程濤

（安邦（廈門）生物科技有限公司，福建廈門 361028）

對于急性心肌梗死患者，發(fā)病90 min內(nèi)為其最佳的時間窗，由于常規(guī)的心肌標志物檢測需采集血液后送往實驗室進行檢測，此過程往往耗時較長，不利于患者診斷及預(yù)后[1]。熒光層析免疫試劑配合便攜式分析儀器可以進行床旁采樣、現(xiàn)場檢測，此試劑程序簡單、檢測速度快，對于急診科急性胸痛患者的診斷具有重要臨床意義[2]。本研究研制了心肌肌鈣蛋白 I（cTnⅠ）的熒光免疫層析試劑并進行了性能評價，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠抗cTnI單克隆抗體（clon1），珠海博美生物科技有限公司；羊抗cTnI多克隆抗體（clon2），菲鵬生物股份有限公司；熒光微球，200 nm，長沙美牛生物科技有限公司；硝酸纖維素膜，規(guī)格2.5 cm×100 m，默克化工技術(shù)（上海）有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC），純度≥99%，酪蛋白鈉鹽（casein.Na），純度≥95%，購自Sigma公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；塑料卡，規(guī)格2 cm×10 cm，廈門欣海盛塑膠有限公司；玻璃纖維，杭州韓感科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；QB-128型旋轉(zhuǎn)混勻儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TGL-20M型高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HM3230型三維平面點膜噴金儀，上海金標生物科技有限公司；ZQ4200型數(shù)控感應(yīng)斬切機，上海金標生物科技有限公司；AF-100型熒光免疫分析儀，安邦（廈門）生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 包被板制備

把硝酸纖維素膜和吸水紙依次粘貼在PVC板上。用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）將羊抗cTnI多克隆抗體及羊抗兔IgG多抗稀釋至1 mg/mL，以1 μL/cm的包被量包被于硝酸纖維素膜上，在濕度≤30%條件下干燥16～24 h，制備得cTnI包被板備用。

1.3.2 標記物制備

將1 mL熒光微球原液加入到9 mL PBS溶液中，超聲30 s后以18 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，小心去除上清。加入10 mL PBS溶液，超聲60 s，混勻。取0.4 mL的0.6 mg/mL EDC溶液加入到洗滌后的熒光微球溶液中，用旋轉(zhuǎn)混勻儀混勻1 h，離心（18 000 r/min、30 min），小心去除上清。加入10 mL PBS溶液超聲30 s混勻。以0.5 mg/mL蛋白濃度加入鼠抗cTnI單克隆抗體，在旋轉(zhuǎn)混勻儀上混勻2 h。加入1 mL10%的BSA溶液進行封閉，旋轉(zhuǎn)混勻儀上混勻14～18 h。18 000 r/min、離心30 min，小心去除上清，加入10 mL PBS溶液，超聲60 s，標記完成，制得cTnI的標記物2～8 ℃條件下保存。以相同方法制備兔IgG熒光微球標記物。

1.3.3 標記物結(jié)合墊制備

用標記物稀釋液稀釋cTnI標記物和兔IgG標記物，終濃度為0.1 mg/mL，制得標記物噴涂溶液。使用噴金儀以1 μL/cm的噴量把標記物噴涂溶液固定在標記墊上。噴涂后，標記墊放置在濕度≤30%環(huán)境下晾干16～24 h。

1.3.4 樣品墊制備

配制樣品墊處理液，10 mmol/L PBS溶液（pH=7.4）中包含0.3 mg/mL的抗RBC和1%的casein.Na，取40 mL樣品墊處理液加在玻璃纖維上，鋪勻液體后在濕度≤30%環(huán)境下干燥16～24 h。

1.3.5 檢測卡制備

在包被板上依次放置標記物結(jié)合墊和樣品墊。組裝好的檢測板用數(shù)控感應(yīng)斬切機切成4 mm寬的檢測條，將檢測條放在PVC塑料卡里面壓緊，與干燥劑一起放在鋁箔袋中封裝保存。

1.3.6 試劑的定標

把國家標準物質(zhì)和cTnI抗原分別用含有1%BSA的10 mmol/L PBS緩沖液（pH=7.0）稀釋制成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、20.0 ng/mL和50.0 ng/mL 6個濃度點，用檢測卡進行檢測。信號值和濃度值使用四參數(shù)方程進行擬合，得到的標準曲線寫入IC卡中。

1.3.7 試劑檢測方法

血清的加樣量為100 μL，全血的加樣量為120 μL。反應(yīng)15 min后進行讀數(shù)。數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 準確性

用cTnI國家標準品制備的參考品，濃度分別為0.3 ng/mL、10 ng/mL，每個濃度參考品均作為樣本各檢測3孔，檢測3次，檢測0.3 ng/mL參考品平均值0.295 ng/mL，相對偏差-1.67%；檢測10 ng/mL參考品平均值10.38 ng/mL，相對偏差3.8%。

2.2 分析靈敏度

2.2.1 空白限（LoB）的建立

用空白樣本（pH=7.0、10 mmol/L PBS溶液+1%BSA）進行檢測，每天測試2次，每次重復(fù)測定2次，共測定20次。檢測結(jié)果屬于正態(tài)分布，平均值為0.017，標準偏差SD=0.004，空白限LoB=0.024。

2.2.2 檢出限（LoD）的建立

選取5個低濃度樣本，用試劑對各樣本進行重復(fù)檢測，每天檢測5次，連續(xù)檢測3 d，最終得到75個低濃度的結(jié)果，如表1所示。

表1 低值樣本測定結(jié)果（n=15）

根據(jù)檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析：低濃度樣本檢測結(jié)果進行正態(tài)性檢測，P=0.002＜0.05，結(jié)果不呈正態(tài)分布，按非參數(shù)方法估計LoD。取0.07 ng/mL作為試劑的檢出限。

2.3 精密性

取心肌肌鈣蛋白I（cTnI）測定試劑盒（熒光免疫層析法），分別用濃度為0.3 ng/mL、10.0 ng/mL的參考品進行檢測，每天檢測1次，每次每個濃度平行檢測2次，連續(xù)檢測20 d，進行精密度分析；2個濃度參考品檢測結(jié)果的變異系數(shù)分別是7.54%和9.00%。

2.4 特異性

心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、心肌肌鈣蛋白C（cTnC）、骨骼肌型肌鈣蛋白I（sTnI）分別用參考品稀釋液進行稀釋，制備成濃度為1 000 ng/mL的特異性樣本；用試劑分別檢測上述制備樣本，每個樣本平行檢測3次。檢測結(jié)果表明，在1 000 ng/mL濃度條件下，cTnI檢測結(jié)果均＜0.07 ng/mL，未出現(xiàn)非特異反應(yīng)現(xiàn)象。

2.5 干擾試驗

按照1 mL高、中、低濃度樣本+0.1 mL PBS溶液（10 mmol/L、pH=7.0，含1% BSA）的方式制得對照樣本，按照1 mL樣本+0.1 mL干擾物溶液（3 850 μmol/L膽紅素、440 mmol/L甘油三酯、22 g/L血紅蛋白和16 500 IU/mL類風(fēng)濕因子）的方式制得干擾樣本。用檢測試劑分別檢測對照樣本和干擾樣本，計算與對照樣本的相對偏差，結(jié)果見表2。由表2可知，干擾物在實驗濃度條件下不影響樣本檢測結(jié)果。

表2 干擾實驗樣本檢測結(jié)果

2.6 線性范圍

將cTnI抗原用參考品稀釋液進行稀釋，配制成系列濃度點。檢測系列濃度點樣本，每個樣本測試3次，建立標準曲線方程。用該曲線方程計算濃度樣本的測定值，以理論濃度（x）為自變量，以檢測結(jié)果均值（y）為因變量進行線性回歸，繪制出劑量反應(yīng)曲線，確定線性范圍。如圖1所示，試劑線性方程y=1.001 7x-0.003 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。因此，心肌肌鈣蛋白I（cTnI）測定試劑盒（熒光免疫層析法）的線性范圍為0.1～50.0 ng/mL。

圖1 濃度線性圖

2.7 血清、血漿和全血檢測對比

準備好6種不同顏色的真空采血管，用于采集血樣制備血清、抗凝血漿樣本，以紅色采樣管的血清樣本結(jié)果為基準，比較其他血清、血漿樣本對檢測結(jié)果的影響，見表3。準備5組樣本，紅細胞壓積分別為20%～30%、30%～40%、40%～50%、50%～60%及60%～70%。以血漿樣本結(jié)果為基準，比較不同紅細胞壓積全血樣本對檢測結(jié)果的影響，見表4。結(jié)果顯示，紅細胞壓積在30%～50%范圍內(nèi)對檢測結(jié)果與血漿相比無顯著性差異。常規(guī)的促凝劑采血管（橘紅色）、惰性分離膠采血管（黃色）、肝素鈉抗凝劑采血管（綠色）、EDTA-K2抗凝劑采血管（紫色）及枸櫞酸鈉抗凝劑采血管（藍色）檢測結(jié)果與血清管（紅色）一致，不同采血管均不影響試劑的檢測結(jié)果。

表3 血清與血漿樣本檢測結(jié)果

表4 不同紅細胞壓積率全血樣本統(tǒng)計分析結(jié)果

2.8 臨床性能驗證

采用與已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的產(chǎn)品進行同步盲法對比試驗研究，考察考核試劑的臨床應(yīng)用性能與該已上市產(chǎn)品的等效性。104例樣本的檢測結(jié)果見表5。

表5 104例樣本檢測結(jié)果的符合率

Bland-Altman一致性評價[3]：所有的點均在95%一致性界限以內(nèi)；在一致性界限范圍內(nèi)，比值均在0.8～1.2，認為兩種方法具有較好的一致性。

2.9 分段回歸分析

分段回歸分析結(jié)果如圖2、圖3。其中圖2為對比試劑檢測值＜2的回歸分析，圖3為對比試劑檢測值≥2的回歸分析。

圖2 考核試劑與對比試劑測試結(jié)果線性圖（R2=0.971 6）

圖3 考核試劑與對比試劑測試結(jié)果線性圖（R2=0.978 8）

104例血清樣本中，1例樣本對比試劑檢測結(jié)果為陽性，考核試劑檢測結(jié)果為陰性；1例樣本對比試劑檢測結(jié)果為陰性，考核試劑檢測結(jié)果為陽性；該2例樣本兩種試劑檢測結(jié)果均在參考值附近，認為該樣本屬于臨界值樣本。本心肌肌鈣蛋白I（cTnI）測定試劑盒（熒光免疫層析法）與已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的產(chǎn)品的檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，并且具有高度一致性。

3 結(jié)論

近年來，我國急性心肌梗死的發(fā)病率越來越高，且發(fā)病逐漸年輕化。WHO推薦指南將心電圖、cTnI等心肌酶譜檢測視為臨床診斷急性心肌梗死的金標準。在臨床中，縮短急性心肌梗死的診斷時間對于患者預(yù)后具有重要的臨床意義。對研制的cTnI熒光免疫層析試劑進行評價，結(jié)果表明該試劑準確度高，靈敏度好，抗干擾能力強，臨床檢測符合性好，作為化學(xué)發(fā)光試劑和其他同類型試劑的有益補充，可以在急診科急性胸痛患者的診斷中發(fā)揮出重要的臨床價值。