黎葉凡，朱華旭，唐志書*，劉紅波，宋忠興，姬莎莎（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2. 秦藥特色資源研究與開發(fā)國家重點實驗室（培育）/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)/江蘇省植物藥深加工工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023）

傳統(tǒng)山茱萸皂苷分離純化大多使用化學(xué)沉淀法、正丁醇萃取法、重結(jié)晶法、分餾法，傳統(tǒng)純化方法存在效率低、步驟繁瑣，重復(fù)性差、純化周期長，一些方法有機溶劑殘留嚴(yán)重等缺點，無法應(yīng)用于大量皂苷的分離純化。大孔吸附樹脂為一種常用的純化手段，具有吸附解吸速度快、吸附容量大、容易再生、使用壽命長等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于皂苷的分離和富集。

膜分離技術(shù)（membrane separation technology，MST）是一門分離新技術(shù)。利用“篩分”效應(yīng)實現(xiàn)大分子與小分子分離，具有效率高、污染小、節(jié)省能源等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)境等多個領(lǐng)域，成為當(dāng)今分離科學(xué)中最重要的手段之一。MST主要利用相對分子質(zhì)量的差異達(dá)到分離的目的，對皂苷的分離純化有非常重要的應(yīng)用價值。目前已經(jīng)應(yīng)用 MST 對絞股藍(lán)皂苷、三七葉苷、油茶皂苷、胡蘆巴總苷等多種皂苷類成分進行了分離純化，且顯示出良好的效果。

本試驗將傳統(tǒng)大孔樹脂吸附的分離純化工藝與現(xiàn)代MST聯(lián)合，以過膜前后皂苷含量、除雜率、回收率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率、膜污染程度為評價指標(biāo)，綜合評價不同孔徑的微濾膜、超濾膜，不同種類大孔樹脂對山茱萸皂苷的適用性。以大孔樹脂的飽和吸附量、吸附率、解吸率評價大孔樹脂污染程度。

1 材料

1.1 儀器

N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；UV-2600型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限責(zé)任公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Sartorius CPA225D型電子分析天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度：十萬分之一）；Scout型電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司，精度：百分之一）；LNG-HFM-101型實驗室膜分離設(shè)備（上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司）；Waters 2695 HPLC高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9202-3型紅外線恒溫鼓風(fēng)干燥箱（金壇區(qū)華城敏科實驗儀器廠）；YKF-150型制水機（杭州華新凈水有限公司）。

1.2 試藥

山茱萸藥材購自陜西興盛德藥業(yè)有限公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍教授鑒定符合2020年版《中國藥典》有關(guān)質(zhì)量規(guī)定；人參皂苷Re（批號：110754-202028，供含量測定用）、馬錢苷（批號：111640-201808，供含量測定用）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；莫諾苷、獐牙菜苷、山茱萸新苷對照品（批號分別為121768-202014、111396-201911、111345-201908，供含量測定用，上海源葉生物科技有限公司）；PVDF微濾膜（0.1 μm，0.22 μm，0.45 μm）、PES超濾膜（100 kDa，50 kDa，30 kDa，10 kDa，5 kDa）（美 國Biomax公司）；乙腈（色譜純，霍尼威爾貿(mào)易上海有限公司）；磷酸（色譜純，天津市天士力化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸均為分析純；HPD-600、HPD-300、D-101、H-103、AB-8、NKA-9型大孔樹脂（西安藍(lán)深特種樹脂有限公司）；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 山茱萸皂苷的測定

精密稱取人參皂苷 Re對照品2 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL于具塞試管中，水浴加熱揮干溶劑，精密加入新鮮配制的 5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，振搖混勻后于60℃ 水浴加熱15 min取出，冰水冷卻2 min后，加冰醋酸 5 mL搖勻，靜置5 min。溶液在400～800 nm范圍內(nèi)掃描，對照空白試劑，測得人參皂苷Re的最大吸收波長為540 nm，故選擇540 nm為測定波長。以吸光度（

A

）為縱坐標(biāo)，人參皂苷 Re質(zhì)量濃度（

C

）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：

A

＝20.826

C

－0.1222，

R

＝0.9997。結(jié)果表明，人參皂苷Re在5～30 μg·mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2）結(jié)果枝上有花芽，能開花結(jié)果。按其長短和特性可分為混合枝、長果枝、中果枝、短果枝、花束狀果枝。①混合枝。長度在20 cm以上，中上部側(cè)芽全部是葉芽，枝條基部幾個側(cè)芽為花芽。②長果枝。長度15～20 cm，除頂芽及其鄰近幾個側(cè)芽為葉芽外，其余側(cè)芽均為花芽。③中果枝。長度5～15 cm，除頂芽為葉芽外，側(cè)芽全部為花芽。④短果枝。長度5 cm以下，除頂芽為葉芽外，其余芽全部為花芽。⑤花束狀果枝。一種極短的結(jié)果枝，年生長量很小，僅1～2 cm，節(jié)間很短，除頂芽為葉芽外，其余均為花芽，圍繞在葉芽周圍。以上幾類結(jié)果枝因品種、樹齡、樹勢不同，所占比例也不同。

2.2 皂苷的提取工藝流程

稱取山茱萸飲片適量，將藥材粉碎后加入圓底燒瓶，加10倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，冷卻過濾，合并濾液，離心棄沉淀得上清液，上清液減壓濃縮至無醇味，加6倍量蒸餾水混合均勻，即得山茱萸水溶液，備用。山茱萸水溶液用MST進行純化精制，再使用傳統(tǒng)大孔樹脂吸附工藝進一步純化。

2.3 指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率的測定

2.3.1 色譜條件色譜柱Ultimate XB-C（250 mm×4.6 mm，5 μm）；PDA二極管陣列檢測器；柱溫30℃；體積流量1.0 mL·min；檢測波長240 nm；進樣量10 μL；梯度洗脫條件見表1。

表1 HPLC梯度洗脫條件
Tab 1 Gradient elution conditions of HPLC

時間/min A. 0.3%磷酸/% B. 乙腈/%1 90 10 5 86 14 9 84 16 12 83 17 15 72 28 18 66 34 25 90 10

2.3.2 對照品溶液的配制 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、山茱萸新苷對照品各9.98、9.97、9.96、9.97 mg，置10 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度各為0.998 mg·mL、0.997 mg·mL、0.996 mg·mL、0.997 mg·mL的莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、山茱萸新苷對照品儲備液。

2.3.3 混合對照品溶液的配制 取獐牙菜苷對照品儲備液0.5 mL置于10 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，得0.05 mg·mL獐牙菜苷對照品溶液。取獐牙菜苷對照品溶液1 mL、取馬錢苷對照品儲備液0.6 mL、莫諾苷對照品儲備液0.8 mL、山茱萸新苷對照品儲備液0.1 mL置于10 mL量瓶中，得混合對照品溶液。

2.3.4 供試品溶液的制備 分別精密量取各供試品溶液1 mL，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干溶劑，加80%甲醇溶解，置于10 mL量瓶中，加80%甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密吸取馬錢苷、莫諾苷對照品儲備液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻。取獐牙菜苷對照品儲備液0.1、0.5、1、1.5、2 mL分別置于100 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻。取山茱萸新苷對照品儲備液0.5、1、1.5、2、2.5 mL分別置于100 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻。各進樣 10 μL測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（

X

），峰面積為縱坐標(biāo)（

Y

），進行線性回歸，得回歸方程見表2。

表2 各成分線性關(guān)系(＝6)
Tab 2 Linear relationship of components (＝6)

成分 回歸方程 R2 線性范圍/（μg·mL－1）馬錢苷 Y＝2×107X－2.19×103 0.9998 9.98～99.8莫諾苷 Y＝2×107X－1.47×104 0.9998 9.97～99.7獐牙菜苷 Y＝2×107X－8.86×103 0.9999 0.996～19.92山茱萸新苷 Y＝1×107X－4.30×104 0.9998 4.99～24.93

2.3.6 除雜率（

Q

）與皂苷回收率（

P

）的計算

Q

＝（

Q

－

Q

）/

Q

×100%，式中

Q

為山茱萸水溶液固形物含量，

Q

為透過液固形物含量。

P

＝（

P

/

P

）×100%，式中

P

為透過液皂苷含量，

P

為原液皂苷含量。

Q

值越大，說明該除雜方式去除雜質(zhì)效果越好；

P

值越大，說明透過液中的皂苷含量越高。2.3.7 指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率（

T

）的計算

T

＝

C

/

C

×100%，式中

C

為滲透液中馬錢苷、莫諾苷、獐牙菜苷、山茱萸新苷含量，

C

為原液中馬錢苷、莫諾苷、獐牙菜苷、山茱萸新苷含量。

T

值越大，說明山茱萸皂苷中單成分轉(zhuǎn)移率越高。2.3.8 膜污染程度的測定 使用通量下降率（

M

）表示膜污染程度：

M

＝（

J

－

J

）/

J

×100%，

J

為初始純水通量，

J

為污染膜的純水穩(wěn)定通量。

M

越大，表示透過量衰減越大，污染越嚴(yán)重。

2.4 微濾膜技術(shù)的精制處理[28]

山茱萸水溶液分別經(jīng)膜孔徑為0.1、0.22、0.45 μm的聚偏氟乙烯微濾膜（MF）處理，得微濾滲透液。以過膜前后除雜率、皂苷回收率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率及膜污染程度為評價標(biāo)準(zhǔn)，考察不同孔徑的聚偏氟乙烯微濾膜對該體系的適用性。膜微濾操作條件：過膜溫度 25℃，過膜壓差值 0.3 MPa，結(jié)果見表3、4。皂苷含量、回收率與指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率隨膜孔徑的增大而增大；膜污染程度與除雜率隨膜孔徑的增大而減小。可能由于乙醇提取得到的山茱萸水溶液中低極性成分和皂苷形成不溶于水的復(fù)合物被微濾膜截留下來，膜孔徑小，導(dǎo)致山茱萸水溶液中雜質(zhì)攔截多，微濾膜的膜孔徑構(gòu)架上吸附雜質(zhì)變多，在微濾膜表面形成的濾餅層較厚，導(dǎo)致皂苷的透過減少，從而皂苷含量、回收率與指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率下降明顯。同理，膜孔徑越小攔截雜質(zhì)較多，除雜率越高，膜表面污染物的沉積使小孔徑膜產(chǎn)生了更為嚴(yán)重的膜污染，導(dǎo)致膜污染速度加快，膜污染程度嚴(yán)重，從而造成此現(xiàn)象。綜合考慮0.22 μm孔徑的微濾膜（MF0.22）最為適用。

表3 微濾膜孔徑對除雜率和皂苷回收率的影響(＝3)
Tab 3 Effect of pore size of microfiltration membrane on impurity removal rate and saponin recovery rate (＝3)

MF膜孔徑/ μm 皂苷含量/% 除雜率/% 皂苷回收率/%0.1 47.43±2.21 35.45±2.76 80.24±2.51 0.22 53.88±3.56 28.72±1.89 93.71±3.23 0.45 75.51±3.32 10.73±3.12 96.35±1.96

表4 微濾膜孔徑對皂苷成分轉(zhuǎn)移率與膜污染程度的影響(＝3)
Tab 4 Effect of pore size of microfiltration membrane on saponin transfer rate and membrane pollution degree (＝3)

MF膜孔徑/ μm 指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率/% 膜污染程度/%馬錢苷 莫諾苷 獐芽菜苷 山茱萸新苷0.1 68.16±2.76 75.44±1.21 72.34±1.78 63.41±2.65 56.67±1.88 0.22 83.34±1.86 84.39±1.54 80.15±2.31 78.29±1.87 45.52±2.15 0.45 89.45±3.11 88.57±2.16 85.65±1.44 83.15±1.63 32.77±1.64

2.5 超濾膜技術(shù)的精制處理

山茱萸水溶液分別經(jīng)膜孔徑為截留相對分子質(zhì)量分別為5、10、30、50、100 kDa的聚醚砜超濾膜（UF）處理，得超濾膜滲透液。以過膜前后除雜率、皂苷回收率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率及膜污染程度為評價標(biāo)準(zhǔn)，考察不同孔徑的聚醚砜超濾膜對該體系的適用性。膜微濾操作條件：過膜溫度25℃，過膜壓差值 0.3 MPa，結(jié)果見表5、6。從表5、6可知，皂苷含量、回收率與指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率隨膜孔徑的增大而增大；膜污染程度與除雜率隨膜孔徑的增大而減小。綜合考慮各項因素，選擇50 kDa孔徑的超濾膜（UF50）來純化山茱萸皂苷較為適宜。

表5 超濾膜孔徑對除雜率和皂苷回收率的影響(＝5)
Tab 5 Effect of ultrafiltration membrane pore size on impurity removal rate and saponin recovery (＝5)

UF膜孔徑/kDa 皂苷含量/% 除雜率/% 皂苷回收率/%5 10.12±1.81 51.60±2.67 52.68±2.39 10 15.64±1.37 48.41±1.03 60.43±1.56 30 32.28±2.05 43.74±1.12 83.45±0.97 50 35.53±1.32 40.31±2.78 86.33±1.09 100 43.86±2.15 22.98±2.14 95.25±2.34

表6 超濾膜孔徑對皂苷成分轉(zhuǎn)移率與膜污染程度的影響 (＝5)
Tab 6 Effect of ultrafiltration membrane pore size on saponin transfer rate and membrane pollution degree (＝5)

UF膜孔徑/ kDa 指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率/% 膜污染程度/%馬錢苷 莫諾苷 獐芽菜苷 山茱萸新苷5 28.64±1.34 31.09±1.52 25.27±1.66 34.68±1.84 58.60±2.67 10 33.41±2.15 36.59±2.08 32.19±1.45 47.38±1.65 46.41±1.03 30 51.37±1.76 57.72±1.79 51.39±1.81 65.34±2.08 37.74±1.12 50 54.86±1.53 60.81±1.52 53.61±2.17 68.93±1.89 34.31±2.78 100 65.32±2.37 71.23±2.13 68.33±1.95 80.16±2.01 22.98±2.14

2.6 大孔樹脂技術(shù)的精制處理

2.6.1 大孔樹脂種類篩選 試驗選取6種適合分離山茱萸皂苷的大孔吸附樹脂（見表7），從中選出最優(yōu)樹脂用于分離純化山茱萸皂苷。

表7 大孔樹脂種類與性質(zhì)(＝6)
Tab 7 Types and properties of macroporous resin (＝6)

樹脂型號 平均孔徑/μm 比表面積/（m2·g－1）HPD-600 80～90 550～600 HPD-300 90～110 500～550 D-101 90～100 500～550 H-103 85～95 1000～1100 AB-8 130～140 480～520 NKA-9 100～120 500～550

① 大孔樹脂預(yù)處理：將大孔樹脂用95%乙醇于室溫下浸泡24 h，傾去上層乙醇，濕法裝柱，用95%乙醇沖洗樹脂柱，至流出液加水不產(chǎn)生白色渾濁為止；再用純化水沖洗樹脂柱至流出液無醇味；然后，用2 BV體積5%HCl溶液沖洗樹脂柱，再用純化水沖洗至流出液呈中性；再用2 BV體積5%NaOH溶液沖洗樹脂柱，最后用純化水沖洗至流出液呈中性，備用。

② 靜態(tài)吸附：精密稱取已預(yù)處理好的大孔樹脂HPD-600、HPD-300、D-101、H-103、AB-8、NKA-9各10 g，置于150 mL錐形瓶中，加入山茱萸水溶液40 mL，置于25℃恒溫水浴搖床上，以110 r·min的速度震蕩4 h，靜置12 h，使其達(dá)到飽和吸附，吸取上層藥液檢測。

③ 靜態(tài)解吸：取上述達(dá)到靜態(tài)飽和吸附藥液的大孔樹脂，濾過，水洗凈，吸干表面水分，加入55%乙醇40 mL，置于25℃恒溫水浴搖床上，以110 r·min的速度震蕩2 h，靜置8 h，使其解吸完全，以大孔樹脂吸附洗脫前后除雜率、皂苷回收率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率為評價標(biāo)準(zhǔn)，考察不同種類的大孔樹脂對該體系的適用性。結(jié)果見表8。

表8 大孔樹脂種類對除雜率和皂苷回收率及皂苷成分轉(zhuǎn)移率的影響(＝6)
Tab 8 Effect of macroporous resin types on impurity removal rate, saponin recovery rate and saponin component transfer rate (＝6)

樹脂類型 皂苷含量/% 除雜率/% 皂苷回收率/% 指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率/%馬錢苷 莫諾苷 獐芽菜苷 山茱萸新苷AB-8 44.73±2.05 30.19±1.68 62.44±1.66 70.15±1.66 75.07±1.57 65.16±1.35 59.23±1.58 HPD-300 65.59±1.87 42.33±1.93 88.16±2.03 87.61±2.33 93.72±1.69 85.33±1.89 83.17±1.77 D-101 58.34±2.13 35.82±2.07 77.45±1.84 80.13±1.89 86.39±1.74 76.47±1.76 72.32±1.59 H-103 48.67±1.94 31.94±1.57 68.58±2.18 74.76±2.15 78.51±2.02 68.94±1.54 63.67±1.62 HPD-600 61.56±2.23 38.61±2.18 82.92±1.73 83.49±2.19 90.18±1.58 81.69±2.11 78.34±1.88 NKA-9 55.34±1.85 33.74±1.86 73.66±1.84 77.42±1.38 82.43±1.69 72.17±1.23 67.23±1.97

由表8可知，HPD-300型大孔樹脂的皂苷含量達(dá)到（65.59±1.87）%，除雜率為（42.33±1.93）%，皂苷回收率為（88.16±2.03）%，這3個指標(biāo)成分均高于其他5種大孔樹脂，指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率相較于其他5種大孔樹脂也有明顯的提高，HPD-300型大孔樹脂對山茱萸皂苷體系的適用性較好，故選擇 HPD-300 型大孔樹脂來分離純化山茱萸皂苷。

2.7 微濾膜與超濾膜聯(lián)用技術(shù)的精制處理

先將山茱萸水溶液經(jīng)MF0.22微濾膜濾過后，再將微濾膜滲透液經(jīng)UF50超濾膜濾過，收集超濾膜滲透液。以處理前后的除雜率、皂苷回收率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率為評價標(biāo)準(zhǔn)，考察膜聯(lián)用方式對該體系的適用性。結(jié)果見表9。

表9 不同聯(lián)用方式對除雜率和皂苷回收率及皂苷成分轉(zhuǎn)移率的影響(＝4)
Tab 9 Effects of different combination methods on impurity removal rate, saponin recovery rate and saponin component transfer rate (＝4)

聯(lián)用方式 皂苷含量/%除雜率/%皂苷回收率/%指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率/%馬錢苷 莫諾苷 獐芽菜苷 山茱萸新苷HPD-300（1號） 52.02±1.58 64.59±1.56 69.82±1.79 60.51±1.71 55.76±1.28 57.83±1.33 57.12±1.77 MF0.22＋UF50（2號） 48.32±1.49 48.61±1.31 75.82±2.48 56.34±1.65 53.42±1.39 51.43±1.71 54.35±1.62 MF0.22＋HPD-300（3號） 55.98±1.16 67.64±2.07 66.17±1.54 65.81±1.33 57.17±1.51 62.58±1.65 57.29±1.44 UF50＋HPD-300（4號） 58.24±1.32 71.41±1.91 62.62±2.01 71.28±1.62 63.48±1.65 65.61±1.44 58.73±1.57 MF0.22＋UF50＋HPD-300（5號）65.05±1.27 75.22±2.54 57.57±1.67 75.33±1.43 68.35±1.32 70.06±1.52 60.49±1.51

2.8 膜技術(shù)與大孔樹脂聯(lián)用技術(shù)的精制處理

分別將“2.4”“2.5”“2.7”項下得到的微濾膜滲透液、超濾膜滲透液、微濾超濾聯(lián)用滲透液，經(jīng)濃縮后分別加入到HPD-300大孔樹脂柱中，靜置吸附2 h。先用蒸餾水沖洗至流出液無色，再用55%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液。以處理前后除雜率、皂苷回收率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率為評價標(biāo)準(zhǔn)，考察不同聯(lián)用方式對該體系的適用性。結(jié)果見表9。

由表9可知，微濾超濾聯(lián)用處理山茱萸水溶液（2號）與傳統(tǒng)工藝大孔樹脂吸附（1號）相比，在純化方面確實無法達(dá)到大孔樹脂純化的效果，可能由于單純使用膜處理純化藥液，不能去除小于膜孔徑的雜質(zhì)，而傳統(tǒng)大孔樹脂可以吸附較多粒徑小的雜質(zhì)，無法使用單純膜技術(shù)處理替代大孔樹脂分離純化山茱萸皂苷。聯(lián)用（5號）在皂苷含量、除雜率、回收率與指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率上效果顯著，明顯高于傳統(tǒng)大孔樹脂吸附工藝與其他聯(lián)用方式。將不同分離原理的膜分離技術(shù)與大孔樹脂分離聯(lián)用，去除雜質(zhì)的范圍較廣，得到的山茱萸皂苷含量高，故選擇聯(lián)用技術(shù)來純化山茱萸皂苷。

2.9 膜技術(shù)前處理對大孔樹脂使用效率及次數(shù)的影響

2.9.1 飽和吸附量 將“2.2”“2.7”項下所得的山茱萸水溶液、微濾超濾聯(lián)用滲透液分別作為大孔樹脂的上樣溶液，以2 BV·h的速度進行上樣，分段收集55%乙醇洗脫液，每份收集50 mL，收集1～10份流出液，測定皂苷含量。流出液中皂苷濃度如果達(dá)到上樣液濃度的10%時，稱為泄漏點，當(dāng)流出液中皂苷濃度達(dá)到上樣液濃度的100%時，稱為飽和點。計算吸附率（

E

）：

E

（%）＝（

M

－

M

）/

M

×100%（

M

為吸附前溶液皂苷質(zhì)量；

M

為吸附后溶液皂苷質(zhì)量）。

從圖1、2看出，山茱萸水溶液的大孔樹脂飽和吸附量為300 mL，經(jīng)過微濾超濾處理的藥液飽和吸附量為500 mL，飽和吸附量提高40%。經(jīng)過微濾超濾前處理，可以使大孔樹脂飽和吸附量明顯提高，可能由于山茱萸水溶液中雜質(zhì)較多，過多地占據(jù)大孔樹脂孔道，或者覆蓋在樹脂表面直接導(dǎo)致吸附的藥液量減少。而經(jīng)由微濾超濾處理的山茱萸透過液，其中可吸附的雜質(zhì)等物質(zhì)減少，可以減輕樹脂孔道堵塞，減少樹脂表面雜質(zhì)覆蓋。大孔樹脂的飽和吸附量增加明顯，直接提高大孔樹脂的最大使用效率。

圖1 山茱萸水溶液在大孔樹脂上泄露曲線Fig 1 Leakage curve of Cornus saponins saponin stock solution on macroporous resin

圖2 山茱萸微濾超濾滲透液在大孔樹脂上泄露曲線Fig 2 Leakage curve of Cornus saponins ultrafiltration permeate on macroporous resin

2.9.2 大孔樹脂使用次數(shù)靜態(tài)吸附實驗 稱取已處理好的大孔樹脂HPD-300各10 g，置于150 mL錐形瓶中，分別取“2.2”“2.7”項下所得的山茱萸水溶液、微濾超濾聯(lián)用滲透液各40 mL，置于25℃恒溫水浴搖床上以110 r·min的速度震蕩4 h，靜置2 h，使其達(dá)到飽和吸附，吸取上層藥液測定皂苷的濃度。比較山茱萸水溶液、微濾超濾聯(lián)用滲透液兩者使用多次后吸附率的變化。再將已吸附飽和藥液的HPD-300大孔樹脂濾過，水洗凈，吸干表面水分。各加入55%乙醇40 mL，置于25℃恒溫水浴搖床上，以110 r·min的速度震蕩4 h，靜置2 h。使其解吸完全，測定洗脫液的皂苷濃度。比較山茱萸水溶液、微濾超濾聯(lián)用滲透液兩者使用多次后解吸率的變化，解吸后，適量蒸餾水洗至無醇味，大孔樹脂完成一次使用。同樣操作重復(fù)10次，計算出每次的吸附率與解吸率。對比相同使用次數(shù)條件下，兩種藥液吸附率與解吸率變化。計算解吸率（

W

）：

W

（%）＝

M

/（

M

－

M

）×100%（

M

為解吸溶液中皂苷質(zhì)量；

M

為吸附后溶液皂苷質(zhì)量；

M

為吸附前溶液皂苷質(zhì)量）。

由圖3中可知，首次使用時大孔樹脂對山茱萸水溶液、微濾超濾聯(lián)用滲透液吸附率分別為93.48%與93.71%，吸附率差異較小。在使用第4次時兩者溶液吸附率分別為88.73%與92.11%，山茱萸水溶液吸附率明顯下降。到使用第10次時兩者溶液吸附率分別為79.36%與85.31%。由于使用次數(shù)增加，樹脂表面及內(nèi)部都會殘留許多非吸附性成分或雜質(zhì)，導(dǎo)致樹脂表面被覆蓋或孔道被部分填充，待測物再次填充難度增大，吸附量下降。由圖4中可知，在初次使用時兩者溶液解吸率分別為98.34%與98.17%，解吸率同樣差異較小。使用第10次時兩者溶液解吸率分別為80.25%與87.74%，解吸率差別較大。由于使用次數(shù)增加，樹脂吸附量下降，直接導(dǎo)致吸附的皂苷量減少，解吸出來的皂苷量降低，解吸率隨之下降。經(jīng)過微濾超濾前處理的山茱萸水溶液有效提高大孔樹脂的吸附率與解吸率，可增加大孔樹脂的使用次數(shù)，提高大孔樹脂使用壽命。

圖3 大孔樹脂使用次數(shù)與吸附率變化趨勢Fig 3 Change trend of the times of use and adsorption rate of macroporous resin

圖4 大孔樹脂使用次數(shù)與解吸率變化趨勢Fig 4 Change trend of the times of use and desorption rate of macroporous resin

3 討論

本試驗采用MST與傳統(tǒng)大孔樹脂吸附工藝聯(lián)合對山茱萸水溶液進行了精制處理。從皂苷含量、除雜率、回收率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率及膜污染程度等多方面綜合分析了不同膜孔徑及不同大孔樹脂種類對山茱萸水溶液液精制效果的影響。山茱萸水溶液經(jīng)聯(lián)用精制處理后，除雜率分別比前期研究的傳統(tǒng)工藝大孔樹脂吸附提高11.63%，馬錢苷、莫諾苷、獐芽菜苷與山茱萸新苷單成分含量較傳統(tǒng)工藝大孔樹脂洗脫有明顯提高，聯(lián)用技術(shù)可克服傳統(tǒng)工藝中存在的有效成分損失嚴(yán)重、生產(chǎn)效率低等不足。且研究發(fā)現(xiàn)在使用 0.22 μm孔徑的微濾膜與50 kDa孔徑超濾膜，聯(lián)用HPD-300型大孔樹脂吸附工藝的條件下，能夠有效去除雜質(zhì)，并對指標(biāo)成分有較好的保留率。

本研究優(yōu)化工藝操作性與復(fù)制性強，可嘗試推廣到生產(chǎn)中，用以提高皂苷含量，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，為日后此類研究提供了新的思路和方法。本研究的不足：只考察了膜孔徑，沒有考察過膜條件的影響因素，包括過膜壓力、膜材料以及過膜藥液溫度的影響。對不同純化工藝得到的山茱萸皂苷缺少藥效學(xué)方面的考察。下一步試驗中需要對這些問題進行深入研究。