高雨潔

（成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，四川成都 610500）

骨缺損是口腔種植領(lǐng)域始終面臨的一大困境。諸多長期缺牙患者或者外傷患者常常面臨骨高度或骨寬度不足的情況，骨量不足限制了種植修復(fù)的美學(xué)與功能恢復(fù)，且不利于種植材料的長期穩(wěn)定性。為了解決骨量不足的問題，臨床上最常見的解決方式是進(jìn)行GBR骨增量手術(shù)，其原理是在骨缺損區(qū)域放置骨再生材料，隨后在軟硬組織之間放置屏障膜并關(guān)閉軟組織切口。屏障膜作為骨再生領(lǐng)域常用的生物材料，具備阻隔軟組織并維持成骨空間的能力。理想的屏障膜還應(yīng)具備促進(jìn)成骨分化的功能，提升骨缺損區(qū)域?qū)嶋H成骨效果。

在諸多生物材料中，Ti3C2Tx是一類新型二維納米材料，具有高比表面積及活性基團(tuán)，包含多種過渡金屬碳化物、氮化物及金屬導(dǎo)電性碳氮化物，具有親水性和良好的機(jī)械性能，在生物工程領(lǐng)域逐漸受到研究者的關(guān)注[1]。還有一種經(jīng)典的化合物引起了研究者的注意，CaCO3中的鈣元素是天然骨組織中的重要組分，由于具有良好的生物活性、生物相容性、骨傳導(dǎo)性和高表面活性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于骨組織工程生物材料領(lǐng)域[2]。因此，本研究探索Ti3C2Tx與CaCO3共同構(gòu)建一類新型屏障膜，兼?zhèn)錂C(jī)械強(qiáng)度與成骨活性，既可以阻止軟組織侵入成骨空間，還可誘導(dǎo)骨缺損區(qū)域前成骨細(xì)胞的成骨分化，提升骨增量手術(shù)的可預(yù)期性，增加成骨速度及成骨效率。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜，通過掃描電子顯微鏡觀測微觀形貌，并進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖率及堿性磷酸酶活性，分析該材料的生物相容性與成骨活性，探究Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜在骨再生生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

Ti3AlC2，98%，吉林11科技有限公司；氟化鋰，98%，Sigma；37%濃鹽酸和氯化鈣，分析純，國藥集團(tuán)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液，Gibco公司；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒、Hoechst 33342染色劑、RIPA裂解液、堿性磷酸酶試劑盒和BCA蛋白試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛，Biosharp公司；Triton X100、地塞米松、β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸，Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

GM-0.33A型真空抽濾泵，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RCTbasic型恒溫磁力攪拌器，德國IKA公司；Micro17R型臺式高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；5702型臺式低速離心機(jī)，德國艾本德公司；ME54T/02型電子分析天平，梅特勒托利多公司；Milli-Q型超純水機(jī)，德國默克公司；SU6200型掃描電子顯微鏡，日本日立有限公司；Varioskan LUX型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Ti3C2Tx-CaCO3的制備

將0.8 g氟化鋰與20 mL鹽酸（9 mol/L）混合于聚四氟乙烯瓶中，加入1 g的Ti3AlC2粉末，使用恒溫磁力攪拌器，使混合液在35 ℃連續(xù)反應(yīng)48 h。將反應(yīng)液放入離心機(jī)中，使用去離子水多次離心洗滌（3 500 r/min，每次15 min），直至上清液pH＞6，收集黑色沉淀層（Ti3C2Tx）并重懸于去離子水中。加入CaCl2，使用磁力攪拌器混合均勻，使Ca2+結(jié)合于Ti3C2Tx片層表面。向混合液內(nèi)通入CO2，得到Ti3C2Tx-CaCO3混合分散液。使用真空過濾設(shè)備抽濾得到Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜。放入真空干燥罐中自然干燥24 h，復(fù)合膜可從濾膜表面揭下。

1.3.2 Ti3C2Tx-CaCO3的表征

Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜的表面和橫截面形貌采用掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)行觀察。將復(fù)合膜裁剪成適當(dāng)大小，充分干燥，噴金后使用掃描電鏡進(jìn)行表面微觀形貌觀察。將復(fù)合膜進(jìn)行液氮脆斷處理，保持橫截面完整性，充分干燥，噴金后使用掃描電鏡進(jìn)行橫截面微觀形貌觀察。

1.3.3 生物相容性檢測

將小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1以細(xì)胞密度1×104個(gè)/孔分別接種于細(xì)胞爬片及復(fù)合膜上，在溫度為37 ℃，5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)24 h。隨后將細(xì)胞和EdU共培養(yǎng)2 h。使用4%多聚甲醛室溫固定15 min。 使 用 0.1% Triton X-100 通 透 15 min。 通過30 min的點(diǎn)擊反應(yīng)使EdU標(biāo)記熒光染料。使用Hoechst 33342染色細(xì)胞核。將樣本放置在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。每組隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域，統(tǒng)計(jì)EdU陽性（呈綠色）的細(xì)胞數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)量（呈藍(lán)色），EdU陽性率=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3.4 成骨活性檢測

將小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1以細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔分別接種于細(xì)胞爬片及復(fù)合膜上，在溫度為37 ℃，5% CO2伴成骨誘導(dǎo)液的環(huán)境下分別培養(yǎng)4天和7天。到相應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)后，吸去培養(yǎng)基并加入RAPI裂解液，以15 000×g離心12 min以收取總蛋白。首先使用堿性磷酸酶試劑盒，與樣本反應(yīng)后使用酶標(biāo)儀測定405 nm處吸光度。接著使用BCA蛋白檢測試劑盒，使用酶標(biāo)儀測定562 nm處吸光度，定量樣品蛋白總量。最終根據(jù)酶活性的定義，計(jì)算得到堿性磷酸酶活性值。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphpad Prism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及作圖處理。開展正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn)，組間比較使用單因素方差分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，****表示P＜0.0001。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料的制備與表征

如圖1所示，最終得到的復(fù)合膜材料呈完整膜片狀，整體外觀灰黑色，復(fù)合膜的伸展性及柔韌性均較良好。使用掃描電子顯微鏡對復(fù)合膜表面及橫截面進(jìn)行微觀觀察，可見表面主要為數(shù)百納米的二維片層Ti3C2Tx納米片堆疊，橫截面由球狀CaCO3穿插于Ti3C2Tx片層結(jié)構(gòu)之間，共同構(gòu)成統(tǒng)一整體。其中，CaCO3微球在片層表面及片層之間分布均勻，大小亦相對均一。研究顯示，Ti3C2Tx表面存在多個(gè)可負(fù)載其他物質(zhì)的錨定位點(diǎn)。該復(fù)合雜化材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具備應(yīng)用潛力。

圖1 Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜外觀形貌圖

2.2 材料的生物相容性

通過EdU試劑盒檢測小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1與復(fù)合膜材料共培養(yǎng)后的細(xì)胞增殖能力，評價(jià)Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜的生物相容性，對于指導(dǎo)該材料的應(yīng)用前景具有基礎(chǔ)意義。由圖2可知，復(fù)合膜組的細(xì)胞具有更高的細(xì)胞增殖活性，提示該復(fù)合膜材料具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。這是由于Ti3C2Tx的組成元素主要為C與Ti，C元素是生物有機(jī)體中不可或缺的元素成分，而Ti對生物有機(jī)體呈現(xiàn)相對惰性的狀態(tài)，這意味著Ti3C2Tx在生物體內(nèi)相對穩(wěn)定[3]。而CaCO3早已作為補(bǔ)鈣劑的成分之一應(yīng)用于臨床，同樣具有良好的生物相容性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該材料整體無明顯細(xì)胞毒性，是生物材料實(shí)際應(yīng)用的重要前提。

圖2 Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜促細(xì)胞增殖活性

總體而言，Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜具有良好的生物相容性，并具備促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞增殖的能力，這一結(jié)果提示該材料具備在骨再生領(lǐng)域應(yīng)用的潛力和價(jià)值。

2.3 材料的成骨活性

通過堿性磷酸酶試劑盒檢測Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜對小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1的誘導(dǎo)成骨能力，分析該材料在骨再生組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。如圖3所示，與對照組相比，復(fù)合膜組在第4天和第7天的堿性磷酸酶活性均有顯著提高。

圖3 Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜成骨活性

堿性磷酸酶（ALP）是硬組織的重要組成成分，也是細(xì)胞成骨分化的標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)證明Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜具有明確的促進(jìn)成骨分化功能，這與Ti3C2Tx表面具有豐富錨定位點(diǎn)以便于附著成骨誘導(dǎo)液中相關(guān)物質(zhì)有關(guān)[4]，也與CaCO3固有的成骨刺激途徑相關(guān)[5]。這一結(jié)果確定了該材料的成骨活性，意味著使用該材料作為屏障膜不僅可以起到屏障隔離作用以防止軟組織長入，還可以促進(jìn)骨組織的快速形成，利于骨缺損區(qū)域的恢復(fù)，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的Ti3C2Tx-CaCO3復(fù)合膜由Ti3C2Tx納米片夾層球狀CaCO3所構(gòu)成，具有良好的生物相容性，可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，該材料可提高堿性磷酸酶活性，具有促進(jìn)成骨分化的能力，是可應(yīng)用于骨再生工程的新型生物材料。