趙富清，謝天艷，秦寶福*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西咸陽 712199；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海西寧 811600）

藜麥（Chenopodium quinoa）為藜科藜屬一年生雙子葉C3植物，是一種古老的安第斯糧食作物，在當(dāng)?shù)仫嬍持姓加兄匾匚?。藜麥富含多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，是適合人類食用的全營養(yǎng)谷物，得天獨厚的高原氣候孕育出品質(zhì)優(yōu)良、產(chǎn)量豐富的藜麥作物。目前，藜麥已經(jīng)在我國內(nèi)蒙古、拉薩、甘肅、青海、寧夏以及山西等地廣泛種植。隨著藜麥種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大和藜麥籽實食用價值的深入研究，對高原藜麥營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分的開發(fā)應(yīng)用也越發(fā)廣泛[1]。植物內(nèi)生菌生活在健康植物中，能夠增強(qiáng)宿主植物對生物脅迫及非生物脅迫的抗逆性，主要表現(xiàn)在抗旱、對病原菌拮抗等方面，提高宿主的抵抗能力[2]。藜麥內(nèi)生菌的分離有利于豐富生防菌資源的開發(fā)與利用。

果蔬等在生長、采摘、運(yùn)輸、貯藏等過程中若處理不當(dāng)，易腐爛變質(zhì)，而真菌性病原菌是引起果蔬等腐爛的主導(dǎo)因素[3]。其中鏈格孢屬（Alternariasp.）、鐮孢菌屬（Fusariumsp.）、刺盤孢屬（Colletotrichumsp.）真菌為常見典型植物病原菌，可引起多種植物根、莖、葉、花、果實等病害，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)下降[4]。分離具有生防作用的內(nèi)生菌，對于防治農(nóng)作物病害具有重要的意義。

本研究對藜麥內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化，并篩選對鐮孢菌屬、鏈格孢屬、刺盤孢屬等常見病原真菌具有抑菌活性的拮抗菌株，對其抑制活性進(jìn)行初步研究以及菌種鑒定，以期為高原藜麥開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料

藜麥品種為“青藜2號”，由青海省農(nóng)林科學(xué)院提供；炭疽菌（Colletotrichum nigrum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、鏈格孢菌（Alternaria alternata），由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯 200 g、葡萄糖 15 g、瓊脂 15 g、蒸餾水 1 000 mL），牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值為7.0～7.2）。

1.1.2 儀器

104T/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HIRAYAMA型高壓蒸汽滅菌鍋，華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司；SX2-12-16TP型電熱恒溫干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；BPH-9272型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BS-1F型全溫?fù)u瓶柜，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藜麥內(nèi)生菌拮抗菌篩選

（1）分離純化。采集健康的藜麥植株，用流動清水洗凈污垢并在超凈工作臺進(jìn)行表面消毒：乙醇浸泡0.5 min、3%的次氯酸鈉水溶液浸泡5 min。取出后用無菌水漂洗3～5次。采用組織分離法，將消毒后的藜麥組織用消毒滅菌的剪刀剪成0.5 cm的小塊，用無菌鑷子將各組織分別置于NA平板中，每個平板放置3塊組織，設(shè)置3次重復(fù)，以最后一次漂洗液涂布平板檢測有無雜菌污染。NA平板置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，當(dāng)觀察到試驗材料邊緣有菌長出后，根據(jù)菌落顏色、形態(tài)等特點挑選不同的單菌落純化至單一菌株。

（2）初篩。采用平板對峙法進(jìn)行初篩，以磚紅鐮刀菌為指示病原菌，將病原真菌活化接種于PDA平板中央，在距平板邊緣2.5 cm處，接種6個篩選菌株，以只接病原菌為對照，每個處理重復(fù)3次，于30 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，觀察并測量抑菌帶，對具有抑菌效果的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

（3）復(fù)篩。將3種供試病原菌菌餅與初篩活性菌株對稱接種于PDA平板距平板邊緣2.5 cm 處，以只接病原菌作為對照，每個處理重復(fù)3次，30 ℃培養(yǎng)7～10 d，觀察并測量病原真菌菌落直徑，計算出內(nèi)生菌平均抑菌率，計算公式為：

式（1）中：D1和D2分別為對照菌落和處理菌落直徑，mm。

1.2.2 拮抗菌的促生作用測定

選取消毒處理過的藜麥種子30粒，置于LMJB-14菌懸液中，浸泡4 h后移至無菌培養(yǎng)皿中，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。設(shè)3次重復(fù)，以無菌水浸泡作為對照。統(tǒng)計24 h發(fā)芽情況，計算萌發(fā)率，計算公式為：

式（2）中：L為萌發(fā)種子數(shù)，粒。

1.2.3 藜麥內(nèi)生拮抗細(xì)菌的鑒定

（1）菌落形態(tài)特征。將拮抗細(xì)菌接種在NA平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察內(nèi)生菌的菌落形態(tài)。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]初步鑒定。

（2）分子生物學(xué)鑒定。提取拮抗細(xì)菌基因組總DNA，擴(kuò)增其16S rRNA基因。由艾優(yōu)稷生物科技有限公司（西安）完成測序。將序列提交至GenBank并進(jìn)行BLAST序列比對，用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定拮抗菌株的種屬地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥內(nèi)生細(xì)菌的分離純化及抑菌活性測定

從藜麥中共分離到內(nèi)生細(xì)菌34株，其中3株內(nèi)生細(xì)菌對供試植物病原菌具有抑制活性（圖1）。經(jīng)復(fù)篩，內(nèi)生菌LMJB-14抑菌活性較高（圖2），對炭疽菌、尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌的抑菌率分別為31.2%、23.2%、19.2%。

圖1 初篩抑菌效果

圖2 LMJB-14對常見植物病原真菌的抑菌效果

2.2 菌株LMJB-14對藜麥種子萌發(fā)的影響

菌株LMJB-14菌懸液浸種對藜麥種子的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用（表1），其中，對照組與處理組萌發(fā)率分別為20.13%、50.9%，芽長分別為1.42 cm、1.98 cm，菌懸液浸種后種子萌發(fā)率增加了30.77個百分點。

表1 LMJB-14菌懸液浸種對藜麥種子萌發(fā)率和芽長的影響

2.3 藜麥內(nèi)生拮抗細(xì)菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征

菌株LMJB-14在NA固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不規(guī)則、表面干燥皺褶、淺黃色菌落；革蘭氏染色為陽性，短桿狀含芽孢（圖3）。

圖3 菌株LMJB-14的形態(tài)學(xué)特征

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

將菌株LMJB-14的16S rRNA基因序列提交NCBI后，獲得GenBank登錄號MZ596243，經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)，菌株LMJB-14的16S rRNA基因序列與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）的基因序列同源性達(dá)99%以上，系統(tǒng)發(fā)育樹與貝萊斯芽孢桿菌聚為一支（圖5）。結(jié)合菌株形態(tài)和生理生化特征，將菌株LMJB-14鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖5 菌株LMJB-14的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本研究篩選到藜麥內(nèi)生菌LMJB-14對植物炭疽病病原菌（C. nigrum）、鐮刀菌（F. equiseti）和鏈格孢菌（A. alternata）具有抑菌活性，對3種病原菌的抑菌活性依次減弱；LMJB-14菌懸液浸種對藜麥種子萌發(fā)及胚根生長具有顯著促進(jìn)作用；根據(jù)形態(tài)、生理生化特征，結(jié)合16S rRNA堿基序列和同源性分析，確定菌株LMJB-14為貝萊斯芽孢桿菌。

在植物病害防控方面，貝萊斯芽孢桿菌的生防作用非常突出，能夠有效預(yù)防植物真菌性病害，與植物根際和葉面的共生菌協(xié)同具有促進(jìn)植物生長、抑制病原菌的侵染和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的作用[6]。如沙月霞等[7]從水稻葉片中分離到一株對多種植物病原菌具有拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌，對水稻葉瘟病的田間預(yù)防效果顯著；曾欣等[8]從溫郁金（Curcuma wenyujin）根莖中分離到一株具有拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌B-11，對鐵皮石斛炭疽病具有較強(qiáng)的防治效果；遲惠榮等[9]從多花黃精的根部分離出對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌ZJU-3，對多花黃精具有顯著的促生長作用。

藜麥內(nèi)生菌貝萊斯芽孢桿菌LMJB-14具有抑制3種常見病植物病原真菌和促進(jìn)藜麥種子萌發(fā)的作用，可用于開發(fā)農(nóng)業(yè)生防資源及促生菌劑的研究。