王軍，邱榮英，郭玉，李鐵健，張貴蘭，張貴民*（1. 山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 27300；2. 國(guó)家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 27300；3. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276005；. 山東省臨沂市蘭山區(qū)柳青街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，山東 臨沂 276005）

枸櫞酸莫沙必利，化學(xué)名為4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[4-（4-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺枸櫞酸鹽二水合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。該藥是大日本制藥有限公司開(kāi)發(fā)的消化道促動(dòng)力藥，于1998年6月首次在日本上市。該藥為第一個(gè)5-HT4受體激動(dòng)劑，通過(guò)興奮胃腸道膽堿能中間神經(jīng)元及肌間神經(jīng)叢的5-羥色胺受體，促進(jìn)乙酰膽堿的釋放，從而增強(qiáng)胃腸道運(yùn)動(dòng)，改善功能性消化不良患者的胃腸道癥狀，且不影響胃酸的分泌。另外其還可與其他藥物聯(lián)用，治療反流性食管炎及由此引起的咳嗽。由于枸櫞酸莫沙必利良好的療效，其在臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

圖1 枸櫞酸莫沙必利結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of mosapride citrate

目前對(duì)枸櫞酸莫沙必利的研究主要集中在合成、臨床療效、制劑與代謝方面，對(duì)其手性分離也有報(bào)道。但關(guān)于其雜質(zhì)研究方面的報(bào)道較少。近幾年LC-MS聯(lián)用技術(shù)在雜質(zhì)譜分析中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，可對(duì)藥物中存在的未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)推導(dǎo)。本文采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF-MS）定性分析了枸櫞酸莫沙必利中的6個(gè)雜質(zhì)，可為其工藝優(yōu)化與質(zhì)量研究提供參考。

1 儀器與試藥

1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀、G6540B四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司），配有電噴霧離子源（ESI）以及MassHunter B.06.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

枸櫞酸莫沙必利（純度：99.0%，企業(yè)A）；雜質(zhì)2對(duì)照品（2-乙氧基-4-氨基-5-氯苯甲酸，批號(hào)：520190901F，純度：99.9%）、雜質(zhì)3對(duì)照品（4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[（4-芐基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺，批號(hào)：MSBL-G-180301Z，純度：99.5%）、雜質(zhì)4對(duì)照品（4-氨基-5-溴-2-乙氧基-

N

-{[4-（4-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺，批號(hào)：MSBL-E-180201Z，純度：99.9%）、雜質(zhì)5對(duì)照品（4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[4-（3-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺，批號(hào)：MSBLF-180301Z，純度：99.2%）（山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司）；乙酸銨（色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司）；水為自制超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱YMC-Triart C柱（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：A為10 mmol·L乙酸銨水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序（0～5 min，15%B；5～10 min，15%～30%B；10～20 min，30%～90%B；20～21 min，90%～15%B；21～25 min，15%B）；柱溫40℃；波長(zhǎng)274 nm，流速0.3 mL·min；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）源；正離子模式檢測(cè)；掃描范圍

m/z

50～800；毛細(xì)管電壓4 kV；裂解電壓55 V；錐孔電壓40 V；霧化氣溫度：350℃；干燥氣流速8 L·min。

2.3 供試品溶液的配制

稱取枸櫞酸莫沙必利樣品適量，用流動(dòng)相定量稀釋至約1 mg·mL，取適量過(guò)0.2 μm濾膜，作為供試品溶液。

2.4 雜質(zhì)對(duì)照品溶液的配制

分別稱取雜質(zhì)2、3、4、5對(duì)照品適量，用流動(dòng)相稀釋至約10 μg·mL，作為雜質(zhì)對(duì)照品溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 UPLC-Q-TOF-MS方法的優(yōu)化

日本藥典中檢測(cè)枸櫞酸莫沙必利原料藥的方法使用檸檬酸鹽水溶液與乙腈進(jìn)行梯度洗脫分析，由于檸檬酸鹽難以揮發(fā)，故無(wú)法進(jìn)入質(zhì)譜分析，故需選擇揮發(fā)性流動(dòng)相。筆者分別比較0.1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、10 mmol·L乙酸銨水溶液與乙腈進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)10 mol·L乙酸銨水溶液與乙腈梯度洗脫時(shí)各雜質(zhì)分離度較好；參考文獻(xiàn)報(bào)道，本研究最終采用了ESI源，在正離子模式下進(jìn)行樣品分析，且各雜質(zhì)具有較好的質(zhì)譜響應(yīng)值，有利于雜質(zhì)的定性分析。

3.2 供試品溶液總離子流圖

供試品溶液進(jìn)入U(xiǎn)PLC-Q-TOF-MS后，總離子流圖見(jiàn)圖2，按照出峰時(shí)間依次對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行編號(hào)（1～6），主峰為莫沙必利。

圖2 枸櫞酸莫沙必利供試品溶液的總離子流圖Fig 2 Total ion chromatogram of mosapride citrate

3.3 莫沙必利質(zhì)譜信息

樣品主成分莫沙必利的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3，母離子峰

m/z

422.1652為[M＋H]峰，其二級(jí)質(zhì)譜碎片為

m/z

198.0319，且

m/z

198.0319與

m/z

200.0291豐度比約為3∶1，表明其含一個(gè)Cl原子。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，其裂解途徑如圖3所示，莫沙必利中連接A、B兩部分的酰胺鍵斷裂后，A部分形成了

m/z

198.0319碎片離子，該碎片可為雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析提供重要依據(jù)。

圖3 莫沙必利的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig 3 MS2 spectra of mosapride and fragmentation pathway

3.4 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析

3.4.1 雜質(zhì)質(zhì)譜信息 6個(gè)雜質(zhì)經(jīng)過(guò)UPLC-QTOF-MS分析后，獲得各雜質(zhì)的精確分子量與二級(jí)質(zhì)譜碎片，具體質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。結(jié)合雜質(zhì)的精確分子量，利用MassHunter軟件計(jì)算獲得分子式，再結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜碎片信息對(duì)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

表1 枸櫞酸莫沙必利中雜質(zhì)的質(zhì)譜信息
Tab 1 MS information of impurities in mosapride citrate

No. 保留時(shí)間/min 母離子/（m/z） 分子式 誤差/（×10－6） 碰撞能量/eV 碎片離子/（m/z）1 10.21 440.1752[M＋H]＋ C21H27ClFN3O4 1.14 15 198.0317；271.0844 2 12.02 216.0424[M＋H]＋ C9H10ClNO3 0.93 8 169.9999；198.0314 3 12.73 404.1746[M＋H]＋ C21H26ClN3O3 2.48 20 198.0316 4 14.17 466.1142[M＋H]＋ C21H25BrFN3O3 1.29 20 241.9813 5 14.66 422.1646[M＋H]＋ C21H25ClFN3O3 1.18 20 198.0316 6 15.25 367.1232[M＋H]＋ C18H20ClFN2O3 3.55 15 198.0321

圖4 枸櫞酸莫沙必利中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig 4 Structure of impurities in mosapride citrate

3.4.2 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析 結(jié)合莫沙必利的裂解規(guī)律與雜質(zhì)二級(jí)碎片離子對(duì)各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析如下。

雜質(zhì)1：二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5，母離子

m/z

440.1752 [M＋H]，經(jīng)軟件計(jì)算分子式為CHClFNO，比莫沙必利分子式多一分子HO。由于

m/z

198.0317碎片仍存在，參考莫沙必利裂解機(jī)制，該雜質(zhì)含有A部分結(jié)構(gòu)，因此判斷B部分結(jié)構(gòu)多了一分子HO。經(jīng)軟件計(jì)算碎片

m/z

271.0844離子組成為CHClNO，為母離子失去基團(tuán)CHFNO生成；而

m/z

271.0844繼續(xù)失去基團(tuán)CHNO則生成碎片

m/z

198.0317。由此推斷雜質(zhì)1的結(jié)構(gòu)與可能的二級(jí)斷裂機(jī)制如圖5所示。

圖5 雜質(zhì)1的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 5 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 1

雜質(zhì)2：二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6，母離子

m/z

216.0424 [M＋H]，經(jīng)軟件計(jì)算分子式為CHClNO，其中二級(jí)碎片含有

m/z

198.0314，說(shuō)明含有A部分結(jié)構(gòu)。由于母離子

m/z

216.0424比

m/z

198.0314多18 Da，可判斷雜質(zhì)2脫水生成碎片

m/z

198.0314，由此判斷雜質(zhì)2含有OH基團(tuán)；碎片離子

m/z

169.9999為

m/z

198.0314脫去乙基形成的。由此推斷雜質(zhì)2的結(jié)構(gòu)與可能的二級(jí)斷裂機(jī)制如圖6所示。通過(guò)與雜質(zhì)2對(duì)照品對(duì)比，保留時(shí)間、母離子與二級(jí)碎片離子均一致，鑒定該雜質(zhì)為2-乙氧基-4-氨基-5-氯苯甲酸。

圖6 雜質(zhì)2的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 6 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 2

雜質(zhì)3：二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7，母離子

m/z

404.1746 [M＋H]，經(jīng)過(guò)軟件計(jì)算分子式為CHClNO，比莫沙必利少一個(gè)F原子。其中碎片離子

m/z

198.0316存在，說(shuō)明含有A部分結(jié)構(gòu)，該部分為酰胺鍵斷裂生成，由此可推斷雜質(zhì)3的結(jié)構(gòu)與可能的二級(jí)斷裂機(jī)制如圖7所示。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，并通過(guò)與雜質(zhì)3對(duì)照品對(duì)比，保留時(shí)間、母離子與二級(jí)碎片離子均一致，鑒定該雜質(zhì)為4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[（4-芐基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺。

圖7 雜質(zhì)3的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 7 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 3

雜質(zhì)4：二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖8，母離子

m/z

466.1142 [M＋H]與

m/z

468.1111 [M＋H]豐度比約為1∶1，初步判斷內(nèi)含一個(gè)Br原子，經(jīng)過(guò)軟件計(jì)算分子式為CHBrFNO，與莫沙必利分子式相比，可判斷Br原子取代了Cl原子；碎片離子

m/z

241.9813與

m/z

243.9810豐度比約為1∶1，可判斷碎片內(nèi)含一個(gè)Br原子，參考莫沙必利斷裂機(jī)制，初步判斷雜質(zhì)4失去B部分基團(tuán)生成該碎片。由此推斷雜質(zhì)4的結(jié)構(gòu)與可能的斷裂機(jī)制如圖8所示。通過(guò)與雜質(zhì)4對(duì)照品對(duì)比，保留時(shí)間、母離子與二級(jí)碎片離子均一致，鑒定該雜質(zhì)為4-氨基-5-溴-2-乙氧基-

N

-{[4-（4-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺。

圖8 雜質(zhì)4的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 8 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 4

雜質(zhì)5：二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖9，母離子

m/z

422.1646 [M＋H]，經(jīng)過(guò)軟件計(jì)算分子式為CHClFNO，與莫沙必利互為同分異構(gòu)體。由于存在碎片離子

m/z

198.0316，該基團(tuán)為酰胺鍵斷裂生成，說(shuō)明含有A部分結(jié)構(gòu)。結(jié)合合成工藝，初步判斷為F原子位置異構(gòu)，通過(guò)與雜質(zhì)5對(duì)照品對(duì)比，保留時(shí)間、母離子與二級(jí)碎片離子均一致，鑒定該雜質(zhì)為4-氨基-5-氯-2-乙氧基-

N

-{[4-（3-氟苯基）-2-嗎啉基]甲基}苯甲酰胺，判斷雜質(zhì)5的結(jié)構(gòu)與可能的二級(jí)斷裂機(jī)制如圖9所示。

圖9 雜質(zhì)5的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 9 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 5

雜質(zhì)6：二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖10，母離子

m/z

367.1232 [M＋H]，經(jīng)過(guò)軟件計(jì)算分子式為CHClFNO。由于存在碎片離子

m/z

198.0321，說(shuō)明含有A部分結(jié)構(gòu)。碎片

m/z

198.0321為母離子失去基團(tuán)CHFNO生成，參考“3.4.3”項(xiàng)下的合成路線，該基團(tuán)與化合物Ⅲ分子式一致，由此判斷雜質(zhì)6的結(jié)構(gòu)與可能的二級(jí)斷裂機(jī)制如圖10所示。3.4.3 雜質(zhì)來(lái)源推測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，枸櫞酸莫沙必利的合成路線如圖11所示。結(jié)合表1中的雜質(zhì)質(zhì)譜信息與圖11合成路線對(duì)各雜質(zhì)來(lái)源推導(dǎo)如下。

圖10 雜質(zhì)6的MS2質(zhì)譜圖及可能裂解途徑Fig 10 MS2 spectrum and fragmentation pathway of impurity 6

圖11 枸櫞酸莫沙必利合成路線Fig 11 Synthetic route of mosapride citrate

雜質(zhì)1為化合物Ⅴ生成化合物Ⅵ過(guò)程中，兩個(gè)OH未發(fā)生脫水縮合形成嗎啉環(huán)，繼續(xù)參與下一步反應(yīng)，最終形成了該雜質(zhì)；雜質(zhì)2為枸櫞酸莫沙必利酰胺鍵水解生成；雜質(zhì)3結(jié)構(gòu)上比莫沙必利少了一個(gè)F原子，初步判斷為化合物Ⅱ（對(duì)氟苯甲醛）中含有部分苯甲醛雜質(zhì)，苯甲醛參與合成反應(yīng)最終生成了該雜質(zhì)，該雜質(zhì)已見(jiàn)報(bào)道；雜質(zhì)4為化合物Ⅶ中含有部分溴代雜質(zhì)（2-乙氧基-4-氨基-5-溴苯甲酸），該溴代雜質(zhì)與化合物Ⅵ反應(yīng)生成；雜質(zhì)5為化合物Ⅱ中含有的間氟苯甲醛參與合成反應(yīng)生成；雜質(zhì)6為殘余的化合物Ⅲ與化合物Ⅶ發(fā)生副反應(yīng)生成。

4 小結(jié)

由于美國(guó)、歐盟的藥品注冊(cè)管理部門對(duì)雜質(zhì)鑒定有嚴(yán)格要求，對(duì)藥物中含量≥0.1%的雜質(zhì)要求進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，鑒定結(jié)構(gòu)后可為原料藥的質(zhì)量控制與合成工藝提供依據(jù)。由于TOF技術(shù)能準(zhǔn)確測(cè)定樣品的精確分子量，而且在全掃描和二級(jí)質(zhì)譜分析過(guò)程中具有非常高的靈敏度，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法對(duì)枸櫞酸莫沙必利中的6個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行了定性研究，通過(guò)與雜質(zhì)對(duì)照品對(duì)比，鑒定了其中4個(gè)雜質(zhì)。需進(jìn)一步優(yōu)化工藝路線與存儲(chǔ)條件，避免雜質(zhì)的產(chǎn)生。本文可為枸櫞酸莫沙必利的工藝優(yōu)化與質(zhì)量控制提供參考。