竇晨，潘蕊，趙聲蘭*，程欣，3* （1. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，昆明 650500；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；3. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650500）

葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSP）是從葡萄籽中提取出來的一種黃酮類多酚化合物。據(jù)研究報(bào)道，原花青素具有抗氧化[1]、清除自由基[2]、抗癌[3]、抗菌[4]、抑制酪氨酸酶[5]等藥理學(xué)活性，可作為一種生態(tài)可持續(xù)和低成本的天然抗氧化劑來源，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。但其分子結(jié)構(gòu)中的酸性酚羥基和不飽和鍵使其缺乏長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性，容易降解、氧化、聚合等[6]。

將藥物包載于柔質(zhì)體中可增強(qiáng)藥物在皮膚中的滲透性[7]，改善水溶性和增加藥物穩(wěn)定性，并控制生物活性劑的釋放[8-9]。但作為緩釋載體，其物理性質(zhì)不穩(wěn)定，磷脂雙分子層滲透性的增加會(huì)導(dǎo)致生物活性分子的泄漏失活、儲(chǔ)存周期縮短以及易于聚集、融合或沉淀，并且由于脂質(zhì)體的流動(dòng)性使其不宜長時(shí)間停留在皮膚上，均限制了柔質(zhì)體的廣泛應(yīng)用。凝膠劑作為廣泛使用的藥物劑型，系指藥物與適宜基質(zhì)制成具有凝膠特性的半固體或稠厚液體制劑[10]。將脂質(zhì)體分散在凝膠基質(zhì)中制備成脂質(zhì)體凝膠劑，形成多貯庫型系統(tǒng)，能夠有效解決流動(dòng)性問題[11]，有效提高藥物皮膚滯留時(shí)間、穩(wěn)定性及緩釋性的優(yōu)點(diǎn)[12]。本文將包載原花青素的柔質(zhì)體嵌入水凝膠中，探究藥物的釋放規(guī)律，為GSP的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

原花青素對(duì)照品（批號(hào)：1024K021SX，純度≥95%，北京索萊寶科技有限公司），GSP（天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，批號(hào)：002200604028，純度≥95%），大豆卵磷脂（Solarbio公司，批號(hào)：1112J021），膽固醇（BIOSHARP生物公司，批號(hào)：624J033），脫氧膽酸鈉（BIOSHARP生物公司，批號(hào)：909P021，純度＞99%），卡波姆940（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C12058025），甘油（廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20200113），PEG-400（批號(hào)：C1925030）、三乙醇胺（批號(hào)：C2127395）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 儀器

超聲波處理器（德國elma公司，型號(hào)：P180H）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（倍捷科技，型號(hào)：OSB-2100）；納米激光粒度儀（美國布魯克海文公司，型號(hào)：90Plus型）；安捷倫高效液相色譜儀（安捷倫，型號(hào)：1260infin）；氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展公司，型號(hào)：HSC-12A）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）k2017-0005]。

2 方法與結(jié)果

2.1 GSP含量測定的方法學(xué)建立

2.1.1 色譜條件 色譜條件1：色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；溶劑為20%乙醇-生理鹽水時(shí)，流動(dòng)相為乙腈∶水＝18∶82，流速 1.0 mL·min－1，檢測波長 280 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫 30℃。

色譜條件2：溶劑為甲醇時(shí)，流動(dòng)相為甲醇∶水＝32∶68，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25℃，流速1 mL·min－1，檢測波長280 nm。

2.1.2 專屬性考察 取空白柔質(zhì)體（BFL）、葡萄籽原花青素柔質(zhì)體（GSP-FL）、空白脂質(zhì)體（BL）、葡萄籽原花青素脂質(zhì)體（GSP-L）的透皮接收液以及GSP對(duì)照品溶液按色譜條件1進(jìn)樣分析。取甲醇溶液、原花青素甲醇溶液、原花青素對(duì)照品甲醇溶液，按色譜條件2進(jìn)樣分析。由于GSP的出峰時(shí)間較早，伴有溶劑峰的干擾，因此在計(jì)算時(shí)需扣除溶劑峰峰面積。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取適量的原花青素對(duì)照品，加20%乙醇-生理鹽水和甲醇溶解，分別配成系列對(duì)照品溶液，按照色譜條件1和2進(jìn)樣分析，計(jì)算得到的線性回歸方程分別為y1＝2391.5x－4.943，R2＝0.9991，結(jié)果表明原花青素在0.0181～0.2896 mg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好；y2＝1486.8x－159.67，R2＝0.9997，結(jié)果表明原花青素在0.1252～0.4382 mg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn) 配制GSP對(duì)照品溶液，按色譜條件1連續(xù)進(jìn)樣8次，結(jié)果對(duì)照品溶液中原花青素峰面積的RSD值為1.1%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取GSP-FL體外經(jīng)皮滲透樣品6份進(jìn)行重復(fù)性考察，按色譜條件1進(jìn)樣分析，結(jié)果樣品中原花青素峰面積的RSD值為1.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取GSP-FL體外經(jīng)皮滲透液 1.0 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，放置0、2、4、6、8、12 h后，按色譜條件1進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示原花青素峰面積的RSD值為2.4%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取GSP-FL體外經(jīng)皮滲透接收液樣品0.5 mL（含原花青素0.1318 mg）9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各2份，按色譜條件1進(jìn)樣分析，結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的平均加樣回收率分別為100.82%、102.78%、104.62%，RSD值 分 別1.3%、0.37%、1.7%。精密稱定GSP樣品粉末9份加入甲醇溶解，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各3份，按色譜條件2進(jìn)樣分析，結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的平均加樣回收率分別為97.8%、100.3%、102.7%，RSD值 分別為1.2%、0.33%、0.23%。符合方法學(xué)要求。

2.2 GSP-FL與GSP-L的制備

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究得到的最佳制備工藝，采用薄膜分散-超聲法制備GSP-FL。精密稱定一定量的卵磷脂、膽固醇溶于15 mL氯仿中，將脫氧膽酸鈉溶于5 mL甲醇中超聲溶解后置于圓底燒瓶中混合均勻，在40℃水浴條件下，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，直至在燒瓶內(nèi)壁上形成干燥透明的均勻薄膜。精密稱取處方量的GSP溶于6 mL水中，將水相加到圓底燒瓶中，在40℃水浴條件下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)水合30 min后，所得混合液于超聲波處理器冰浴超聲混勻（150～180 W，5 min），0.22 μm微孔濾膜過濾后得到GSP-FL。同法制備得到不加膜軟化劑脫氧膽酸鈉的GSP-L，于冰箱4℃密封保存待用。采用超速離心法測定GSP-FL包封率為（70.79± 0.02）%，載藥量為（1.16±0.01）%，粒徑為（156.47±7.03）nm，PDI為0.26±0.01，Zeta電位為（－42.35±4.00）mV（n＝5）。

2.3 GSP-FL凝膠劑（GSP-FLG）的制備

精密稱取一定量的凝膠基質(zhì)，加入適量的純水過夜，使其充分溶脹，加入適量保濕劑、促滲劑，滴加三乙醇胺調(diào)整pH值后，再加入適量GSP-FL混懸液后，加入純水至50 g，攪拌均勻即得。同法制備不加藥物的空白凝膠。

2.3.1 凝膠基質(zhì)的篩選 分別精密稱定確定質(zhì)量的凝膠基質(zhì)卡波姆940、卡波姆934、羧甲基纖維素鈉、明膠、西黃著膠各0.5 g，加入適量純水溶脹過夜，用研缽研磨直至細(xì)膩，加入甘油2 g，用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至6.5，用純水補(bǔ)充至50 g。結(jié)果表明，卡波姆940能夠形成凝膠，黏度適宜、易于涂布，因此使用卡波姆940作為凝膠劑的基質(zhì)。

2.3.2 凝膠劑的評(píng)價(jià)指標(biāo) 根據(jù)《中國藥典》2020年版對(duì)凝膠劑的規(guī)定，一般應(yīng)檢查pH值，膠粒應(yīng)分散均勻，不應(yīng)下沉結(jié)塊，凝膠劑應(yīng)均勻、細(xì)膩、在常溫時(shí)保持膠狀、不干涸或液化等。因此，本文主要考察凝膠劑的失水率、成型性、pH值、均勻度、光澤度、穩(wěn)定性等因素。

① pH值。將制備好的凝膠劑置于100 mL燒杯中，按照1∶50（W/W）加入超純水，超聲30 min，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓覝貤l件下用pH計(jì)測定其pH值。

② 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。離心實(shí)驗(yàn)：精密稱取1 g凝膠劑于離心管中，3500 r·min－1離心30 min，觀察樣品是否分層；低溫實(shí)驗(yàn)：精密稱取1 g凝膠劑于離心管中，密封保存于－20℃冰箱中，觀察樣品是否分層；熱恒溫實(shí)驗(yàn)：精密稱取1 g凝膠劑于離心管中，60℃放置6 h，觀察是否分層。

③ 涂展性實(shí)驗(yàn)。在一塊干凈的玻璃板上畫一個(gè)直徑為1 cm的圓，取1 g凝膠劑涂在圓內(nèi)，并覆蓋一塊干凈的玻璃板，取1 kg重物壓在玻璃板上，5 min后量取凝膠劑延展后的直徑。

④ 失水率實(shí)驗(yàn)。精密稱定5 g凝膠劑放入干燥至恒重的玻璃器皿內(nèi)，將其質(zhì)量記為Wa，置于55℃的烘箱中干燥，每隔1 h后取出，放冷之后，稱定總質(zhì)量記為Wb，繼續(xù)干燥至質(zhì)量不再損失時(shí)為終點(diǎn)，計(jì)算每個(gè)時(shí)刻的失水率（S）。

S＝（Wa－Wb）/5×100%

2.3.3 卡波姆940用量的考察 精密稱定0.05、0.25、0.50、0.75、1.00 g [即分別為0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%（W/W）]的卡波姆940均勻?yàn)⒂诩兯砻?，充分溶脹，用研缽研磨直至?xì)膩，加入甘油2 g，丙二醇2 g，用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至6.5，用純水補(bǔ)充至50 g。主要以外觀，成型性，黏稠性，涂展性來考察卡波姆940的用量。結(jié)果顯示，當(dāng)卡波姆940用量超過1%時(shí)，凝膠劑隨著卡波姆940用量的增加，黏度逐漸增大。因此卡波姆940的用量應(yīng)控制在1%以內(nèi)。

2.3.4 保濕劑的選擇 精密稱定卡波姆940約0.5 g，均勻?yàn)⒂诩兯砻?，充分溶脹，不加保濕劑或以甘? g、PEG-400 2 g、甘油∶PEG-400（1∶1）為保濕劑，再加入丙二醇2 g，用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至6.5，用純水補(bǔ)充至50 g。以失水率為指標(biāo)，考察最適保濕劑的種類。結(jié)果顯示，在1～6 h內(nèi)甘油具有較小的平均失水率，因此選擇甘油為保濕劑。

2.3.5 保濕劑用量的選擇 精密稱定卡波姆940 0.5 g，均勻?yàn)⒂诩兯砻?，使其充分溶脹，分別加入1、2、3、4、5 g甘油，再加入丙二醇2 g，充分?jǐn)噭?，用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至6.5，用純水補(bǔ)充至50 g。以失水率為指標(biāo)，考察保濕劑的最適用量，結(jié)果顯示，當(dāng)甘油用量為3 g時(shí)，凝膠劑具有較小的失水率。

2.3.6 三乙醇胺用量的考察 精密稱定卡波姆940 0.5 g，均勻?yàn)⒂诩兯砻?，充分溶脹，加? g甘油，2 g丙二醇，分別加入0.1、0.5、1、2、3 g三乙醇胺，充分?jǐn)噭?，用純水補(bǔ)充至50 g。以外觀、涂展性、黏度、pH值為指標(biāo)，考察三乙醇胺的用量。結(jié)果顯示，當(dāng)凝膠劑的pH＞8時(shí)，狀態(tài)較稀，不易涂布。因此，三乙醇胺的用量采用0.1、0.5、1 g這三個(gè)水平作為影響因素。

2.3.7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化選擇 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇卡波姆、甘油和三乙醇胺用量作為影響凝膠劑的主要因素進(jìn)行考察，綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行基質(zhì)篩選，優(yōu)化處方（見表2）。

表1 綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(20分)Tab 1 Comprehensive scoring criteria (20 points)

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab 2 Orthogonal experimental factor and level

2.3.8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響分別為A＞C＞B，因素A和C對(duì)綜合評(píng)分具有顯著影響（P＜0.05），因此考慮GSP-FLG凝膠基質(zhì)的最佳制備工藝條件為A1B3C2，即每50 g凝膠中含有卡波姆940 0.5%，甘油10%及三乙醇胺1%（見表3、表4）。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Variance analysis

2.3.9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按優(yōu)選的處方工藝制備4批GSP-FLG，對(duì)其進(jìn)行考察，其6 h的平均失水率分別為23.26%、24.33%、22.22%、30.36%，凝膠質(zhì)地光滑有光澤、涂展性、穩(wěn)定性良好，綜合評(píng)分分別為16.5、16.9、17.0、16.2，平均值為16.65，RSD為2.2%，結(jié)果表明制備工藝合理，穩(wěn)定可行且結(jié)果可靠。

2.4 GSP-FL、GSP-FLG的體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)

2.4.1 離體小鼠皮膚的制備 將昆明種小鼠脫頸椎處死后，固定于木板上，小心剔除腹部毛發(fā)，立即剪下其腹部皮膚，剝離皮下組織及脂肪，將其浸泡于生理鹽水，選用表皮完整無破損皮膚于－80℃冷凍保存，備用。

2.4.2 經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn) 采用Franz透皮擴(kuò)散池法，分別以游離GSP為對(duì)照進(jìn)行GSP-FL及GSP-L的體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)，以葡萄籽原花青素凝膠（GSP-G）為對(duì)照進(jìn)行GSP-FLG的體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)。將預(yù)處理好的鼠皮固定于透皮杯上，使角質(zhì)層面向樣品供給池，真皮層面向接收池，用夾子夾緊。向樣品池中加入等量的GSP、GSP-FL及GSP-L樣品溶液（含GSP 9.30 mg）或1 g凝膠劑（含GSP 13.12 mg）并均勻鋪展開，再向接收池加入20%乙醇-生理鹽水作為接收介質(zhì)，于水浴溫度（32±0.5）℃，轉(zhuǎn)速300 r·min－1的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別于第0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h取樣，同時(shí)補(bǔ)加等量同溫度的接收介質(zhì)。接收液用0.22 μm的微孔濾膜濾過后，按色譜條件1進(jìn)樣分析，計(jì)算GSP在不同時(shí)間點(diǎn)的單位面積累積透過量Qt（mg·cm－2），以時(shí)間t（h）為橫坐標(biāo)，以Qt為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖1所示。對(duì)曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，直線的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率[Js，mg/（cm2·h）]。

圖1 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G、GSP-FLG單位面積累積透過量曲線（ ±s，n＝4）Fig 1 Cumulative transmittance curve of GSP-FL，GSP-L，GSP，GSP-G，and GSP-FLG drugs per unit area（ ±s，n＝4）

S為有效擴(kuò)散面積，V為接收液總體積，Cn為第n次取樣時(shí)接收液中藥物的質(zhì)量濃度，Ci為第i次取樣時(shí)接收液中藥物的質(zhì)量濃度，Vi為取樣體積。

結(jié)果如表5所示，GSP組表現(xiàn)出明顯的突釋現(xiàn)象，GSP-FL組（含GSP 9.30 mg）24 h的單位面積累積透過量顯著高于GSP-L組（P＜0.05），穩(wěn)態(tài)透皮速率也高于GSP-L組，猜測柔質(zhì)體的可形變性使其比脂質(zhì)體更易透過皮膚。GSP-FLG組（含GSP 13.12 mg）72 h的單位面積累積透過量顯著低于GSP-G組（P＜0.01)，穩(wěn)態(tài)透皮速率也低于GSP-G組，因此GSP-FLG表現(xiàn)為明顯的緩釋效果。通過藥物釋放動(dòng)力學(xué)方程對(duì)體外經(jīng)皮滲透結(jié)果進(jìn)行擬合，結(jié)果顯示 GSP-FL、GSP-L、GSP-G及GSP-FLG組均以Weibull 方程進(jìn)行擬合時(shí)具有較好的擬合度；而GSP 組以一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合度較高。擬合結(jié)果如表6所示。

表5 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG累積釋放動(dòng)力學(xué)參數(shù)( ±s，n＝4)Tab 5 Cumulative release kinetics parameters of GSP-FL，GSP-L，GSP，GSP-G and GSP-FLG ( ±s，n＝4)

表5 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG累積釋放動(dòng)力學(xué)參數(shù)( ±s，n＝4)Tab 5 Cumulative release kinetics parameters of GSP-FL，GSP-L，GSP，GSP-G and GSP-FLG ( ±s，n＝4)

注（Note）：與GSP-L組相比，*P＜0.01；與 GSP-G組相比，##P＜0.01（Compared with the GSP-L group，*P＜0.01； compared with the GSP-G group，##P＜0.01）。

組別 Qt R2 Js/[mg/（cm2·h）] Q24/（mg·cm－2） Q72/（mg·cm－2）GSP Q＝0.0721t＋0.1359 0.9236 0.0721 0.739±0.0695 0.7533±0.082 GSP-L Q＝0.0255t＋0.1484 0.9018 0.0255 0.3778±0.0412 0.4286±0.057 GSP-FL Q＝0.0289t＋0.2012 0.9046 0.0289 0.4475±0.0368* 0.5005±0.050 GSP-G Q＝0.0485t＋0.9976 0.9976 0.0485 0.9317±0.133 1.3996±0.097 GSP-FLG Q＝0.032t＋0.0738 0.9719 0.032 0.4757±0.101 0.6926±0.145##

表6 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG藥物單位面積累積透過量曲線方程擬合( ±s，n＝4)Tab 6 Equation fitting of cumulative transmittance curve per unit area of GSP-FL，GSP-L，GSP，GSP-G and GSP-FLG ( ± s，n＝4)

表6 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG藥物單位面積累積透過量曲線方程擬合( ±s，n＝4)Tab 6 Equation fitting of cumulative transmittance curve per unit area of GSP-FL，GSP-L，GSP，GSP-G and GSP-FLG ( ± s，n＝4)

擬合方式 組別 方程 R2零級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程GSP Q＝0.0061t＋0.4404 0.2862 GSP-L Q＝0.0031t＋0.2512 0.5010 GSP-FL Q＝0.0032t＋0.3176 0.4572 GSP-G Q＝0.0185t＋0.2593 0.8977 GSP-FLGQ＝0.008t＋0.2103 0.8386一級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程GSP Q＝0.7371（1－e－0.2844t） 0.9973 GSP-L Q＝0.3686（1－e－0.4641t） 0.8451 GSP-FL Q＝0.4342（1－e－0.6198t） 0.8282 GSP-G Q＝1.4657（1－e－0.0434t） 0.991 GSP-FLGQ＝0.6625（1－e－0.0762t） 0.9513 Higuchi方程GSP Q＝0.0727t1/2＋0.2983 0.5366 GSP-L Q＝0.0339t1/2＋0.1891 0.7374 GSP-FL Q＝0.0355t1/2＋0.2517 0.6965 GSP-G Q＝0.1857t1/2－0.0752 0.9802 GSP-FLGQ＝0.0817t1/2＋0.0597 0.9646 Weibull方程GSP Q＝0.7410（1－e－[0.283（t－0.019）]0.9487）0.9972 GSP-L Q＝0.4285（1－e－[0.2863（t－0.1806）]0.4422）0.9941 GSP-FL Q＝0.4947（1－e－[0.4044（t－0.1358）]0.4345）0.9921 GSP-G Q＝1.4522（1－e－[0.0386（t－2.5093）]1.169）0.9956 GSP-FLGQ＝0.9078（1－e－[0.0284（t－0.3397）]0.5705）0.9933 Ritgerpeppas方程GSP Q＝0.3385（t0.2235） 0.7195 GSP-L Q＝0.2031（t0.1899） 0.9019 GSP-FL Q＝0.2629（t0.1655） 0.8855 GSP-G Q＝0.1462（t0.5443） 0.9763 GSP-FLGQ＝0.1302（t0.4043） 0.9797

2.4.3 藥物的皮膚滯留量測定 體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出小鼠皮膚，用生理鹽水反復(fù)沖洗小鼠皮膚表面，直到將皮膚表面的藥物清洗干凈為止，再剪下給藥部位置于10 mL離心管中，用眼科剪將其剪碎，加入甲醇4 mL，置于勻漿機(jī)中使其破碎，水浴超聲30 min，140 00 r·min－1離心30 min后，棄去鼠皮，將上清液用氮?dú)獯蹈?，以甲醇?fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜后，按色譜條件2進(jìn)樣分析測定GSP的藥物含量，測定藥物的皮膚滯留量（Q）＝藥物量/有效擴(kuò)散面積（2.92 cm2）。結(jié)果顯示，GSP-FL 組72 h皮膚內(nèi)藥物滯留量顯著高于GSP 組（P＜0.01）。GSP-FLG組在72 h皮膚內(nèi)藥物滯留量顯著高于GSP-G組（P＜0.05），見表7。

表7 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG的藥物皮膚滯留量( ±s，n＝3)Tab 7 Drug skin retention of GSP-FL，GSP-L，GSP，GSP-G and GSP-FLG ( ±s，n＝3)

表7 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG的藥物皮膚滯留量( ±s，n＝3)Tab 7 Drug skin retention of GSP-FL，GSP-L，GSP，GSP-G and GSP-FLG ( ±s，n＝3)

注（Note）：與GSP組相比，**P＜0.01；與GSP-G組相比，##P＜0.01（Compared with the GSP group，**P＜0.01；compared with the GSP-G group，##P＜0.01）。

劑型 Q/（μg·cm－2）GSP-L 42.79±0.981 GSP-FL 46.22±0.439**GSP 39.89±0.173 GSP-G 41.12±1.69 GSP-FLG 48.02±0.45#

2.5 體外釋放度考察

精密量取2 mL游離GSP溶液、GSP-FL、GSP-L混懸液以及1 g GSP-G和GSP-FLG 至透析袋（100 kDa）中，以8 mL 20%乙醇-生理鹽水為釋放介質(zhì)，于Franz體外透皮擴(kuò)散池上以300 r·min－1的轉(zhuǎn)速恒溫（32±0.5）℃釋放，分別于0.5、2、4、6、8、12、24、48、72 h后取樣，同時(shí)補(bǔ)加等量同等溫度的釋放介質(zhì)，接收液用0.22 μm的微孔濾膜濾過后，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件1進(jìn)樣分析，計(jì)算藥物的累積釋放量，累積釋放率＝累積釋放量/投藥量。結(jié)果如表8所示，GSP組在12 h后累積釋放率逐漸增加，48 h時(shí)后顯著高于GSP-FL組（P＜0.01），至72 h仍呈釋放趨勢，表現(xiàn)出明顯的突釋現(xiàn)象。與GSP-L組相比，12 h后GSP-FL組的累計(jì)釋放率逐漸增加，48 h后顯著高于GSP-L組（P＜0.01），GSP-L與GSP-FL表現(xiàn)出長時(shí)間的緩釋效果。GSP-G組的累計(jì)釋放率在12 h后顯著高于GSP-FLG組（P＜0.01），至72 h仍呈釋放趨勢，表現(xiàn)出明顯的突釋現(xiàn)象，而GSP-FLG組則在12 h后緩慢釋放。將藥物制備成GSP-FLG后，在12 h內(nèi)的藥物累積釋放率顯著小于GSP-FL組（P＜0.05），表明凝膠劑型使藥物緩釋效果更加明顯。通過藥物釋放動(dòng)力學(xué)方程對(duì)體外藥物累積釋放結(jié)果進(jìn)行擬合，結(jié)果顯示 GSP-FL、GSP-L組以 Weibull 方程，GSP-G以Higuchi方程進(jìn)行擬合時(shí)具有較好的擬合度，而 GSP 、GSP-FLG組以Ritger-peppas擬合度較高。擬合結(jié)果如表9 所示。。

表8 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG藥物體外累積釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ( ±s，n＝4，%)Tab 8 In vitro cumulative release data of GSP-FL, GSP-L, GSP, GSP-G and GSP-FLG ( ±s，n＝4，%)

表8 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG藥物體外累積釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ( ±s，n＝4，%)Tab 8 In vitro cumulative release data of GSP-FL, GSP-L, GSP, GSP-G and GSP-FLG ( ±s，n＝4，%)

注（Note）：與GSP-FL相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與GSP-L相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與GSP-FLG組相比，ΔP＜0.01（Compared with the GSP-FL group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with the GSP-L group，#P＜0.05，##P＜0.01；compared with the GSP-FLG group，ΔP＜0.01）。

時(shí)間（h） GSP GSP-L GSP-FL GSP-G GSP-FLG 0.5 7.77±0.011 10.71±0.013 8.60±0.0072 4.76±0.005 5.39±0.007*1 10.59±0.014 13.70±0.013 11.47±0.008 7.00±0.010 8.15±0.0156*2 14.58±0.015 16.98±0.018 15.72±0.013 10.38±0.015 11.00±0.021*4 20.66±0.022 21.36±0.026 20.91±0.004 16.67±0.020 15.83±0.027*6 25.02±0.033 23.76±0.031 24.43±0.013 20.98±0.0189 18.79±0.032*8 28.47±0.031 25.35±0.032 27.35±0.011 24.49±0.025 20.49±0.038*10 30.96±0.033 26.87±0.03 30.04±0.014 26.59±0.021 22.12±0.038*12 32.41±0.032 27.70±0.037 31.17±0.017 29.07±0.019Δ 23.55±0.040*24 38.77±0.024 30.57±0.036 35.99±0.017# 40.04±0.012Δ 31.01±0.050 48 60.38±0.021* 40.08±0.010 46.75±0.0235## 62.44±0.014Δ 46.77±0.078 72 63.58±0.042* 40.20±0.008 47.55±0.0232## 73.97±0.018Δ 50.35±0.107

表9 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG藥物累積釋放率曲線方程擬合( ±s，n＝4)Tab 9 Equation fitting of cumulative release rate curve of GSP-FL，GSP-L，GSP，GSP-G and GSP-FLG ( ±s，n＝4)

表9 GSP-FL、GSP-L、GSP、GSP-G和GSP-FLG藥物累積釋放率曲線方程擬合( ±s，n＝4)Tab 9 Equation fitting of cumulative release rate curve of GSP-FL，GSP-L，GSP，GSP-G and GSP-FLG ( ±s，n＝4)

擬合方式 組別 方程 R2零級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程GSP Q＝0.0075t＋0.0.1749 0.8658 GSP-L Q＝0.0037t＋0.1899 0.7396 GSP-FL Q＝0.005t＋0.1884 0.741 GSP-G Q＝0.0094t＋0.1272 0.9347 GSP-FLGQ＝0.0061t＋0.1271 0.8919一級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程GSP Q＝0.5886（1－e－0.0.0742t） 0.8992 GSP-L Q＝0.3437（1－e－0.2283t） 0.7013 GSP-FL Q＝0.4351（1－e－0.1349t） 0.8751 GSP-G Q＝0.7354（1－e－0.0434t） 0.9619 GSP-FLGQ＝0.4801（1－e－0.0648t） 0.9135 Higuchi方程GSP Q＝0.0735t1/2＋0.0533 0.9765 GSP-L Q＝0.0372t1/2＋0.1257 0.9160 GSP-FL Q＝0.0506t1/2＋0.1011 0.9225 GSP-G Q＝0.08991/2－0.0175 0.9975 GSP-FLGQ＝0.0589t1/2＋0.0306 0.9874 Weibull 方程GSP Q＝2.0585（1－e－[0.0016（t－0.0233）]0.4415）0.9827 GSP-L Q＝0.7311（1－e－[0.0074（t－0.2019）]0.3030）0.9836 GSP-FL Q＝0.5714（1－e－[0.0505（t－0.0492）]0.4848）0.9920 GSP-G Q＝9.9378（1－e－[0.0001（t－0.1501）]0.5313）0.9969 GSP-FLGQ＝3.5（1－e－[0.0002（t－0.0978）]0.442） 0.9893 Ritger-peppas方程GSP Q＝0.1174（t0.4037） 0.9851 GSP-L Q＝0.1470（t0.2461） 0.9789 GSP-FL Q＝0.1377（t0.3048） 0.9747 GSP-G Q＝0.0783（t0.5282） 0.9973 GSP-FLGQ＝0.0835（t0.4278） 0.9913

3 討論

體外透皮實(shí)驗(yàn)時(shí)接收液應(yīng)該滿足漏槽條件，常用的透皮接收液有生理鹽水、等滲磷酸鹽緩沖液等，對(duì)一些脂溶性強(qiáng)的物質(zhì)，常在接收液中加入醇類和非離子表面活性劑等。GSP作為聚合物，低聚部分分子量小，水溶性好，隨著聚合度增加，溶解度逐漸降低[13-14]。前期嘗試過在生理鹽水、PBS中加入吐溫20、無水乙醇來進(jìn)行溶解度考察，發(fā)現(xiàn)GSP在無水乙醇-生理鹽水中具有較好的溶解度且滿足漏槽條件，但超過20%的乙醇對(duì)皮膚有較強(qiáng)脂質(zhì)提取和屏障破壞作用，并且容易揮發(fā)[15]，所以在實(shí)驗(yàn)中選擇20%乙醇-生理鹽水作為接收介質(zhì)。透皮吸收首選的皮膚屏障是人體皮膚，但由于獲得人體皮膚組織較為困難，常用動(dòng)物皮膚來代替。在使用大鼠皮膚出現(xiàn)了藥物的累積透過量低的問題，為減少皮膚差異性的問題，統(tǒng)一采用同一批昆明種小鼠的腹部皮膚作為滲透膜進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)。

透析袋實(shí)驗(yàn)中，通過釋藥曲線與擬合方程分析GSP-FL及GSP-FLG的釋藥機(jī)制，由釋藥曲線推測，GSP-FL組釋藥分為快釋和緩釋，在10 h后藥物開始緩慢釋放，推測藥物快釋過程是由于柔質(zhì)體中未被包載藥物的快速釋放。而GSP-FLG組也表現(xiàn)出同樣的釋藥規(guī)律，12 h后包裹于脂質(zhì)體中的藥物通過凝膠緩慢釋放藥物，推測藥物快釋是由于凝膠劑中附在脂質(zhì)體表面的或包埋較淺的原花青素或未被包載的游離藥物的釋放，12 h后包裹在脂質(zhì)體中的藥物通過凝膠緩慢釋放。脂質(zhì)體被致密的凝膠基質(zhì)固定，使得其聚集、相容更加困難，增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，也進(jìn)一步增強(qiáng)了藥物的緩釋效果，徐蕾[16]在進(jìn)行高烏甲素脂質(zhì)體凝膠透皮釋藥考察的實(shí)驗(yàn)中也得出了同樣的釋藥規(guī)律。通過透析袋釋藥初步考察脂質(zhì)體凝膠的釋放過程，發(fā)現(xiàn)GSP-FLG的釋放過程符合Ritgerpeppas釋放特性。陳積[17]進(jìn)行體外透皮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方莪術(shù)油脂質(zhì)體凝膠中吉馬酮和維A酸24 h的累積透皮量均顯著低于復(fù)方莪術(shù)油凝膠，可長時(shí)間穩(wěn)態(tài)釋藥，具有緩釋作用，相較于藥物凝膠，脂質(zhì)體凝膠的緩釋作用更加顯著。

本實(shí)驗(yàn)比較了GSP、GSP-L、GSP-FL的體外透皮性能，游離的GSP表現(xiàn)出突釋效果，將其制備為柔質(zhì)體后，可顯著降低其釋放速率，達(dá)到緩釋效果。相比GSP-L，由于GSP-FL的柔韌性和形變性，表現(xiàn)出更高的累計(jì)釋放率和透皮速率。GSP-FL的皮膚滯留量顯著高于GSP，說明將其制備為柔質(zhì)體能使藥物更多地滯留在皮膚內(nèi)。而將柔質(zhì)體進(jìn)一步制備成凝膠后可減少其流動(dòng)性，使藥物長時(shí)間與皮膚接觸，皮膚滯留量更高，有利于藥物在皮膚局部發(fā)揮作用；并且水凝膠無油膩感，易涂展，局部給藥后易吸收，具有制備工藝簡單、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[18]。張小靈[19]制備的雙丹脂質(zhì)體凝膠劑具有較強(qiáng)緩釋作用，可延長給藥時(shí)間，皮膚內(nèi)藥物貯量較大，藥物大多蓄積在真皮層中，有利于瘢痕的治療。時(shí)軍等[20]制備的丹皮酚陽離子脂質(zhì)體凝膠的累積透過量、藥物透皮速率與皮膚蓄積量亦顯著大于普通凝膠。有研究報(bào)道，GSP具有抑制酪氨酸酶的活性[21]，而酪氨酸酶是黑色素生成的關(guān)鍵限速酶[22-23]，因此有望將GSP-FLG開發(fā)為具有美白功效的化妝品制劑，但其效果還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究以柔質(zhì)體為載體，并將其進(jìn)一步制備成凝膠劑，實(shí)現(xiàn)了皮膚局部給藥并具有緩釋的效果，充分發(fā)揮了柔質(zhì)體和凝膠劑的優(yōu)勢，具有廣闊的應(yīng)用前景。