楊越莛，鄭楓，蔡滸，柳文媛，2*（. 中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京 298；2. 浙江省原料藥安全研究中心（工藝技術(shù)創(chuàng)新平臺），杭州 3008）

基因毒性雜質(zhì)（genotoxic impurities，GTIs），又稱遺傳毒性雜質(zhì)，是一類具有致癌性和致突變性的特殊雜質(zhì)。該類物質(zhì)大多具有親電活性，能與DNA發(fā)生共價結(jié)合并對其造成直接或間接損傷，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤或遺傳疾病的生成。

與一般雜質(zhì)不同，基因毒性雜質(zhì)在極低濃度時便可觸發(fā)效應(yīng)，其低水平高毒性的特點引起了醫(yī)藥行業(yè)的廣泛關(guān)注，嚴(yán)格控制藥物中基因毒性雜質(zhì)也顯得格外重要起來。

2018年，“纈沙坦事件”的爆發(fā)將基因毒性雜質(zhì)帶進(jìn)了大眾視野之中，各國監(jiān)管部門也開始出臺和完善相關(guān)指導(dǎo)原則。研究表明，

N

-亞硝基類化合物在經(jīng)體內(nèi)代謝后會表現(xiàn)出極強(qiáng)的基因毒性，嚴(yán)重威脅人類健康。早在1987年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)就明確把

N

-亞硝基二甲胺（

N

-nitrosodimethylamine，NDMA）和

N

-亞硝基二乙胺（

N

-nitrosodiethylamine，NDEA）列為2A類致癌物質(zhì)；ICH《M7（R1）：評估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在的致癌風(fēng)險》也將該類化合物歸屬于“關(guān)注隊列”之中，旨在讓藥學(xué)研究者們給予高度重視。間苯三酚注射液主要適用于消化系統(tǒng)以及膽道功能障礙引起的急性痙攣性疼痛，其活性成分為三甲基間苯三酚（trimethyl phloroglucinol，TMP）和間苯三酚二水合物（phloroglucinol，PGO），同時TMP也是PGO工藝路線中間體1，3，5-三甲氧基苯（1，3，5-tribromobenzene，PGO-1）精制后的成品，合成路線見圖1。以苯胺為原料進(jìn)行間苯三酚起始物料1，3，5-三溴苯（1，3，5-tribromobenzene，PGO-01）的合成，在這一步驟中殘留的重氮化試劑可能會造成亞硝酸鈉污染，進(jìn)而與

N

，

N

-二甲基甲酰胺中的二甲胺和二乙胺反應(yīng)生成NDMA和NDEA。

圖1 PGO合成工藝路線Fig 1 Synthesis of PGO

目前常用的NDMA和NDEA分析方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）等。由于亞硝胺雜質(zhì)的殘留水平一般較低，常規(guī)檢測器往往不能滿足其檢測要求，因此在分析該類雜質(zhì)時通常會考慮衍生化方法或是選擇高分辨檢測器以提高方法的靈敏度。為保證藥品質(zhì)量以及用藥安全，需對間苯三酚中間產(chǎn)物TMP中可能含有的基因毒性雜質(zhì)NDMA和NDEA進(jìn)行分析與控制。目前國內(nèi)外尚未有相關(guān)研究報道，因此本研究旨在建立一套適用于TMP中NDMA和NDEA檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，可為間苯三酚注射液原料藥的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AT液相色譜儀（LC-20AT二元梯度泵、SIL-20A自動進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱，日本島津公司）；SCIEX TRIPLE QUAD 3500質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；賽多利斯SQP電子天平、賽多利斯BSA124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

NDMA（含 量：97.80%，批 號：510166-201902）、NDEA（含量：99.70%，批號：510168-201902）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；TMP供 試 品（批 號：20191201、20191202、20191203，揚州三藥）；甲醇（色譜級，批號：1069707004，德國默克）；甲酸（色譜級，批號：C11119020，上海麥克林生化科技有限公司）；實驗用水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫程序見表1；柱溫：40℃；流速：1.0 mL·min；進(jìn)樣量：60 μL。

表1 梯度洗脫程序
Tab 1 Gradient elution program

時間/min 流動相A/% 流動相B/%0.01 85 15 2.00 85 15 2.01 30 70 5.50 30 70 5.51 85 15 10.00 85 15

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：大氣壓化學(xué)電離源（APCI）；檢測模式：正離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；氣簾氣壓力（CUR）：35 psi；碰撞氣（CAD）：8 psi；霧化電流（NC）：3.0 μA；離子源溫度（TEM）：650℃；霧化氣（GS1）：65 psi；NDMA離子對（

m/z

）：75.1/58.2、去簇電壓（DP）：42 V、碰撞氣能量（CE）：18 eV、駐留時間：400 ms；NDEA離 子 對（

m/z

）：103.0/75.1、DP：19 V、CE：22 eV、駐留時間：200 ms；閥切換程序：0.00 min，B閥；2.20 min，A閥；6.00 min，B閥。

2.3 溶液配制

2.3.1 空白溶劑 即稀釋溶劑，0.1%甲酸溶液∶甲醇＝85∶15。

2.3.2 混合對照品溶液 取NDMA約24 mg或取NDEA約13 mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得NDMA或NDEA對照品儲備液。精密移取NDMA對照品儲備液0.2 mL和NDEA對照品儲備液0.1 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密移取上述溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)限度混合雜質(zhì)對照溶液 精密移取混合對照品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 TMP供試品溶液 取TMP供試品約200 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，加稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.5 供試品加樣溶液 取TMP供試品約200 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，精密移取混合對照品溶液1 mL，加甲醇超聲溶解，加稀釋溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 專屬性

分別取空白溶劑、標(biāo)準(zhǔn)限度混合雜質(zhì)對照溶液、TMP供試品溶液及供試品加樣溶液進(jìn)樣分析并記錄色譜圖，結(jié)果顯示NDMA和NDEA的測定不會受到干擾，方法專屬性良好，見圖2。

圖2 TMP中NDMA和NDEA測定的典型色譜圖Fig 2 Typical chromatogram of NDMA and NDEA in TMP

2.5 檢測限和定量限

精密移取“2.3.2”項下混合對照品溶液，逐級稀釋合適倍數(shù)后進(jìn)樣，分別將信噪比（

S/N

）為3和10作為檢測限和定量限。結(jié)果NDMA的檢測限為0.8454 ng·mL，定量限為2.818 ng·mL；NDEA的檢測限為0.2340 ng·mL，定量限為0.7800 ng·mL。

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密移取“2.3.2”項下混合對照品溶液0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL， 置 于10 mL量瓶中，加稀釋溶劑稀釋，制得系列線性溶液。以待測雜質(zhì)峰面積（

y

）對其質(zhì)量濃度（

x

，ng·mL）作圖并進(jìn)行線性回歸計算，結(jié)果NDMA的回歸方程為

y

＝3638.1

x

＋1156.9，

r

＝0.9996，線性范 圍為2.818～18.79 ng·mL，NDEA的回歸方程為

y

＝2183.6

x

＋38.444，

r

＝0.9998，線性范圍為0.7800～5.200 ng·mL。

2.7 精密度

取“2.3.3”項下標(biāo)準(zhǔn)限度混合雜質(zhì)對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各雜質(zhì)的峰面積和保留時間。結(jié)果顯示，NDMA峰面積的

RSD

為1.5%，保留時間的

RSD

為0.12%；NDEA峰面積的

RSD

為4.7%，保留時間的

RSD

為0.060%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性和中間精密度

平行配制兩份標(biāo)準(zhǔn)限度混合雜質(zhì)對照溶液、6份TMP供試品溶液和6份供試品加樣溶液來考察方法重復(fù)性。結(jié)果顯示NDMA和NDEA含量的

RSD

分別為1.7%和6.2%，表明方法重復(fù)性良好。不同分析人員在不同日期重復(fù)上述試驗考察方法中間精密度，結(jié)果顯示NDMA和NDEA含量的

RSD

分別為2.3%和6.3%，精密度試驗中NDMA和NDEA含量的

RSD

分別為2.3%和6.0%，表明方法中間精密度良好。

2.9 回收試驗

分別平行配制兩份標(biāo)準(zhǔn)限度混合雜質(zhì)對照溶液和3份TMP供試品溶液，按“2.3.5”項下方法配制雜質(zhì)限度為50%、100%和150%的供試品加樣溶液，每個水平平行配制3份。結(jié)果NDMA和NDEA的平均回收率在98.82%～107.49%，

RSD

在1.7%～3.4%。

2.10 穩(wěn)定性

取標(biāo)準(zhǔn)限度混合雜質(zhì)對照溶液、TMP供試品溶液和供試品加樣溶液室溫放置，分別在0、3、6、9、12和15 h進(jìn)樣分析，記錄各雜質(zhì)峰面積并計算其變化率。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)限度混合雜質(zhì)對照溶液中NDMA和NDEA的峰面積變化率分別低于3.6%和6.1%；供試品加樣溶液中NDMA和NDEA的峰面積變化率分別低于4.4%和11.2%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.11 耐用性

改變流動相的起始比例（%）、流速（mL·min）、柱溫（℃）和不同型號色譜柱以考察分析環(huán)境的微小變動對方法的影響，發(fā)現(xiàn)在各個色譜條件下NDMA和NDEA的檢測均不會受到干擾，方法耐用性良好，具體結(jié)果見表2。

表2 NDMA和NDEA的耐用性試驗結(jié)果
Tab 2 Durability test of NDMA and NDEA

色譜條件 NDMA含量/% RSD/% NDEA含量/% RSD/%標(biāo)準(zhǔn)條件 0.000 045 47 3.3 0.000 012 99 5.0流動相86∶14 0.000 046 51 0.000 013 45流動相84∶16 0.000 048 52 0.000 012 18標(biāo)準(zhǔn)條件 0.000 045 47 2.0 0.000 012 99 6.0流速0.9 mL·min－1 0.000 045 60 0.000 013 11流速1.1 mL·min－1 0.000 047 14 0.000 014 44標(biāo)準(zhǔn)條件 0.000 045 47 1.7 0.000 012 99 5.7柱溫39℃ 0.000 046 22 0.000 013 26柱溫41℃ 0.000 047 07 0.000 011 89標(biāo)準(zhǔn)條件 0.000 045 47 2.6 0.000 012 99 1.4更換色譜柱 0.000 047 17 0.000 013 25

2.12 樣品檢測

分別取3批TMP樣品（批號：20191201、20191202、20191203）進(jìn)行檢測，結(jié)果均無NDMA和NDEA檢出。

3 討論

3.1 NDMA和NDEA的限度制訂

N

-亞硝基類雜質(zhì)致癌風(fēng)險普遍較高，若完全按照ICH M7（R1）指南提出的毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）1.5 μg·d來進(jìn)行限度控制并不合理。對于NDMA和NDEA這類有相關(guān)致癌性試驗數(shù)據(jù)的雜質(zhì)而言，可通過在數(shù)據(jù)庫中查找

TD

值來計算每日可接受攝入量（acceptable intake，AI）。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）公布了NDMA和NDEA的AI值分別為96 ng·d和26.5 ng·d。為實現(xiàn)

N

-亞硝基類雜質(zhì)的嚴(yán)格控制，按國內(nèi)說明書記載的最大用藥劑量200 mg·d計算，將TMP原料藥中NDMA和NDEA限度分別制訂為0.48 μg·g和0.13 μg·g。

3.2 條件優(yōu)化

本研究在前期方法摸索時分別考察了水-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇和0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸甲醇溶液三種流動相。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，水-甲醇體系下NDMA峰形矮胖，響應(yīng)較低。通過在水相中添加甲酸能夠明顯改善上述問題，而繼續(xù)在有機(jī)相中添加甲酸并不會對NDMA和NDEA的峰形及響應(yīng)造成太大影響。因此，為在保證試驗結(jié)果的同時盡可能簡化操作步驟，最終選擇了0.1%甲酸溶液-甲醇。

在色譜柱的選擇上，先后考察了Megres C柱、Ultimate XB-C柱和Inertsil ODS-3柱。其中，Megres C柱在使用過程中壓力太高，超過儀器可承受的最大壓力；Ultimate XB-C也存在壓力偏高的問題，雖可使用，但各待測物色譜峰普遍出峰較晚，分析時間長，故也不選用。而Inertsil ODS-3柱較好地解決了上述問題，在有效縮短分析時長的同時，還能保證理想的分離度與峰形，因此最終選擇了Inertsil ODS-3柱。

在離子源的選擇上，先后比較了電噴霧電離源（ESI）和APCI兩種常用的離子源。使用ESI時發(fā)現(xiàn)NDMA和NDEA響應(yīng)均比較低，靈敏度較差；而APCI作為一種有效的電離補(bǔ)充方式可以較好地解決這一問題，這可能與NDMA和NDEA自身的分子量以及極性有關(guān)?；谏鲜鲈囼灲Y(jié)果，最終選擇APCI為電離方式。

3.3 總結(jié)與展望

本研究建立了TMP原料藥中基因毒性雜質(zhì)NDMA和NDEA的檢測分析方法并完成了相應(yīng)的全套方法學(xué)驗證。結(jié)果顯示，該法能夠同時對NDMA和NDEA進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，可為間苯三酚注射液原料藥的質(zhì)量研究提供參考，保障藥品有效性與用藥安全性。