子葉可以分化不定芽。而在加入羧芐霉素的培養(yǎng)基中，當濃度為50mg/L 時，分化率就已經(jīng)降低到38.9%，所以羧芐霉素不適宜作為抑菌抗生素，可選擇頭孢霉素50mg/L 作為芍藥遺傳轉(zhuǎn)化過程中的抑菌劑。

表3 抑菌抗生素對子葉不定芽分化的影響

2.2 愈傷組織對抗生素種類和濃度的篩選

由表4 可知，在添加不同種類和濃度的選擇抗生素培養(yǎng)基中，愈傷組織分化不定芽的效率不同。試驗發(fā)現(xiàn)，在添加潮霉素培養(yǎng)基中，不定芽生長較慢，隨著濃度的增大，子葉對潮霉素的敏感度不斷增大，分化率逐漸下降，褐化甚至死亡。結(jié)果表明，當潮霉素濃度為2mg/L 時，分化率最大為68.9%，但與空白對照相比，下降了15.53%。當潮霉素濃度為6mg/L 時，分化率較低，為6.67%；當潮霉素濃度為8mg/L，分化率為0，且愈傷組織生長勢較弱，褐化現(xiàn)象嚴重甚至死亡。所以，當潮霉素濃度為6mg/L 時，可作為芍藥愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的選擇壓。當在培養(yǎng)基中加入10mg/L 慶大霉素時，不定芽分化只有5.57%；當濃度為15mg/L 時，分化率為0，說明愈傷組織對慶大霉素的敏感度過高，所以慶大霉素不適宜作為選擇抗生素。

表4 選擇抗生素對愈傷組織不定芽分化的影響

由表5 可知，在添加不同種類和濃度的抑菌抗生素培養(yǎng)基中，愈傷組織分化不定芽效率均受到一定程度的抑制。試驗發(fā)現(xiàn)，在添加頭孢霉素培養(yǎng)基中，不定芽生長雖受到抑制，但是抗敏感度較高，當濃度為100mg/L，分化率為71.1%，當濃度達到200mg/L，依然有23.33%愈傷組織可以分化不定芽。而在加入羧芐霉素的培養(yǎng)基中，當濃度為100mg/L 時，分化率就已經(jīng)降低到6.67%，所以羧芐霉素不適宜作為抑菌抗生素，可選擇頭孢霉素100mg/L 作為芍藥遺傳轉(zhuǎn)化過程中的抑菌劑。

表5 抑菌抗生素對愈傷組織不定芽分化的影響

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明：子葉和愈傷組織對抗生素均較為敏感，都可作為良好的受體。當以子葉為受體時，潮霉素的抗性質(zhì)量濃度為8mg/L；頭孢霉素為50mg/L 時，農(nóng)桿菌生長可完全受到抑制。以愈傷組織為受體時，潮霉素的抗性質(zhì)量濃度為6mg/L，頭孢霉素為100mg/L時，農(nóng)桿菌生長可完全受到抑制。

3.1 抗生素篩選對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌介導法是最有效的植物基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法之一，因其價格低廉、操作簡便、可導入的目的基因片段大、拷貝數(shù)低、不易發(fā)生重排、符合孟德爾遺傳定律等優(yōu)點，所以植物可通過農(nóng)桿菌介導法獲得大量的轉(zhuǎn)基因植物[2]。在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化實驗中，潮霉素和慶大霉素常被用作抗性選擇壓的篩選。頭孢霉素和羧芐霉素常被用作抑制農(nóng)桿菌過度生長的抑菌劑。由于不同種類抗生素在轉(zhuǎn)化實驗中所起到的作用不同，不同濃度抗生素對農(nóng)桿菌的抑制效果不同，不同種類植物和外植體對抗生素的敏感反應(yīng)也存在差異。在培養(yǎng)基中添加抗生素后，抗生素對植物的分化和生長發(fā)育有一定的影響[3]，因此，通過篩選試驗確定出最佳的抗生素使用范圍和臨界值，對從事遺傳轉(zhuǎn)化研究有重大的意義[4-5]。潮霉素、慶大霉素、羧芐霉素、頭孢霉素作為常用的抗性篩選標記基因和抑菌劑被廣泛用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化工作。由于芍藥不同外植體的生長狀態(tài)和分化能力間存在差異，不同形態(tài)的外植體對不同抗生素的反應(yīng)不同，所以在轉(zhuǎn)化之前需對以上幾種抗生素的使用濃度進行探討。

3.2 抗生素不同種類和濃度對不定芽分化的影響

適合的抗生素濃度是在不影響細胞正常生長的前提下，有效抑制非轉(zhuǎn)化細胞的生長[6]。在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛?，通常導入的目的基因會對抗生素產(chǎn)生抗性，從而進一步篩選轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株，并將非轉(zhuǎn)化植株數(shù)量控制在最小范圍內(nèi)。本試驗表明，潮霉素和慶大霉素對子葉和愈傷組織的分化均具有抑制作用，潮霉素的抑制作用更加顯著，更適宜作為選擇劑使用。潮霉素對不同外植體的分化作用也不盡相同，在同一濃度潮霉素下，子葉的不定芽分化率更高。所以選子葉作為外植體遺傳轉(zhuǎn)化受體更佳。

當植物材料經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后，需及時用抗生素有效殺死并抑制農(nóng)桿菌生長，以防危害外植體的生長和分化，其中殺菌和抑菌效果最好的是頭孢霉素（Cef）和羧芐霉素（Carb）。然而抗生素對各種植物的組織分化影響不一[7-9]。因此，要測試植物對不同種類抗生素的敏感性，以確定抗生素篩選的臨界濃度，并選擇抑菌效果好、對植物組織再生影響較小的抗生素進行除菌，這是農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵之一。

本試驗通過對芍藥愈傷組織和子葉2 種外植體在不同種類及濃度的抗生素中不定芽再生效率的研究，篩選了不同外植體各自的最佳抗生素和脫菌抗生素的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，芍藥愈傷組織和子葉對抗生素敏感，都可作為遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體。以子葉和愈傷組織2 種不同的受體分別建立了較為完整的芍藥遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，為進一步進行芍藥分子生物學轉(zhuǎn)基因方面的研究奠定了基礎(chǔ)，同時為芍藥基因克隆、分子鑒定等研究提供理論依據(jù)。