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        基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的木蝴蝶質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

        2022-03-30 02:05:02趙淼包永睿王帥李天嬌孟憲生遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院遼寧大連6600遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心遼寧大連6600遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室遼寧大連6600
        中南藥學(xué) 2022年2期
        關(guān)鍵詞:木蝴蝶醛酸白楊

        趙淼,包永睿,2,3,王帥,2,3,李天嬌,2,3,孟憲生,2,3*(. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 6600;2. 遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心,遼寧 大連 6600;3. 遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 6600)

        木蝴蝶來源于紫葳科植物木蝴蝶

        Oroxylum indicum

        (L.)Vent.的干燥成熟種子,始載于《滇南本草》,味苦、甘,性涼,歸肺經(jīng)、肝經(jīng),具有清肺利咽、疏肝和胃的功效,常用于治療肺熱咳嗽、喉痹、音啞、肝胃氣痛等,主產(chǎn)于福建、臺(tái)灣、廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南等地。木蝴蝶主要含有黃酮及其苷類、揮發(fā)油及脂肪酸類、對(duì)羥基苯乙醇和環(huán)己醇及紫檀堿類化合物等,其中黃酮類是木蝴蝶的主要成分,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明木蝴蝶具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用。

        質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker)是在溯源與傳遞性、特有性、可測(cè)性、有效性以及處方配伍這五項(xiàng)核心原則的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于廣藿香、南柴胡、甘草等中藥及復(fù)方制劑的質(zhì)量研究中,為中藥及復(fù)方制劑中與臨床作用相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)的研究提供了新思路。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,采用高效液相色譜法對(duì)木蝴蝶藥材進(jìn)行定性定量研究,并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,初步篩選出差異標(biāo)志物,進(jìn)一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行有效性分析,從化學(xué)和生物信息角度分析預(yù)測(cè)木蝴蝶的潛在Q-Marker,為木蝴蝶的質(zhì)量控制及后續(xù)開發(fā)提供參考。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        Agilent 1260型快速高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司);Sartorius CP225D電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);Poroshell 120 SB-C色 譜 柱(4.6 mm×100 mm,2.7 μm,美國(guó)安捷倫科技有限公司)。

        1.2 試藥

        10批木蝴蝶藥材,產(chǎn)地分別為湖南、安徽、福建、貴州、廣東、廣西、四川成都、四川眉山、云南昆明、云南麗江,編號(hào)為S1~S10,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為

        Oroxylum indicum

        (L.)Vent.的干燥成熟種子。木蝴蝶苷A(批號(hào):111595-201604)、木蝴蝶苷B(批號(hào):111915-201608)、黃芩素(批號(hào):111595-200301)、白楊素(批號(hào):111701-200503)、金絲桃苷(批號(hào):1521-200204)、白楊素7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷(批號(hào):111701-200607)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%);乙腈、甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司);水(純凈水,杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 基于“五原則”的木蝴蝶藥材Q-Marker來源的文獻(xiàn)分析

        關(guān)于木蝴蝶藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),2020年版《中國(guó)藥典》僅規(guī)定了木蝴蝶苷B的含量限度,檢測(cè)指標(biāo)單一,難以體現(xiàn)木蝴蝶的整體質(zhì)量。中藥Q-Marker是劉昌孝院士提出的新概念,中藥Q-Marker是存在于中藥材和中藥產(chǎn)品中固有的或加工制備過程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì),有助于進(jìn)一步提升中藥有效性-物質(zhì)基礎(chǔ)-質(zhì)量控制標(biāo)志性成分的關(guān)聯(lián)度。本文通過文獻(xiàn)整合,從傳統(tǒng)藥性及藥效因素、化學(xué)成分特有性及可測(cè)性、體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化等方面對(duì)木蝴蝶的Q-Marker進(jìn)行預(yù)測(cè),為建立木蝴蝶藥材的準(zhǔn)確的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)全面的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

        2.1.1 基于傳統(tǒng)藥性藥效的Q-Marker預(yù)測(cè)分析 藥性理論與功效研究是中藥臨床應(yīng)用的前提條件,可以從不同角度客觀描述中藥治療疾病的機(jī)制與性能,因此可作為Q-Marker預(yù)測(cè)分析的依據(jù)之一。木蝴蝶味苦、甘,性涼,歸肺經(jīng)、肝經(jīng),苦能清熱解毒,涼則燥濕瀉火。現(xiàn)代研究表明,苦涼清熱藥在對(duì)抗炎性反應(yīng)、抗過氧化損傷、抗炎性細(xì)胞因子等方面有良好的表現(xiàn),其物質(zhì)基礎(chǔ)多以黃酮類、生物堿類為主。木蝴蝶入藥始載于《滇南本草》,其能定喘,消痰,破蠱積,又能補(bǔ)虛,寬中,進(jìn)食。后《本草綱目拾遺》記載其能治心氣痛、肝氣痛,下部濕熱。而2020年版《中國(guó)藥典》記錄木蝴蝶具有清肺利咽、疏肝和胃的功效,可用于治療肺熱咳嗽、喉痹、音啞、肝胃氣痛。木蝴蝶的清熱止咳及保肝作用得益于其豐富的黃酮類成分,如木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩苷、白楊素、黃芩素等。綜上所述,木蝴蝶中的黃酮類成分是其發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ),可作為木蝴蝶Q-Marker篩選的潛在成分。

        2.1.2 基于化學(xué)成分特有性及可測(cè)性的Q-Marker預(yù)測(cè)分析 木蝴蝶中化學(xué)成分眾多,主要包括黃酮及其苷類、揮發(fā)油及脂肪酸類、對(duì)羥基苯乙醇類、環(huán)己醇及紫檀堿類化合物等。其中黃酮及其苷類成分為木蝴蝶的主要有效物質(zhì),在抗炎、抗氧化、抗肝癌等方面表現(xiàn)出良好的生物活性。何民友等利用多反應(yīng)選擇性檢測(cè)的方法對(duì)木蝴蝶配方顆粒中黃酮類指標(biāo)性的代表成分(木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩素、黃芩苷、白楊素、白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷)進(jìn)行檢測(cè),該方法線性關(guān)系良好,回收率高,能夠?qū)δ竞M(jìn)行快速鑒別并有效檢測(cè)化學(xué)成分含量;也有學(xué)者基于UPLC-MS/MS法測(cè)定不同產(chǎn)地木蝴蝶中10種黃酮類成分,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的黃酮類成分在含量上存在差異。由此可知,木蝴蝶黃酮類可能與木蝴蝶有效性密切相關(guān),且均可進(jìn)行定量檢測(cè)與分析,由此可作為Q-Marker的潛在成分。

        2.1.3 基于體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的Q-Marker預(yù)測(cè)分析 中藥成分復(fù)雜多樣,但其有效成分需要吸收入血、到達(dá)靶器官并作用于相應(yīng)靶點(diǎn)后才能發(fā)揮藥效。因此,分析給藥后藥物的代謝過程,篩選出藥效成分,有助于闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并確定Q-Marker。張博崴考察了木蝴蝶黃酮類成分中黃芩苷元的腸道代謝動(dòng)力學(xué),發(fā)現(xiàn)口服給藥后黃芩苷元在腸內(nèi)有較高分布,1 h時(shí)含量為總給藥量的87%,12 h時(shí)含量為總給藥量的20%,遠(yuǎn)高于腸道藥理活性的起效濃度。尹金妥研究發(fā)現(xiàn)木蝴蝶苷B在大鼠體內(nèi)可通過羰基化,乙?;鉃辄S芩素和木蝴蝶苷A,進(jìn)一步以苷元和單糖形式代謝。上述研究均表明,木蝴蝶黃酮類成分可作為木蝴蝶質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。

        2.2 木蝴蝶指紋圖譜研究

        2.2.1 色譜條件 使用Agilent Poroshell 120 SBC色譜柱(4.6 mm×100 mm,2.7 μm),流動(dòng)相為乙腈(B)-0.1%甲酸水溶液(A),程序梯度洗脫(0~10 min,15%~57%B;10~15 min,57%~65%B),柱溫30℃,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm,流速0.6 mL·min。

        2.2.2 供試品溶液的制備 分別取各產(chǎn)地木蝴蝶藥材,精密稱定,按照木蝴蝶黃酮類成分最佳提取純化工藝條件進(jìn)行制備。取純化物0.1 g,精密稱定,置于50 mL量瓶中,用50%甲醇溶液稀釋至刻度,過0.22 μm微孔濾膜,作為供試品溶液,4℃保存,備用。

        2.2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 取木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白楊素、白楊素7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷、黃芩素、金絲桃苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.593、0.404、0.122、0.388、0.223、0.503 mg·mL的混合對(duì)照品溶液。

        2.2.4 方法學(xué)考察

        ① 參照峰的選擇:2020年版《中國(guó)藥典》將木蝴蝶苷B作為評(píng)價(jià)木蝴蝶質(zhì)量的指標(biāo)性成分,其含量較高,色譜峰較穩(wěn)定,故選擇木蝴蝶苷B作為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

        ② 精密度試驗(yàn):取S1批次木蝴蝶供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。結(jié)果木蝴蝶的各共有峰相對(duì)保留時(shí)間

        RSD

        <0.37%,相對(duì)峰面積

        RSD

        <3.9%,說明儀器精密度良好。③ 穩(wěn)定性試驗(yàn):取S1批次木蝴蝶供試品溶 液,分 別 于0、4、8、12、24、48 h進(jìn) 樣 分析,記錄色譜圖。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

        RSD

        <0.22%,相對(duì)峰面積

        RSD

        <4.0%,表明樣品穩(wěn)定性較好。④ 重復(fù)性試驗(yàn):平行制備6份S1批次木蝴蝶供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

        RSD

        <0.86%,相對(duì)峰面積

        RSD

        <3.0%,表明方法重復(fù)性較好,符合指紋圖譜要求。2.2.5 指紋圖譜的建立與評(píng)價(jià) 取10批木蝴蝶藥材,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。將10批供試品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版),以S1為參照,采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行色譜匹配,中位數(shù)法生成疊加圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜R,共標(biāo)定20個(gè)共有峰。結(jié)果S1~S10相似度依次為0.917、0.929、0.998、0.991、0.959、0.994、0.995、0.996、0.987、0.996,表明各批次木蝴蝶藥材具有良好的一致性。經(jīng)過與混合對(duì)照品溶液圖譜的比對(duì),指認(rèn)了其中的6個(gè)色譜峰,分別為5號(hào)峰金絲桃苷、8號(hào)峰木蝴蝶苷B、13號(hào)峰木蝴蝶苷A、16號(hào)峰白楊素-7-

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷、18號(hào)峰黃芩素、20號(hào)峰白楊素。10批木蝴蝶指紋圖譜疊加圖見圖1,共有模式及對(duì)照品圖譜見圖2。

        圖1 10批木蝴蝶藥材指紋圖譜疊加圖Fig 1 HPLC fingerprints of 10 batches of Oroxylum indicum

        圖2 木蝴蝶指紋圖譜共有模式圖(A)及混合對(duì)照品色譜圖(B)Fig 2 Chromatogram of reference fingerprint of Oroxylum indicum(A)and reference substances(B)

        2.2.6 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA) 采用PLS-DA對(duì)木蝴蝶20個(gè)共有峰進(jìn)行分析,得分矩陣圖和變量重要性投影預(yù)測(cè)結(jié)果分別見圖3、4。模型擬合參數(shù)

        R

        =0.792,

        R

        =0.903,模型預(yù)測(cè)參數(shù)

        Q

        =0.532,均大于0.5,可知該模型穩(wěn)定,預(yù)測(cè)能力較好。圖3顯示木蝴蝶藥材S1~S5聚為一類,S6~S10聚為一類,說明不同產(chǎn)地的木蝴蝶藥材在成分上存在差異。

        圖3 10批木蝴蝶樣品的PLS-DA得分圖Fig 3 PLS-DA score plot for 10 batches of Oroxylum indicum

        為更好地明確不同產(chǎn)地木蝴蝶藥材中差異較大的物質(zhì),結(jié)合各變量的VIP(variable importance in the projection)值正態(tài)分布圖(見圖4),篩選出貢獻(xiàn)較大的6個(gè)變量(VIP>1),VIP值由大到小依次為18號(hào)峰(黃芩素)、16號(hào)峰(白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷)、8號(hào)峰(木蝴蝶苷B)、20號(hào)峰(白楊素)、13號(hào)峰(木蝴蝶苷A)、11號(hào)峰。這些成分在區(qū)分不同產(chǎn)地木蝴蝶時(shí)起到重要作用,是木蝴蝶的差異標(biāo)志物。

        圖4 木蝴蝶藥材的重要變量Fig 4 Important variables of Oroxylum indicum

        2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

        木蝴蝶具有清肺利咽、疏肝和胃的功效,其主要活性成分為黃酮類化合物,包括木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩素等成分,具有抗炎、抗氧化、抗肝癌等藥理活性。本實(shí)驗(yàn)基于文獻(xiàn)研究結(jié)合指紋圖譜的可測(cè)性及可溯性,確定指紋圖譜所指認(rèn)的木蝴蝶苷B、木蝴蝶苷A、黃芩素、白楊素、白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷5個(gè)活性成分為候選化合物。2.3.1 活性成分靶點(diǎn)信息的收集 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、Uniprot(https://www.uniprot.org/)共得到木蝴蝶苷B、木蝴蝶苷A、黃芩素、白楊素、白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷5個(gè)候選化合物的63個(gè)作用靶點(diǎn),本課題組研究表明前期木蝴蝶苷B具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用,但未在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋到相關(guān)靶點(diǎn),故僅對(duì)其余4個(gè)化合物進(jìn)行后續(xù)分析。2.3.2 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將4個(gè)有效活性成分涉及的靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)信息,選取最高置信度蛋白交互參數(shù)評(píng)分值(>0.9),構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將得到的tsv格式文件導(dǎo)入Cytoscape軟件,按照度值(degree)由大到小進(jìn)行排序,見圖5。排名前10的基因分別為

        AKT1

        、

        TP53

        、

        FOS

        、

        HIF1A

        PTGS2

        、

        CASP3

        、

        MMP9

        、

        NOS3

        、

        HSP90AA1

        、

        IL-4

        ,它們可能是木蝴蝶的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

        圖5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig 5 Construction of protein-protein interaction network

        2.3.3 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

        ① GO功能富集分析:采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://David-d.ncifcrf.gov/home.jsp),以

        P

        <0.05、FDR<0.05作為篩選條件對(duì)上述63個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析,共獲得257條結(jié)果,其中生物過程(biological process,BP)占180個(gè),細(xì)胞組成(cellular component,CC)占23個(gè),分子功能(molecular function,MF)占54個(gè),根據(jù)

        P

        值由大到小排序,取前20條結(jié)果,進(jìn)行可視化分析,如圖6所示。結(jié)果顯示生物過程主要涉及到細(xì)胞凋亡、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、白細(xì)胞介素IL-18生物合成過程的正調(diào)控等;分子功能主要富集在氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、組蛋白激酶活性等;細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞核周圍區(qū)域。② KEGG通路富集分析:利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)以

        P

        <0.05、FDR<0.05為篩選條件對(duì)上述63個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果共得到20個(gè)條目,如圖6所示。主要涉及的通路有:癌癥通路(pathways in cancer)、細(xì)胞凋亡通路(apoptotic signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)等,以上結(jié)果表明中藥木蝴蝶具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn),能夠通過調(diào)控多條通路達(dá)到治療疾病的目的。

        圖6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析Fig 6 GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

        2.3.4 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 本研究根據(jù)篩選得到的4個(gè)成分、63個(gè)靶點(diǎn)和20條通路,運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果見圖7。以化合物、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路的連接度(degree)為參考,發(fā)現(xiàn)木蝴蝶苷A、白楊素、白楊素7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷、黃芩素4個(gè)化合物連接度差異不大,均可能是木蝴蝶的活性成分,

        AKT1

        、

        TP53

        CASP3

        、

        MMP9

        、

        IL-4

        可能是木蝴蝶活性成分作用于腫瘤、神經(jīng)活性配體等信號(hào)通路潛在的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

        圖7 木蝴蝶“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig 7 Network prediction of compound-target-pathway of Oroxylum indicum

        2.4 木蝴蝶藥材Q-Marker的含量測(cè)定

        2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白楊素、白楊素7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷、黃芩素對(duì)照品,加入甲醇制得質(zhì)量濃度為0.593、0.404、0.122、0.388、0.223 mg·mL的混合對(duì)照品溶液。

        2.4.2 方法學(xué)考察

        ① 線性關(guān)系考察:精密稱取“2.4.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,用甲醇倍比稀釋成系列對(duì)照品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(

        X

        ),峰面積為縱坐標(biāo)(

        Y

        ),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程,結(jié)果見表1。

        表1 5個(gè)指標(biāo)性成分的線性回歸方程
        Tab 1 Linear regression equation for 5 labeled components

        成分 回歸方程 r 線性范圍 /(mg·mL-1)木蝴蝶苷A Y=4.201×103X+27.27 0.9998 0.165~0.810木蝴蝶苷B Y=2.967×103X -55.13 0.9992 0.158~0.725黃芩素 Y=2.221×103X -35.57 0.9994 0.033~0.412白楊素 Y=4.354×103X -49.48 0.9999 0.027~0.337白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 Y=3.409×103X -13.09 0.9993 0.049~0.575

        ② 精密度試驗(yàn):取S1批次木蝴蝶供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果供試品溶液中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩素、白楊素、白楊素-7-

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷的峰面積

        RSD

        分別為2.1%、2.0%、0.69%、0.75%、1.9%,表明儀器精密度良好。③ 重復(fù)性試驗(yàn):取S1批次木蝴蝶供試品溶液6份,進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果供試品溶液中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩素、白楊素、白楊素-7-

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷的峰面積

        RSD

        分別為2.1%、2.2%、1.4%、1.2%、1.8%,表明該方法的重復(fù)性良好。④ 穩(wěn)定性試驗(yàn):取S1批次木蝴蝶供試品溶液,分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果供試品溶液中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩素、白楊素、白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷的峰面積

        RSD

        分別為1.1%、1.8%、1.4%、1.5%、1.2%,表明木蝴蝶供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。⑤ 加樣回收試驗(yàn):精密稱取6份已知含量的S1批次木蝴蝶粉末,根據(jù)樣品中各成分含量,按1∶1比例精密加入相應(yīng)對(duì)照品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。計(jì)算供試品中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩素、白楊素、白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷的平均加樣回收率分別為101.10%、98.88%、100.52%、99.93%、98.76%,

        RSD

        分別為0.87%、1.0%、0.82%、0.63%、0.51%,表明該方法回收率良好。2.4.3 樣品測(cè)定 分別精密稱取10批木蝴蝶樣品,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法的制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黃芩素、白楊素、白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷的含量,結(jié)果見表2。

        表2 10批木蝴蝶樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg·g)
        Tab 2 Content of 10 batches of (mg·g)

        樣品 木蝴蝶苷A 木蝴蝶苷B 黃芩素 白楊素 白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷S1 28.36 15.09 11.85 0.98 10.16 S2 27.11 20.68 9.16 1.48 4.25 S3 25.66 22.60 7.52 0.24 1.62 S4 25.13 24.04 5.31 0.17 0.95 S5 26.82 20.29 9.43 2.25 2.70 S6 26.44 21.95 9.05 0.93 0.04 S7 25.09 23.00 6.23 0.32 0.61 S8 28.31 19.52 7.63 0.27 8.64 S9 27.12 20.53 5.87 0.06 7.49 S10 25.62 23.46 6.70 0.22 0.84

        3 討論

        中藥質(zhì)量是臨床療效的保證,是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的生命線,中藥成分復(fù)雜、質(zhì)量參差不齊,因此建立更加科學(xué)、全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法尤為重要。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段,建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上,分析中藥的化學(xué)成分類型,對(duì)中藥進(jìn)行整體質(zhì)量控制;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”作用網(wǎng)絡(luò),預(yù)測(cè)中藥主要作用通路及靶點(diǎn),并進(jìn)一步闡釋中藥的作用機(jī)制,從理論上證明了中藥成分的有效性;Q-Marker是可以定性定量的特有性化學(xué)成分,能夠?qū)⒅兴幱行?物質(zhì)基礎(chǔ)-質(zhì)量控制標(biāo)志性成分相關(guān)聯(lián),解決在中藥有效性基礎(chǔ)上的中藥質(zhì)量評(píng)估問題。

        本研究采用指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法分析預(yù)測(cè)木蝴蝶的Q-Marker。首先通過查閱文獻(xiàn)初步鎖定木蝴蝶Q-Marker的來源范圍為黃酮類化合物,臨床研究表明黃酮類化合物具有抑菌、抗腫瘤、降血糖的功效,用于改善糖尿病、心血管疾病和腫瘤等多種疾病。通過建立木蝴蝶的指紋圖譜從傳遞和溯源性的角度對(duì)木蝴蝶進(jìn)行分析,認(rèn)為木蝴蝶苷B、木蝴蝶苷A、白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷、黃芩素、白楊素可作為木蝴蝶的差異化合物;進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從有效性的角度對(duì)其進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)木蝴蝶苷A等4種活性成分能通過調(diào)控

        AKT1

        、

        TP53

        、

        CASP3

        、

        MMP9

        、

        IL-4

        等靶點(diǎn)作用于癌癥通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、免疫信號(hào)等關(guān)鍵信號(hào)通路發(fā)揮抗炎,抗腫瘤,抗氧化作用。木蝴蝶苷A通過抑制AKT/GSK3

        β

        和STAT3信號(hào)通路的活性從而抑制肺腺癌細(xì)胞增殖;黃芩素可通過抑制AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑降低MMP-2和MMP-9的表達(dá),從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移;白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷可通過干預(yù)HRAS、JUN、PTPRC調(diào)節(jié)PI3K-AKT、花生四烯酸代謝等信號(hào)通路發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用;白楊素能夠通過促進(jìn)心肌MMP-2的表達(dá)并激活MAPK信號(hào)通路改善急性心肌梗死大鼠的心臟恢復(fù)功能;木蝴蝶苷B通過調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路、Ca離子信號(hào)通路和磷脂酶信號(hào)通路發(fā)揮體內(nèi)抗肝癌活性。由此可見篩選得到的靶點(diǎn)和通路與木蝴蝶抗炎抗腫瘤的現(xiàn)代藥理活性相契合,表明木蝴蝶Q-Marker的選取符合其藥理藥效特點(diǎn)。最后從化學(xué)成分可測(cè)性的角度對(duì)其主要成分進(jìn)行定量分析,5種成分含量較高,可測(cè)性好,在不同產(chǎn)地木蝴蝶中差異顯著,適合作為木蝴蝶的Q-Marker成分。綜上所述,本研究初步預(yù)測(cè)木蝴蝶苷B、木蝴蝶苷A、白楊素-7-

        O

        -

        β

        -

        D

        -葡萄糖醛酸苷、黃芩素、白楊素為木蝴蝶潛在的Q-Marker,為后期深入研究木蝴蝶藥效及作用機(jī)制提供參考,也有助于完善木蝴蝶的質(zhì)量控制體系,提高質(zhì)量控制水平。

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