黃瑋 李翔宇 趙彩云

【摘 要】 目的：制定佛甲草飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別、薄層色譜法對(duì)佛甲草飲片進(jìn)行鑒別，按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則進(jìn)行水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的測(cè)定，采用高效液相色譜法測(cè)定其槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量。結(jié)果：樣品的顯微特征明顯，薄層色譜鑒別斑點(diǎn)清晰，專(zhuān)屬性強(qiáng);7批樣品水分含量為8.04%～9.73%，總灰分含量為15.07%～20.53%，酸不溶性灰分5.12%～8.99%，水溶性浸出物含量為25.42%～40.12%;槲皮素、山奈素和異鼠李素3個(gè)成分的線(xiàn)性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的RSD均低于2.0%，加樣回收率分別為98.33%、98.92%和97.96%，RSD均小于2.0%（n=6）;3種成分的線(xiàn)性關(guān)系均良好（r≥0.9990） 結(jié)論：方法準(zhǔn)確穩(wěn)定，可用于佛甲草的質(zhì)量控制。初步擬定佛甲草水分不得過(guò)11.0%，酸不溶性灰分不得過(guò)9.0%，浸出物不得少于24.0%，槲皮素含量不得少于0.025%。

【關(guān)鍵詞】 佛甲草;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);顯微鑒別;薄層色譜法;含量測(cè)定

【中圖分類(lèi)號(hào)】R282?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）03-0046-05

Study on the Quality Standard of Sedilinearis Herba

HUANG Wei1 LIN Xiangyu2 ZHAO Caiyun1

1.Xuzhou food and Drug Administration and inspection center， Xuzhou 221006，China;

2. Xuzhou Medical Univercity， Xuzhou 221006，China

Abstract：Objective To establish the quality standard of Sedilinearis Herba. Methods? Microscopic identification，thin layer chromatography（TLC） were carried out， According to the corresponding methods in 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia（Part Ⅳ）， the contents of moisture， total ash and doluble extractive from 7 batches of Sedilinearis Herba were determined. The contents of quercetin， kaempferol and isorhamnetin were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Results The microseopic characteristics of Sedilinearis Herba were described in detail. TLC spots were clear and the specificity was strong.The contents of moisture， total ash， acid insoluble ash，and soluble extract from samples were 8.04%～9.73%，15.07%～20.53%， 5.12%～8.99%，25.42%～40.12%， respectively.The linear relationships of quercitrin， kaempferol and isorhamnetin were all good.， and the RSDs were all less than 2.0%. The recovery rates of the 3 components were 98.33%，98.92% and 97.96%， and the RSDs were all less than 2.0%（n=6）; the linear ralationships of the 3 components were all good（r≥0.9990）.Conclusions This method is accurate and stable， which can be used for the quality control of? Sedilinearis Herba. It is preliminarily proposed that moisture and acid insoluble ash content should not exceed 11.0% and 9.0%， and extract and quercetin content should not be less than 24.0% and 0.025%? respectively.

Key words：Sedilinearis Herba;Quality Standard;Microscopic Identification;Thin Layer Chromatography;Content Determination

佛甲草為景天科植物佛甲草Sedum lineae Thunb.的干燥全草 。主要分布于中南及江蘇、浙江、安徽、福建、江西、四川、貴州、云南、陜西、甘肅、臺(tái)灣等地[1]。有清熱解毒、消腫止血等功效。用于咽喉腫痛、目赤、痢疾、丹毒、帶狀皰疹、癰腫、燙、火傷和外傷出血[2] 。現(xiàn)收載于《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》2002年版，原標(biāo)準(zhǔn)只有性狀鑒別，目前尚無(wú)有關(guān)佛甲草質(zhì)量控制方面的文獻(xiàn)報(bào)道，為了更好地控制該飲片的質(zhì)量和安全性，結(jié)合參考文獻(xiàn)[3-5]，本研究通過(guò)增加顯微鑒別、薄層鑒別、常規(guī)檢查、浸出物測(cè)定及以槲皮素、山奈素和異鼠李素作為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，以期建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以便控制佛甲草飲片的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 FW177高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）;LEICA DM 2500透射光顯微成像系統(tǒng)（德國(guó)萊卡公司）;XSR205電子天平（瑞士Metter公司，精度十萬(wàn)分之一）;101A-1E型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）;SX2-5-12型箱式電阻爐（天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）;Waters e2695高效液相色譜儀（包括Empower3工作站，四元梯度泵，2998PDA檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱），均購(gòu)自于美國(guó)Waters公司。

1.2 樣品與試藥 槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-200907，純度為97.4%），山奈素對(duì)照品（批號(hào)：110861-201611，純度為95.5%），異鼠李素對(duì)照品（批號(hào)：110860-201611，純度為99.8%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;佛甲草對(duì)照藥材（自制）;甲醇為色譜純（Fish公司），水為超純水，其他試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。7批佛甲草飲片由企業(yè)提供，經(jīng)徐州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心趙彩云主任中藥師鑒定為佛甲草Sedum lineae Thunb.的干燥全草。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 本品粉末棕色。取本品粉末加水合氯醛試液加熱透化裝片，置顯微鏡下觀察：葉上表皮細(xì)胞壁較平直，下表皮細(xì)胞壁常波狀彎曲，氣孔不定式。非腺毛單細(xì)胞，直徑約20 μm?；ǚ哿＝蛐?，表面可見(jiàn)顆粒狀紋飾。纖維狹長(zhǎng)而筆直，大多成束。草酸鈣簇晶30～75 μm。導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管 。如圖1所示。

2.2 薄層鑒別 取供試品粉末1 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取佛甲草對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）[6]57試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷（1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖2所示。

2.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定 取佛甲草飲片粉末（過(guò)二號(hào)篩）2 g，精密稱(chēng)定，分別照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0832項(xiàng)下水分測(cè)定法（第二法 烘干法）、通則2302項(xiàng)下總灰分和酸不溶性灰分測(cè)定法測(cè)定水分[6]103、總灰分和酸不溶性灰分[6]204。各批次飲片均平行操作3次，取平均值。結(jié)果顯示，7批佛甲草的水分含量為8.04%～9.73%，平均值為9.07%，以平均值的120%設(shè)限，為10.88%，故暫定本品水分不得過(guò)11.0%?？偦曳趾繛?5.07%～20.53%，平均值為17.87%，以平均值的120%設(shè)限，為21.44%，數(shù)值較高故暫定不收入正文。酸不溶性灰分含量為5.12%～8.99%，平均值為7.14%，以平均值的120%設(shè)限，為8.56%，故暫定本品酸不溶性灰分不得過(guò)9.0%。詳見(jiàn)表2。

2.4 浸出物測(cè)定 取佛甲草飲片粉末（過(guò)二號(hào)篩）2 g，精密稱(chēng)定，照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2201水溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定浸出物含量[6]202。 以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量（%），結(jié)果7批佛甲草飲片水溶性浸出物含量為25.42%～40.12%，平均值為30.30%，以平均值的80%設(shè)限，為24.24%，故暫定本品水溶性浸出物不得少于24.0%。詳見(jiàn)表2。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：C18（ZORBAX，XDB，250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55），流速：1.0 mL/min，柱溫：32 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm，進(jìn)樣量10 μL。槲皮素、山柰素和異鼠李素峰與各自相鄰峰的分離度均大于2.0，理論板數(shù)均大于5000。

2.5.2 對(duì)照品溶液 取槲皮素、山柰素和異鼠李素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制備各單一對(duì)照品母液。分別精密量取一定量的各對(duì)照品母液，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋制成每1毫升含槲皮素40.87 μg、山柰素5.75 μg和異鼠李素5.92 μg的混合對(duì)照溶液。

2.5.3 供試品溶液 取本品2.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-30%鹽酸溶液（4∶1）25 mL，稱(chēng)定重量，置水浴中加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 陰性樣品溶液 取制備供試品溶液的溶劑，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.5.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，供試品色譜中槲皮素、山柰素和異鼠李素與各自相鄰峰的分離度均大于2.0，理論板數(shù)均大于5000，陰性樣品無(wú)干擾。色譜圖如圖3所示。

2.5.6 定量限與檢測(cè)限考察 分別精密量取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，以甲醇倍比稀釋?zhuān)础?.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為10∶1和3∶1分別計(jì)算3種待測(cè)成分的定量限和檢測(cè)限。結(jié)果顯示槲皮素、山奈素和異鼠李素的定量限分別為0.0163 μg/mL、0.0230 μg/mL、0.0237 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.006 μg/mL、0.0078 μg/mL、0.0079 μg/mL。

2.5.7 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密量取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25 μL， 按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X， μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線(xiàn)回歸，得回歸方程： Y（槲皮素）=4.0684×106X-2.1006×103（r=0.9999，n=6）; Y（山奈素）=4.6136×106X+7.6703×103 （r=0.9993，n=6）;Y（異鼠李素）=4.3187×106X+6.9922×103（r=0.9990，n=6），槲皮素進(jìn)樣量在0.08173～1.2260 μg，山柰素進(jìn)樣量在0.01151～0.1726 μg，異鼠李素進(jìn)樣量在0.01184～0.1776 μg的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5.8 精密度考察 取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定面積，結(jié)果槲皮素平均峰面積為1655646，RSD為0.28%（n=6），山奈素峰平均峰面積為266269，RSD為1.01%（n=6），異鼠李素平均峰面積為259635，RSD為1.68 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.9穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)：20151210），按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果槲皮素平均峰面積為1664001，RSD為0.41%（n=6），山柰素平均峰面積為114870，RSD為1.67%（n=6），異鼠李素平均峰面積為261482，RSD為1.61%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.10 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)：20151210）樣品6份，按“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果槲皮素、山柰素和異鼠李素的平均含量分別為0.4057 mg/g、0.0229 mg/g和0.0577 mg/g，RSD分別為1.77%、1.97%和1.86%（n=6），表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.5.11 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品（批號(hào)：20151210，槲皮素的平均含量為0.4053 mg/g，山柰素的平均含量為0.0230 mg/g， 異鼠李素的平均含量為0.0583 mg/g）約1.25 g，共6份，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入槲皮素對(duì)照品溶液（0.1022 mg/mL）5 mL、山柰素對(duì)照品溶液（0.01471 mg/mL）2mL和異鼠李素對(duì)照品溶液（0.02396 mg/mL）3 mL，按“2.5.3” 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別測(cè)定峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.12 樣品測(cè)定 分別取各批次飲片細(xì)粉適量，按“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算3種成分含量，結(jié)果按干燥品計(jì)算。見(jiàn)表4。

3 討論

在薄層色譜鑒別研究中考察了甲苯-三氯甲烷（1∶1）、環(huán)己烷-乙酸乙酯（40∶1）為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層層析，結(jié)果甲苯-三氯甲烷（1∶1）為展開(kāi)劑，層析的結(jié)果較好，斑點(diǎn)清晰;不同薄層板（Merck硅膠G板、青島海洋硅膠G 板、自制硅膠G層板）進(jìn)行比較，結(jié)果不同薄層板，薄層色譜分離效果均好，斑點(diǎn)清晰;不同溫、濕度條件（t：5 ℃，RH：30%;t：18 ℃，RH：40%;t：23 ℃，RH：50%））及穩(wěn)定性（0、2、8、24 h）試驗(yàn)，結(jié)果在三種溫濕度條件下薄層色譜結(jié)果均穩(wěn)定，斑點(diǎn)清晰，供試品溶液經(jīng)放置24 h后，層析結(jié)果依然穩(wěn)定，斑點(diǎn)清晰。結(jié)果表明該方法可行。

浸出物含量測(cè)定中，分別采用不同浸出方法（熱浸法、冷浸法），不同溶劑（乙醇、稀乙醇、 70%乙醇、30%乙醇、水）進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，采用熱浸法，以水為溶劑，測(cè)得浸出物量最高。故選擇水為溶劑，熱浸法進(jìn)行浸出物測(cè)定。

含量測(cè)定中，流動(dòng)相的選擇根據(jù)有關(guān)參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道槲皮素、山柰素與異鼠李素的HPLC測(cè)定方法，流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)供試品溶液中異鼠李素峰與前后峰沒(méi)完全分開(kāi)，故提高流動(dòng)相中水相的比例，結(jié)果各峰分離度較好，所以最終確定流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55）。供試品制備方法的選擇，對(duì)供試品回流溫度、時(shí)間及加入鹽酸濃度等影響因素進(jìn)行了考察，結(jié)果加入甲醇-30%鹽酸（4∶1）25 mL沸水浴回流30 min可酸解完全，樣品重復(fù)性高。本研究建立的含量測(cè)定方法能同時(shí)測(cè)定佛甲草中槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量，其中槲皮素含量最高，占測(cè)定的3種成分總含量的70%左右。據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，槲皮素具有抗氧化、抗病毒和抗炎的作用，與佛甲草具有清熱解毒、消腫止血等功效一致。因此，選擇槲皮素作為該飲片含量限定的指標(biāo)成分，7批樣品槲皮素的平均含量為0.031%， 以平均值的80%設(shè)限，為0.025%， 故暫定本品含槲皮素不得低于0.025%。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：2416-2417.

[2]江蘇省藥品監(jiān)督管理局.江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范[S]. 南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社： 2002：242.

[3]梅青.木芙蓉葉和佛甲草的鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[D].武漢：中南民族大學(xué)，2014.

[4]王璐瑤.佛甲草等景天屬植物藥中黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗腫瘤活性研究及含量測(cè)定[D]. 武漢：中南民族大學(xué)，2013.

[5]張莉霞，劉東彥，石曉峰，等. HPLP法同時(shí)測(cè)定雪松果中槲皮素、山奈素與異鼠李素的含量[J].中華中醫(yī)藥雜志：2018 （4）：1540-1542.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[M].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社：2015：59，114，232，234.

[7]汪正宇.垂盆草顆粒中槲皮素、山奈素與異鼠李素的HPLC測(cè)定方法研究[J].安徽醫(yī)藥，2015，19（8）：1474-1476.

[8]馬納，李亞靜，范吉平.槲皮素藥理作用研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018（8）：221-224.

（收稿日期：2021-06-01 編輯：劉 斌）

作者簡(jiǎn)介：黃瑋（1981-），女，漢族，本科，副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴幉募爸谐伤幍臋z驗(yàn)及質(zhì)量研究。E-mail：316243060@qq.com