劉月蘋

（1.唐山職業(yè)技術學院，河北唐山 063004；2.沈陽農業(yè)大學 生物科學技術學院，遼寧沈陽 110866）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是引起人類腸胃炎的一種致病菌，常存在于人們食用的貝類產品及魚類中，其主要致病機理是該菌可產生溶血毒素，包括耐熱性溶血毒素（TDH）、耐熱性溶血毒素相關的溶血毒素（TRH）及不耐熱溶血毒素（TLH），其中TDH和TRH是副溶血性弧菌的主要致病因子。近幾年來，副溶血性弧菌已超過沙門氏菌成為危害性最大的食源性病原菌，其引起的食源性致病案例更是呈明顯上升趨勢。因此，研究開發(fā)可快速檢測致病性的副溶血性弧菌的方法至關重要。

傳統(tǒng)檢測方法大多要經過增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學反應等過程，操作時間長，步驟煩瑣，檢出率也較低。宋晶玲[1]利用神奈川試驗與PCR檢測183株O3：K6血清型副溶血性弧菌毒力基因時發(fā)現(xiàn)神奈川試驗存在部分trh基因的漏檢，而采用實時PCR（real-time PCR）、基因芯片與脈沖場電泳（PFGE）等方法檢測副溶血性弧菌的技術含量高，使用設備價格昂貴[2]。

因此，本研究采用種特異性基因tlh和毒力基因trh為模板進行雙重PCR擴增，在確定副溶血性弧菌種屬的基礎上進行trh毒力基因的檢測，同時進行雙重PCR的靈敏度及人工污染靈敏度的檢測，初步建立了準確檢測攜帶致病基因trh的副溶血性弧菌的雙重PCR技術，并且提高了檢測靈敏度和特異性，避免了神奈川試驗假陽性的干擾，節(jié)約時間和材料成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

標準菌株：副溶血性弧菌標準菌株ATCC17802，沈陽農業(yè)大學微生物生化與分子生物學實驗室保存。

試驗菌株：微生物生化與分子生物學實驗室保存的非副溶血性弧菌，包括李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、創(chuàng)傷弧菌、熱帶假絲酵母、傷寒沙門氏菌和芽孢桿菌。

1.1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer和6×Loading Buffer，TAKARA公司；EB，Sigma公司；DL 2 000 marker，上海生工生物工程公司；瓊脂糖，伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司。

UV-10000型凝膠成像儀，驥輝分析儀器(上海)有限公司；T100型PCR儀，美國伯樂公司；721型紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

PCR引物根據文獻設計，由TAKARA公司合成，如表1所示。

表1 tlh和trh基因的引物序列

反應體系：3.75 pmol/μL的tlh引物對各1 μL，3.75 pmol/μL的trh引物對各4 μL，2.5 μL的10×buffer（ 含 Mg2+），2.0 μL 的 2.5 mmol/L 的 dNTP，4 μL的 DNA 模板，0.2 μL 的 Taq酶（5 U/μL），補水至反應體系25 μL。

反應條件：預變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，1 min；退火 55 ℃，1 min；延伸 72 ℃，2 min；循環(huán) 29次；最后一個循環(huán)結束后，72 ℃延伸10 min。雙重PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，經溴化乙錠染色，成像系統(tǒng)成像。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

取4 ℃保存的斜面菌種進行活化，挑取生長菌一環(huán)，接種到盛有50 mL培養(yǎng)基的三角瓶中37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，所用培養(yǎng)基為胰胨肉湯。

1.2.2 模板DNA的提取

取0.6 mL對數期菌懸液與0.6 mL的2×TZ細胞裂解液混勻，使TZ工作濃度為2.0%的Triton X-100，2.5 mg/mL的疊氮化鈉，0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液，pH 8.0。沸水浴10 min后冷卻到室溫，15 000 r/min離心10 min，取上清（含DNA）備用。

1.2.3 PCR體系優(yōu)化及產物分析

在確定了反應體系為25 μL后，通過多次試驗先確定了影響較小的因素：10×Buffer（含Mg2+），2.5 μL；2.5 mmol/L 的 dNTP，2.0 μL；Taq 酶 0.2 μL，DNA模板4 μL。對影響較大的引物濃度和退火溫度進行調試，其中退火溫度調試范圍為在50.8～59.2 ℃；trh和tlh的引物濃度均為3.75 pmol/μL，由于之前做單重PCR檢測時發(fā)現(xiàn)引物trh用量為4 μL時，PCR擴增條帶亮度很亮，所以本試驗采用trh引物用量為4 μL，tlh的引物用量范圍為0.5～4.0 μL。PCR反應條件同1.1.2。

1.2.4 PCR反應特異性檢測

采用TZ法分別提取副溶血性弧菌ATCC17802和7株非副溶血性弧菌的DNA，并利用優(yōu)化的雙重PCR體系進行DNA理論擴增反應與電泳檢測分析。

1.2.5 驗證雙重PCR檢測體系

活化試驗室保存的利用傳統(tǒng)方法從海產品中篩選出的副溶血性弧菌菌株，用雙重PCR進行檢測。

1.2.6 PCR靈敏度檢測[3]

取對數期副溶血性弧菌懸液10 mL，12 000 r/min離心1 min，棄上清，用生理鹽水在8 000 r/min，3 min條件下洗滌2次后，用生理鹽水進行稀釋，測定其600 nm吸光度值，通過標準曲線確定菌濃度為2.0×107CFU/mL，之后用生理鹽水以10倍稀釋法進行梯度稀釋，分別取稀釋菌液0.5 mL抽提DNA進行檢測。

1.2.7 人工模擬樣品檢測

取菌濃度1.45×108CFU/mL的副溶血性弧菌0.5 mL，分別接入經檢測無副溶血性弧菌的5 g碎牡蠣肉、碎蝦肉、碎海鲇魚肉及魚鰓和魚腸中，胰胨肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、160 r/min增菌10 h，抽提DNA進行檢測。

1.2.8 人工污染靈敏度檢測

取經檢測無副溶血性弧菌的黃花魚肉5 g，無菌操作下剪碎，分別放入盛有45 mL胰胨肉湯培養(yǎng)液的9個三角瓶中，取經過生理鹽水稀釋，菌濃度為1.0×108CFU/mL副溶血性弧菌進行10倍梯度稀釋，分別取0.5 mL稀釋液放于三角瓶中，37 ℃、160 r/min培養(yǎng)10 h，從液面取0.5 mL增菌液進行DNA提取，雙重PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 PCR體系優(yōu)化及產物分析

影響PCR擴增反應的因素很多，其中兩個重要參數就是退火溫度和引物濃度[4]。首先利用PCR儀優(yōu)化退火溫度（圖1），在最佳的退火溫度下根據PCR擴增條帶的亮暗調整引物濃度，以便使用較少的引物達到最佳的效果。

圖1 退火溫度優(yōu)化

由圖1可知，退火溫度在50.8～59.2 ℃內，擴增片段為450 bp的條帶亮度都很強，300 bp的條帶亮度隨著退火溫度的降低亮度變強，而降低退火溫度可以提高PCR擴增效率，因此選擇55 ℃為最佳退火溫度。

由圖2可知，在固定trh引物用量、變化tlh引物用量的情況下，擴增片段300 bp的條帶亮度都很弱，引物用量超過1.0 μL后亮度無法滿足檢測要求；而擴增片段為450 bp的條帶亮度隨用量的增加而增加。在3.75 pmol/μL的tlh引物對各1.0 μL，與3.75 pmol/μL的trh引物對各4 μL時，雙重PCR條帶亮度能夠達到檢測標準。

圖2 引物濃度優(yōu)化

2.2 特異性分析

采取TZ法對各種待測菌株進行DNA的抽提，之后分別加入兩種引物進行雙重PCR擴增（圖3）。

圖3 雙重PCR的特異性檢測結果

由圖3可知，利用優(yōu)化的雙重PCR對兩株副溶血性弧菌標準菌株ATCC17802的DNA進行擴增可獲得大小為450 bp和300 bp的兩條清晰的目的條帶，而非副溶血性弧菌沒有特異性條帶產生。說明本試驗建立的PCR檢測體系具有極好的特異性和穩(wěn)定性。

2.3 驗證雙重PCR檢測體系

由圖4可知，雙重PCR方法與傳統(tǒng)方法檢測結果一致。5株經過細菌培養(yǎng)與生化鑒定為副溶血性弧菌的菌株進行雙重PCR檢測，所有菌株均擴增出tlh特異性條帶，而有些副溶血性弧菌還擴增出trh毒力基因。說明tlh可作為PCR鑒定副溶血性弧菌的菌屬特異性基因，該雙重PCR方法能夠準確地鑒定出攜帶trh毒力基因的副溶血性弧菌。

圖4 雙重PCR檢測5株傳統(tǒng)方法檢測出的副溶血性弧菌

2.4 雙重PCR靈敏度分析

濃度為2.0×108CFU/mL的副溶血性弧菌培養(yǎng)液以十倍稀釋法稀釋，進行PCR檢測。擴增條帶的亮度隨著菌液濃度的減小而減弱；菌濃度為2.0×104CFU/mL時，450 bp和300 bp的目的片段都可擴增出來；菌濃度為2.0×103CFU/mL、2.0×102CFU/mL和2.0×10 CFU/mL時，只有條帶亮度很弱的450 bp片段；濃度2.0 CFU/mL時雙重PCR擴增條帶均消失（圖5）。實驗結果表明，雙重PCR對攜帶trh毒力基因的副溶血性弧菌的純菌菌液靈敏度可達到2.0×104CFU/mL，此靈敏度可滿足樣本增菌后的檢測要求。

圖5 雙重PCR的靈敏度分析

2.5 人工污染樣品檢測

取濃度為1.45×108CFU/mL的副溶血性弧菌，接種于盛有5 g碎牡蠣肉、碎蝦肉、碎鲇魚肉及魚鰓和魚腸的三角瓶中，增菌10 h后進行雙重PCR檢測。結果4種樣品都擴增出了特異性條帶（圖6），試驗證明該雙重PCR對海產品中存在的副溶血性弧菌有很好的特異性。同時發(fā)現(xiàn)，4種樣品特異性擴增條帶亮度不一樣，碎魚肉的擴增條帶亮度最亮?？赡苁遣煌．a品營養(yǎng)成分不同，供細菌生長的環(huán)境也不相同，使含相同菌量的海產品在相同的增菌時間內獲得的菌體數不同。

圖6 海產品中雙重PCR檢測結果

2.6 人工污染靈敏度分析

不同菌濃度的副溶血性弧菌污染黃花魚肉后，增菌10 h，雙重PCR檢測結果見圖7。PCR條帶亮度隨著污染用菌濃度的減小而減弱，在1.0×103CFU/mL時，擴增出450 bp和300 bp的目的片段，而小于該菌濃度時，只有450 bp的目的片段且其亮度逐漸減弱至沒有。因此，人工污染試驗中檢測攜帶trh毒力基因副溶血性弧菌的靈敏度為1.0×103CFU/mL，即黃花魚肉中攜帶trh毒力基因的副溶血性弧菌含量為100 CFU/g時，增菌10 h該檢驗方法可檢出。

圖7 人工污染黃花魚肉中雙重PCR靈敏度分析

3 結論

目的基因的選擇對于多重PCR檢測技術的特異性尤為重要，關于副溶血性弧菌目的基因的選擇，很多研究報道采用了不同的基因。強世龍等[5]與岳友宏等[2]采用tlh與tdh基因進行雙重PCR檢測，林佳琪等[6]采用tlh、tdh、tox R、trh基因進行四重PCR檢測。tlh基因作為其種屬鑒定基因是所有副溶血性弧菌都攜帶的，trh基因可用于其trh毒性的鑒定。除了trh基因外，副溶血性弧菌的溶血毒素還包括耐熱性溶血毒素（TDH），也是副溶血性弧菌的主要致病因子，在臨床腹瀉患者分離的副溶血性弧菌菌株中90%以上攜帶tdh和（或）trh基因。但trh基因在其他弧菌中有交叉現(xiàn)象，與其他弧菌存在約93%～96%的同源性[7]，同時在副溶血性弧菌神奈川試驗為陰性時也含有致病基因trh[5]，因此本試驗采用trh基因與種特異性基因tlh設計引物進行雙重PCR的擴增。

在雙重PCR試驗過程中，任何一個條件不符合，都很容易導致出現(xiàn)非特異性的產物或者擴增失敗。退火溫度是影響PCR反應特異性的重要因素之一，較低的退火溫度會使PCR擴增產物濃度增高，增大引物與模板錯配機會，出現(xiàn)非特異性擴增，造成涂抹帶或者片狀帶。較高的退火溫度，會使PCR擴增產物濃度降低，可能導致假陰性結果[4]。同時，引物濃度對雙重PCR擴增也有較大的影響，PCR反應中，引物一般最適濃度為0.1～1.0 mol/L[8]。過低的引物濃度會導致PCR擴增無法完成30個循環(huán)，使擴增產物產量降低；過高的引物濃度會導致非特異性擴增，在電泳結果中出現(xiàn)雜帶[4]。針對這些情況，本研究通過多次試驗確定退火溫度為55 ℃，tlh引物濃度為1.875～14.000 μmol/L，trh引物濃度為14.000 μmol/L，比一般的單重PCR所用引物濃度要低。試驗中沒有形成大量的引物二聚體，擴增效果極好，建立了穩(wěn)定的雙重PCR反應體系。

本研究人工污染靈敏度為1.0×103CFU/mL，與純菌菌液靈敏度相比要高，分析原因可能是黃花魚肉的主要成分蛋白大大促進副溶血性弧菌的生長。通過計算，此雙重PCR檢測污染黃花魚肉樣品檢出限為100 CFU/g，比強世龍[5]報道的雙重PCR檢測模擬污染紅螺樣品檢出限10 CFU/g要低一個數量級。