張家昌，史玲玉，郭兆鋮，趙元，徐鵬程，張俊麗

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271016）

萜類化合物（Terpenoids）是植物次生代謝產(chǎn)物中結(jié)構(gòu)和數(shù)量最多的一類天然化合物，目前已知的種類超過50 000種[1]。由于其特殊且復(fù)雜多樣的生物活性，萜類化合物在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2]。生物體中，萜類化合物是以異戊二烯為單位，經(jīng)過環(huán)化、結(jié)構(gòu)重排及碳骨架氧化等一系列反應(yīng)衍生而來[3]。其中，法尼基焦磷酸作為重要的前體物質(zhì)，是由法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl Pyrophosphate Synthase，F(xiàn)PPS）催化異戊烯基焦磷酸及其異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸生成[4]。

近年來，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，通過構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠合成萜類化合物成為研究的熱點[5-6]。在微生物合成次生代謝產(chǎn)物的研究中，關(guān)鍵酶編碼基因的分析、克隆、鑒定及功能分析一直是研究重點和難點[7-10]，F(xiàn)PPS作為合成途徑中的關(guān)鍵酶，其表達(dá)量與酶活力對下游萜類化合物合成有重要影響，在代謝工程和合成生物學(xué)等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[11]。ANDERSON等[12]闡述了FPPS的特性、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、進(jìn)化、定位及其作為藥物開發(fā)靶點的研究進(jìn)展。劉美佳等[13]在克隆、分析珠子參FPPS基因cDNA序列的基礎(chǔ)上，通過調(diào)控皂苷生物合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，成功實現(xiàn)了皂苷的生物合成。李永波等[14]在植物法尼基焦磷酸合酶基因克隆、表達(dá)、酶動力學(xué)研究等方面闡述了重要觀點。

本研究利用生物信息學(xué)方法，選擇不同生物（包括植物、動物、微生物）來源的FPPS，通過分析其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能及系統(tǒng)演化關(guān)系，比較和分析在進(jìn)化過程中真核生物、原核生物以及不同物種間FPPS的進(jìn)化差異，以期為采用分子生物學(xué)和合成生物學(xué)手段，構(gòu)建生產(chǎn)萜類化合物的微生物細(xì)胞工廠奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取已在NCBI-Genbank數(shù)據(jù)庫中公布的20種生物的FPPS的核苷酸序列及氨基酸序列，序列號如表1所示。

表1 不同物種來源的法尼基焦磷酸合酶的核酸及蛋白質(zhì)序列號

1.2 分析方法

1.2.1 FPPS氨基酸序列分析

通過 ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）獲得20個物種的FPPS氨基酸序列的理化性質(zhì)。

1.2.2 FPPS系統(tǒng)進(jìn)化分析

運用BioEdit將20個物種的核苷酸及氨基酸序列分別整合成一個Fasta格式的文件，然后利用Clustal Omega在線工具進(jìn)行多序列比對，結(jié)果保存為“.clustal_num”格式的文件，可運用多序列比對結(jié)果編輯器如Jalview對其加工美化；系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和檢驗通過本地軟件MEGA實施時，先將多序列比對結(jié)果保存成.meg格式，然后采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，使用自展值（Bootstrap）重復(fù)檢驗1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 FPPS氨基酸序列分析

通過在線工具ProtParam對FPPS的氨基酸序列進(jìn)行研究，分析其氨基酸組成及理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)量、分子量、等電點、帶正負(fù)電殘基數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族指數(shù)和蛋白質(zhì)親疏水性（GRAVY）等信息，相關(guān)結(jié)果如表2所示。

表2 不同物種來源的法尼基焦磷酸合酶氨基酸序列的理化性質(zhì)

從表2可以看出，氨基酸數(shù)量為288～419個不等，等電點在4～7波動，脂肪族指數(shù)為100左右；不穩(wěn)定指數(shù)＞40的為不穩(wěn)定類蛋白質(zhì)，其中擬南芥、大腸桿菌、黑腹果蠅、牛、蜜蜂、黑猩猩、褐家鼠的FPPS屬于不穩(wěn)定類蛋白質(zhì)，其余屬于穩(wěn)定類蛋白質(zhì)；GRAVY為負(fù)值時，說明氨基酸為親水性的，為正值時說明氨基酸是疏水性的，其絕對值越大則其表示親/疏水性越強，即莢膜紅細(xì)菌來源的FPPS為疏水性蛋白質(zhì)，其余來源的FPPS為親水性蛋白質(zhì)。

2.2 FPPS系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.1 FPPS氨基酸序列比對分析

基因組不同功能區(qū)段在演化過程中面對不同的選擇壓力，重要的區(qū)段不易發(fā)生變化，不重要的區(qū)段易發(fā)生變化。多序列比對在系統(tǒng)發(fā)育分析、基因和蛋白質(zhì)功能分析、突變分析、序列拼接方面都有重要的應(yīng)用。

通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)域I中除蜜蜂第二位氨基酸殘基為G外，G（1位）、K（2位）和R（5位）在另外19種生物中均為保守氨基酸，其賴氨酸殘基能夠促進(jìn)FPPS與異戊烯焦磷酸（IPP）的結(jié)合。WANG等[15]發(fā)現(xiàn)與其他生物一樣，植物FPPS也具有5個保守結(jié)構(gòu)域，即：結(jié)構(gòu)域Ⅰ（GKXXR）、結(jié)構(gòu)域Ⅱ（EXXXXXXLXXDDXXDXXXXRRG）、結(jié)構(gòu)域Ⅲ（GQXXD）、結(jié)構(gòu)域Ⅳ（KT）和結(jié)構(gòu)域Ⅴ（GXXFQXXDDXXDXXXXXXXXGK XXXDXXXXK）。SZKOPINSKA等[16]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PPS具有2個天冬氨酸富集區(qū)，即結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅴ中的DDXXD（X代表任意氨基酸）。

2.2.2 FPPS氨基酸序列分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)發(fā)育分析用于描述同源序列之間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，為了探索不同物種之間FPPS的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，利用上述多序列比對結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，F(xiàn)PPS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分為植物、真菌、動物和細(xì)菌4個類群，具有較顯著的種族特異性。由上述多序列比對結(jié)果可知，蜜蜂FPPS氨基酸序列與其余真核生物FPPS相比，在保守區(qū)域某些位點容易發(fā)生變化，因此，蜜蜂與其余物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而細(xì)菌等原核生物在保守位點發(fā)生一些位點的插入或缺失，因此，細(xì)菌單獨聚成一支。

3 結(jié)論

本研究以不同物種來源的FPPS核苷酸序列及氨基酸序列為研究對象，分析不同物種FPPS在進(jìn)化中的差異，尋找它們易發(fā)生突變的位點以及保守序列。這為采用分子生物學(xué)技術(shù)，定點修飾編碼該酶保守區(qū)中某些重要氨基酸殘基密碼子提高酶催化速率，進(jìn)而提高次生代謝產(chǎn)物的合成提供一定依據(jù)。